常用试剂培养基 毕赤酵母实验技术.docx
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常用试剂培养基毕赤酵母实验技术
10×YNB(
13.4%酵母氮源,含硫酸铵不含氨基酸):
溶解
13.4gYNB于100mL水中,过滤除菌,加热至YNB完全溶解,存于4℃。
500×B(
0.02%生物素):
溶解20mg生物素于100mL水中,过滤除菌,放于4℃。
100×AA(
0.5%各种氨基酸):
溶解各50mgL-谷氨酸,L-蛋氨酸,L-赖氨酸,L-亮氨酸,L-异亮氨酸于100mL
水中,过滤除菌,存于4℃。
10×D(20%葡萄糖):
溶解200gD-葡萄糖于1000mL水中,高压灭菌15min或过滤除菌,可放1
年。
500×生物素(
0.02%):
溶解20mg生物素于100mL水中,过滤除菌,放于4℃,可放1年。
100×H(
0.4%组氨酸):
溶解400mgL-组氨酸于100mL水中,低于50度加热以促溶解,过滤除菌,
可放1年。
10×M(5%甲醇):
混合5mL甲醇与95mL水,过滤除菌存于4℃,可放2个月。
10×GY(10%甘油):
混合100mL甘油与900mL水,过滤或高压灭菌,室温放置,可存放1年
以上。
100×AA(
0.5%各种氨基酸):
溶解各50mgL-谷氨酸,L-蛋氨酸,L-赖氨酸,L-亮氨酸,L-异亮氨酸于100mL
水中,过滤除菌,存于4℃,可放1年。
1mol/L磷酸钾缓冲液pH
6.0:
32mL1mol/LK2HPO4,868mL1mol/LKH2PO4,调整pH值为
6.0±
0.1(如
果需调pH值,用磷酸或KOH)。
过滤或高压灭菌,室温下可放1年以上。
100mg/mL遗传霉素:
用无菌水制备30mL100mg/mL遗传霉素贮存液,过滤除菌,存于-20℃。
用来制备含不同终浓度遗传霉素平板:
0.25,
0.5,
0.75,
1.0,
1.5,
1.75,
2.0,
3.0,
4.0。
5%酵母提取物,10%胰蛋白陈,10%NaCI,pH
7.0;高压灭菌后4℃保存。
LB平板培养基
在LB液体培养基中加入琼脂粉15g,高压灭菌,冷却至45℃左右时倒平皿,4℃保存。
LA平板培养基
待LB液体培养基冷却至45℃左右加入Amp(100μg/mL),摇匀后倒平皿,4℃保存。
YPD培养基:
1%酵母提取物,2%胰蛋白膝,2%葡萄糖;RDB
转化固体培养基:
(RegenerationDextroseMedium+Histidine)(lmol/L山梨醇,l%葡萄糖,
1.34%YeastNitrogenBasewithAmmoniumSulfatewithaminoacids(YNB),
0.004%Biotin,
0.005%谷氨酸,
0.005%甲硫氨酸,
0.005%赖氨酸,
0.005%亮氨酸,
0.005%异亮氨酸,
1.5%xx;)100mL:
超纯水80ml,山梨醇18g(186g/L),琼脂糖2g(20g/L)121℃灭菌20分钟,待温度将至60℃以后,在超净台内加入10*YNB10ml,10*D(20%葡萄糖)10ml,500*B(
0.02%生物素)
0.2ml100*AA(含每种氨基酸
0.5%)1ml.混匀,倒平板。
YPD-遗传霉素平板:
1%酵母浸出物,2%蛋白胨,2%葡萄糖,2%不同量的遗传霉素
4.0,250mL(8-10个遗传霉素平板)。
取1gG418溶于1ml1M的HEPES液或PBS中,加蒸馏水至10ml,过滤消毒,4度保存。
具体方法如下:
1g包装的G418瓶子中,加入10mlHEPES溶液,浓度为100mg/ml完全溶解后,
0.22um过滤,-20度保存。
HEPES缓冲液配方如下:
90ml水中,
0.8gNaCl,
0.037gKCl,
0.0135gNa2HPO
4.2H2O,
0.1g葡萄糖,
0.5gHEPES,溶解,NaOH调PH至
7.05,定容至100ml。
0.50mg/ml,
0.75mg/ml,
1.0mg/ml,
2.0mg/ml,
4.0mg/ml五个梯度MD:
选择培养基:
(MinimalDextroseMedium+Histidine)(
1.34%YNB,
0.004%Biotin,2%葡萄糖,
1.5%琼脂;)待温度将至60℃以后,在超净台内加入10*YNB10ml,10*D(20%葡萄糖)
10ml,500*B(
0.02%生物素)
0.2ml,混匀,倒平板。
MM:
选择培养基:
(MinimalMethanol+Histidine)(
1.34%YNB,
0.004%Biotin,
0.05%甲醇,
1.5%xx;)
100mL:
向90mL超纯水中加入琼脂糖2g(20g/L),121℃灭菌20分钟,
待温度将至60℃以后,在超净台内加入10*YNB10ml,,500*B(
0.02%生物
素)
0.2ml,5mL甲醇混匀,倒平板。
BMGY:
(1%酵母提取物,2%蛋白陈,100mmol/L磷酸缓冲液(pH
6.0),
1.34%YNB,
0.004%Biotin,l%甘油(V/V);)
1L:
酵母提取物10g/L,蛋白胨20g/L,K2HPO43g/L,KH2PO
411.8G/L,
超纯水890Ml,121℃灭菌20分钟,待温度将至60℃以后,在超净
台内加入10*YNB100ml,500*B(
0.02%生物素)1ml,甘油10mL。
BMMY:
0.5%甲醇代替
甘油,其余成分与BMGY相同。
1L:
酵母提取物10g/L,蛋白胨20g/L,K2HPO43g/L,KH2PO4
11.8G/L,超纯水895Ml,121℃灭菌20分钟,待温度将至60℃以后,在
超净台内加入10*YNB100ml,500*B(
0.02%生物素)1ml,5mL甲醇。
主要溶液
2*SDS样品缓冲液:
25mL4*Tris•HCl,PH
6.8(
0.lmol/L)20mL甘油[20%(w/v)]
4gSDS[4%(w/v)]2mL2-巯基乙醇或
3.1gDTT
1mg溴酚兰[
0.001%(w/v)]
加蒸馏水至l00mL并混匀,等量分装成lmL于-70℃贮存。
5*SDS电泳缓冲液:
15.lgTris碱(
0.125mol/L)
72.0g甘氨酸(
0.96mol/L)
5.0gSDS[
0.5%(w/v)]
使用前稀释至1XSDS电泳缓冲液,贮存液不必调教pH值,稀释后溶液pH
8.3,考xxxx染色
固定液:
50%(v/v)甲醇10%(v/v)乙酸40%重蒸水染色液:
50%(v/v)甲醇
0.05%(v/v)考马斯亮兰R-25040%重蒸水10%(v/v)乙酸配制时先用甲醇溶解考马斯亮兰,再加入乙酸和水。
溶液可保存6个月,若出现沉淀,滤除即可。
脱色液:
7%(v/v)乙酸5%(v/v)甲醇88%重蒸水
一、大肠制备感受态细胞需灭菌的设备大离心管:
小离心管:
50ml大枪头5mlLB培养基:
10%甘油1挑单个大肠接入LB液体培养基,培养过夜37℃摇床,并做抗性对照。
2以1:
100比例接菌,进行大摇(2ml接入200ml培养基中37℃摇床)3OD达到
0.5-
0.7时,冰上放置20min。
4℃离心,4000g,15min.弃上清,不溜残余4加入等体积的10%甘油轻轻重悬。
4℃离心,4000g,15min.弃上清,不溜残余5加入体积的10%甘油轻轻重悬。
4℃离心,4000g,15min.弃上清,不溜残余
6加入体积的10%甘油轻轻重悬。
4℃离心,4000g,15min.弃上清,不溜残余
7加入适量灭菌10%甘油,一般500ml菌液加入2ml甘油,重悬,8分装,每管40ul,先冻与液氮,然后放入-80℃保存
二、毕赤酵母GS115电转化感受态的制备
1.在含5mLYPD的50mL离心管中,培养P.pastoris,30℃过夜;
2.取
0.1-
0.5mL过夜培养物,接种含50mL新鲜培养基的摇瓶,过夜生长至OD
600=1.3-
1.5;
3.在4℃,1500r/min离心5min收集细胞,用5mL预冷的灭菌水悬浮细胞;
4.如上离心,用5mL预冷的灭菌水悬浮细胞;
5.如上离心,用2mL预冷的1mol/L山梨醇悬浮细胞;
6.如上离心,用1mL预冷的1mol/L山梨醇悬浮细胞,至终体积约
1.5mL(可
冻存80μL等量的电感受态细胞,但转化效率会下降很多)。
三、xx酵母电转化
1.取80μL上述细胞与5-10μL经S线性化DNA(约5-20ug)混合,转入预冷的
0.2cm电转杯中;
2.在冰上放置5min;
3.根据所使用装置推荐的S.cerivisiae参数进行电击(1500V,5ms);
4.立即加入1mL预冷的1mol/L山梨醇至杯中,将内容物转移至灭菌离心管中;
5.分成200-600μL等份,涂于RDB平板上,进行His营养缺陷筛选;
6.在30℃孵育平板3-5d,至His+克隆产生。
四.G418筛选多拷贝基因
1)取出长有克隆的3块板,可考虑先挑10-20个菌落先表达;
2)第一块加入2ml灭菌的ddH
2o,用涂布棒打匀,洗后,菌液吸入第二块;
3)第二块加入1ml,洗之,吸入第三块;
4)菌液吸入EP管,可适量补充ddH
2o;
5)混匀后取适量稀释约50倍,4ul×50=200ul每块G418板,G418浓度从
0.25-4.0mg/ml各一块;
6)注意涂布均匀,可适量补充ddH
2o,
7)300C烘箱培养,2-5day,其余菌液可40C保存
注:
a)手册推荐方法:
第4)步将菌液转入EP管中,振荡5-10秒,用分光光度计布~105cells;注意agar的存在会干扰分光光度计的读数。
五.表达:
1)从G418板挑单克隆入4ml/管MGY接种,300C,250rpm,2天左右至OD=2-6,颜色乳白;2)取1ml菌液于EP管中保种,余3ml菌液离心,1500g,5min,菌体换3mlBMMY,加千分之五甲醇,300ul/管;3)每隔24小时加千分之五甲醇;4)至表达之日起2天后每天取样80ul,留作电泳分析;5)表达4天结束,1500g离心,5min,分别收集上清和沉淀;6)上清用作蛋白分析,跑SDS-PAGE电泳,WesternBlotting分析,ELISA分析,样品浓缩,纯化分析等
六.质粒提取(碱裂解)
(1)溶液I:
50mmol/L葡萄糖,25mmol/LTris-HCl(pH
8.0),10mmol/LEDTA(pH
8.0),配制200ml。
取葡萄糖(C
6H
12O
6.H
2O)
1.982g,双蒸去离子水160ml,
0.5mol/LEDTA4ml,1mol/LTris-HCl(pH
8.0)5ml,定容至200ml,高压灭菌后4℃保存。
(2)溶液II:
0.2mol/LNaOH,1%SDS。
配制100ml,现用现配。
10mol/LNaOH2ml,双蒸去离子水80ml,10%SDS10ml,最后用双蒸去离子水定容至100ml,室温保存。
(3)溶液III:
配制100ml。
5mol/L乙酸钾60ml,冰乙酸
11.5ml,双蒸去离子水
28.5ml。
(4)5mol/L乙酸钾(200ml)乙酸钾
98.14g,溶解于160ml双蒸去离子水中,搅拌溶解后定容至200ml。
(5)3mol/L乙酸钠(NaAc)(pH
5.2)取乙酸钠(CH
3COONa.3H
2O)
204.1g,溶解于200ml双蒸去离子水中,用冰乙酸调pH
5.2,双蒸去离子水定容至500ml,高压灭菌后4℃保存。
(6)10mol/LNaOH溶液(100ml)NaOH晶体40g,加水至100ml。
称取SDS10g,溶解于80ml水中,68℃助溶,加数滴1mol/LHCl调pH
7.2,定
容至100ml。
(8)
0.5mol/LEDTA(pH
8.0)(100ml)。
Na
2EDT
A.2H
2O
18.61g,H
2O70ml,边搅拌边加入NaOH固体调节pH,接近pH
8.0
时才充分溶解,大约需NaOH2g。
最后加水至100ml。
2、质粒的提取
(1)吸取
1.5毫升菌液至
1.5mlEppendorf离心管中,3000rpm离心3分钟,
弃上清液。
(2)加上
1.5毫升菌液,重复操作(1)。
(3)用移液器尽可能除去上清液,加入预冷150微升溶液I,震荡。
(4)加入200微升溶液Ⅱ,缓慢地上下翻转离心管约10次,勿震,混合均匀。
室温下放置5分钟。
(5)加入150微升溶液Ⅲ,上下翻转离心管约10次,混合均匀,冰浴10分钟。
4℃,12,000rpm离心5分钟。
(6)用移液器将上清液转移到新的
1.5mlEppendorf离心管中,加入1倍体积
(400微升)异丙醇抽提,12000rpm离心5分钟。
(7)弃上清,加入1ml70%乙醇洗涤沉淀一次,离心5-10min
(8)弃上清,烘干10min。
(9)加20微升TE缓冲液(含20ul/mlRNase)溶解DNA沉淀,37℃半小时,-20℃
保存。
1.pPIC9K+pulluGene(histag)——GS115(His缺陷筛)——G418筛——GS115-Pullu——酶活性鉴定
2.pulluGene分析——选择tRNAGenes——设计引物以GS115基因组为模板PCR——tRNAGenes
3.pFLDa+tRNAGenes——GS115-Pullu(zeocin筛)——GS115-Pullu-plus——酶活鉴定——表达量比较
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