转pGH基因猪的F3代的生长性能的研究.docx
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转pGH基因猪的F3代的生长性能的研究
分类号密级
UDC单位代码
硕士学位论文
转pGH基因猪的F3代的生长性能的研究
StudyonProductionPerformanceoftheF3GenerationpGHGenesTransgenicPigs
研究生姓名周云
指导教师张廷荣教授
第二导师徐云华高级畜牧师
学科专业农业推广硕士
研究方向养殖
中国·青岛
二0一五年月
StudyonProductionPerformanceoftheF3GenerationpGHGenesTransgenicPigs
Thesissubmittedto
QingdaoAgriculturalUniversity
InFulfillmentoftheRequirement
fortheDegreeof
MasterofAgronomy
WangYousheng
(CollegeofAnimalScienceandTechnology)
Supervisor:
ZhangTingrong
Qingdao.China
June,2015
独创性声明
本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。
尽我所知,除了文中特别加以标注和致谢的地方外,论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果,也不包含为获得青岛农业大学或其它教育机构的学位或证书而使用过的材料。
与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示了谢意。
研究生签名:
时间:
年月日
关于论文使用授权的说明
本人完全了解青岛农业大学有关保留、使用学位论文的规定,即:
学校有权保留送交论文的复印件和磁盘,允许论文被查阅和借阅,可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。
同意青岛农业大学可以用不同方式在不同媒体上发表、传播学位论文的全部或部分内容。
(保密的学位论文在解密后应遵守此协议)
研究生签名:
时间:
年月日
导师签名:
时间:
年月日
转pGH基因猪的F3代的生长性能的研究
摘要
为了探讨转pGH基因猪的外源pGH基因是否在F3代猪中的稳定遗传表达及其对F3代转基因猪生产性能的影响,探究转基因猪的实际生产效果,实验选择4头F2代转pGH基因母猪及其所生产5窝53头F3代健康仔猪,鉴定F3代仔猪的阳性率并测定其生产性能,同时对四头F2代母猪的产仔、泌乳情况进行测定分析,结果如下:
1.4头F2代转基因母猪5窝共产60头仔猪,其中健仔53头,弱仔4头,死胎3头,健仔率达88.33%。
对全部60头仔猪进行耳组织DNA提取,通过PCR及测序检测,结果23头健仔1头死胎为转基因阳性猪,阳性率达40%。
2.通过对F3代猪的生长速度,平均日增重,体尺发育等生产性能进行测定,通过转基因猪与非转基因猪同窝之间对比及总体之间对比发现,F3代转基因猪与非转基因猪在生产性能上有所提高,其结果如下:
(1).F3代猪中转基因猪全期平均日增重比非转基因猪高4.57%,其中在4到5月龄阶段转基因猪ADG达927.1g/d,比非转基因猪ADG提高8.39%;
(2).转基因猪达到100kg体重日龄为169天而非转基因猪需要172.5天。
(3).F3代猪六月龄体尺比较:
转基因猪体长、胸围、臀围均大于非转基因猪,其中臀围差异性显著(p<0.05),转基因猪体高小于非转基因猪但差异不显著。
(4).100kg体重时,转基因猪的背膘厚度小于非转基因猪,眼肌面积大于非转基因猪。
3.F2代转基因母猪与F1代相比平均产仔数相同都为平均每窝12头,F2代转基因母猪的健仔数、平均窝重及泌乳力比F1代母猪有所提高,但差异不显著。
关键词:
pGH;转基因猪;F3代;生产性能
StudyonProductionPerformanceoftheF3GenerationpGHGenesTransgenicPigs
Abstract
InordertoreseachtheexogenouspGHgenewhetherstablyinheritanceandexpressionintheF3generationpigs,theinfluenceofproductionperformance,explorethepracticalproductionofgenerationpigs.Thestudychose4F2generationsowsandtheir53healthypigletsinF3generation,evaluatedtheirpositive,determinedtheirproductionperformance.Alsoanalysisthebreedingofthe4transgenicsows.Resultsareasfollows:
1.FourF2generationtransgenicsowsweredelivery5litterofpigletsandget60pigs,53ofthemarehealth,4ofthemareweakand3ofthemstillbirth.Thehealtharerate88.33%.Extractedallofthe60piglets’DNA,throughdetectionmethodofPCRdetectionandsequencing,weconfirm23healthpigsand1stillbirtharepositivetransgenicpigs,thepositiveisrate40%.
2.ResearchproductionperformanceoftheF3generationpigs,includingthegrowthrate,theADG,thebody-sizeetc.Contrastthetransgenicpigswiththesamelitterandothers,wefoundthattheF3generationpGHgenestransgenicpigswerebetterthannon-transgenicpigs.Resultsareasfollows:
(1).Duringthegrowthperiodthetransgenicpigs’ADGishigherby4.57%thannon-transgenicpigs.Especially4monthageto5monthage,theADGoftransgenicpigsreachto927.1/d,moreby8.39%thannon-transgenicpigs.
(2).Thetransgenicpigsachieveto100kgneed169daysbutthenon-transgenicpigsneed172.5days.
(3).Thecontrastofbody-sizebetweentheF3generationpigs,theSVL,thechestandthehiplineoftransgenicpigsisbetterthannon-transgenicpigs.Especiallythehiplineissignificantdifferent(p<0.05).Thenon-transgenicpigsarehigherthantransgenicpigsbutnotsignificant.
(4).Whenthepigswerereachedto100kg,theback-fatoftransgenicpigsisthinnerthannon-transgenicpigsbuttheloineyemuscleareaisbiggerthannon-transgenicpigs.
3.ThenumberofbornissamebetweenF1generationsowsandF2generationsows.ButcomparewithF1generationsows,theF2generationsowsisbetteronthesideofhealthpiglets,theaveragelitterweightandmilkability,butnotSignificant.
Keyword:
pGH;transgenicpigs;F3generation;Productionperformance
目录
前言1
第一章文献综述2
1.转基因猪的研究进展2
1.1转基因猪的研究历史与现状2
1.2转基因猪的制备3
1.2.1精子载体法3
1.2.2显微注射法3
1.2.3逆转录病毒感染法4
1.2.4体细胞核移植技术5
1.2.5胚胎干细胞介导法5
1.2.6徒手克隆法6
1.3转基因猪的应用6
1.3.1提高动物生产性能7
1.3.2改善肉质7
1.3.3提高动物的抗病能力7
1.3.4研究人类疾病的动物模型8
1.3.5动物生物反应器8
1.3.5移植器官供体8
1.4转基因猪的发展前景9
2.猪生长激素的研究概况9
2.1pGH基因的结构特点9
2.2猪生长激素基因调控机理和生理作用9
2.2.1猪生长激素的直接作用10
2.2.2猪生长激素的间接作用10
2.3猪生长激素基因的应用及前景10
第二章转基因猪的F3代猪阳性鉴定11
1试验材料11
1.1试验主要仪器11
1.2试验主要试剂11
1.3主要试剂的配制12
1.3.1DNA的提取所用试剂的配制12
1.3.2电泳所用试剂的配置12
2.1绿色荧光蛋白表达的检测13
2.2组织DNA的提取及检测13
2.2.1样品组织的采取13
2.2.2样品组织DNA的提取13
2.2.3DNA质量的检测14
2.3PCR及产物初步鉴定14
2.3.2PCR反应体系及反应条件15
2.3.3电泳16
2.4PCR产物的纯化16
2.5目的片段与载体的连接16
2.6重组质粒的转化17
2.7阳性克隆的筛选17
3.4转基因F3代仔猪测序结果19
4讨论19
4.1DNA提取纯度的影响因素19
4.1.1样本的保存20
4.1.2操作过程20
4.2外源基因整合及表达检测的方法20
4.2.1PCR扩增法21
4.2.2序列分析21
第三章转基因猪的F3代猪生产性能研究22
1试验材料22
1.1试验猪的选择22
1.2实验地点22
1.3试验时间22
1.4试验用饲料的营养标准22
1.5实验仪器23
2试验方法与内容23
2.1生长发育的测定23
2.1.1体重的测量23
2.1.2体尺指标的测定23
2.1.3达到100kg体重的校正日龄24
2.1.4转基因猪活体背膘厚度的测定24
2.2转基因猪的F2代母猪的繁殖性能测定24
3.1转基因猪的F3代猪生长发育分析25
3.1.1五窝试验猪同期同批生长发育分析25
3.1.2F3代的转基因猪与非转基因猪生长分析27
3.2F3代猪活体背膘厚与眼肌面积比较分析31
3.3转基因母猪繁殖性能分析32
3.3.1产仔性能的分析32
3.4.2泌乳力分析33
4讨论33
结论35
参考文献36
英文缩写词表41
导师组意见41
致谢41
前言
猪肉是我国主要的消费动物肉类之一,随着经济的发展,人们对猪肉的需求量也越来越高,养猪业在我国畜牧产业中的地位也日益提高。
随着中国梦的提出,安全、环保、高效的健康养猪业成为行业发展的目标和要求。
动物转基因技术能够在遗传基础上对猪的生产性能、肉质品质、抗病性进行改良,对促进健康养猪业发展提高、经济效益有着积极作用。
动物转基因技术就是将外源的自然基因或人为改造后基因通过分子生物学技术整合到宿主基因组中使外源基因能够在宿主体内成功表达并稳定地遗传给后代。
转基因技术突破了物种间的生殖隔离,实现了不同物种间的遗传物质交换和重组,明显的缩短了育种年限。
通过动物转基因技术可以定向的改良和培育猪新品种,例如将菠菜根部的FADZ基因转移到猪体内培育出体内不饱和脂肪酸含量高的FADZ转基因猪、将植酸酶基因转移到猪唾液腺中的植酸酶转基因猪。
利用转基因技术生产供人体器官移植的供体转基因猪,也可以用转基因猪作为生物反应器生产医用蛋白等。
本研究就通过对转基因猪的F3代猪进行阳性鉴定及生产性能测定来探讨外源pGH基因的遗传稳定性和对F3代转基因猪生产性能的影响。
同时对四头F2代母猪的产仔、泌乳情况等繁殖性状进行测定分析并与F1代转基因母猪进行对比,分析转pGH基因在传代后对母猪繁殖性能的影响。
这可以为以后研究转基因猪的遗传稳定性及生产性能的研究提供依据。
第一章文献综述
随着科学的进步技术的发展,以转基因技术的为核心的农业生物技术发展迅速。
转基因技术在农业方面广泛应用于植物育种,提高抗病虫害能力等,截止2015年,全球转基因作物种植面积已经达到1.8亿hm2[1]。
转基因技术在动物方面也有广泛的应用,动物转基因技术是指通过基因工程将体外重组的基因结构或者外源基因片段导入动物体内,使其在动物体内进行整合和表达,产生新的性状。
动物转基因技术已经运用到生命学科的各个领域,运用转基因技术可以加快动物品种的改良周期,突破物种隔离,带来明显的经济效益,促进畜牧业的迅速发展,通过动物转基因技术可以生产药用蛋白和干细胞治疗人类疾病。
猪肉是我国主要的动物性食品之一,随着生活水平的提高对猪肉的需求量也日渐增加。
同时猪仔解剖、组织、生理及营养代谢等方面与人类较为相似,因此也可以用做生物医学研究模型。
通过转基因技术可以定向培育食用安全、生长迅速的猪新品种或是改变某些性状用来进行医学研究。
对转基因猪的研究从上世纪八十年代经过起步期、平台期到现在发展期已经经过了30余年[2]。
近年来,随着研究的不断深入和转基因技术的日趋完善,转基因猪的制备及应用达到了新的高度逐步向产业化方向迈进。
1.转基因猪的研究进展
1.1转基因猪的研究历史与现状
转基因动物试验最早可追溯到1974年,Brackets等将兔的精子与SV40病毒DNA孵育后,进行体外受精获得转基因兔。
1980年,Gordon[3]等首次报道使用原核注射技术获得了转基因小鼠。
此后,转基因动物的研究得到关注,各国相继展开对转基因动物的研究。
第一头转基因猪诞生于1985年,是Hammer[4]等利用显微注射技术人生长激素融合基因(MT/hGH)注射入猪受精卵中,然后将受精卵移植入发情母猪得到。
1989年Prather[5]等以猪卵母细胞为受体介质,以猪四细胞期胚胎卵裂球作为供体核进行移植得到一头克隆猪。
2001年,Golovan[6]等将植酸酶转入了约克猪的唾液腺中,使其成功表达获得了能自行生成肌醇六磷酸酶的植酸酶转基因猪。
2002年,Lai[7]等成功制备了转绿色荧光蛋白(EGFP)基因猪。
2006年,Kurrome[8]等使用精子介导法与胚胎移植技术成功培育出一头含hALB和EGFP基因的转基因猪。
2013年,Miles[9]等通过构建标记20S蛋白酶的PSMA1-EGFP通过受精作用成功获得了携带绿色荧光蛋白酶的转基因猪。
我国第一头转基因猪诞生于1992年。
魏庆信等采用显微注射和猪精子载体介导两种方法向湖北白猪体导内入OMT/PGH基因,获得了首批转生长激素的转基因猪,这揭开了我国对转基因猪的研究序幕[10]。
1997年,赵浩斌[11]等将杜洛克猪卵核移植到湖北白猪去核卵母细胞中并最终得到了5头核移植猪。
2003年,郑新民等制备出转人血清白蛋白(HSA)的基因猪[12];2008年,刘忠华等[13]成功获得了我国首例EGFP转基因克隆猪。
2009年,王铁东等[14]培育出了稳定表达针对猪瘟病毒的shRNA的转基因克隆猪。
2010年,孙金海教授等人利用精子介导法成功获得了转pGH基因猪[15]。
2013年,樊娜娜等[16]成功获得了首例piPSC克隆猪。
1.2转基因猪的制备
转基因技术自产生到现在不过短短几十年,但其发展迅速,技术手段也不断革新,转基因动物的成功率也大大提升。
目前转基因动物制备技术有:
精子载体法、显微注射法、逆转录病毒感染法、体细胞核移植技术、胚胎干细胞介导法、徒手克隆法等。
1.2.1精子载体法
精子介导基因转移(sperm-mediatedgenetransfer,SMGT)又称精子介导法,是一种简单高效的转基因动物制备技术。
将含有目的基因的载体与新鲜的精子混合在一定的温度下培育孵化一段时间,使目的基因结合到精子体内,然后进行人工授精使精子与卵细胞结合形成含有目的基因的受精卵,最终得到转基因动物,此方法是Lavitrano[17]等在1989年创建。
此方法的原理是利用精子具有吸附结合外源DNA的能力[18],将外源目的基因整合到精子体内,然后利用精卵结合生产出转基因动物。
此方法成本低,操作简单,整合率高而且不会因为机械操作损伤内核等优点。
但精子介导法无法实现定点修饰基因组,其可重复性差,结果不稳定。
1.2.2显微注射法
显微注射法是当前效果最好、应用最广的制作转基因动物的方法[19]。
此方法是由Cordon[20]发明,Lin等在1966年首次报道了此方法[21]。
显微注射法是在显微仪器下用微吸管直接将外源基因注射到受精卵的细胞核中,然后将受精卵通过胚胎移植手段移植到母畜体内孕育得到转基因动物。
著名的“超级小鼠”便是利用显微注射技术制备,1982年Palmiter[22]将5’调控区缺失后的大鼠GH基因与小鼠的Metallothionein-I基因结合,然后利用显微注射技术将融合基因注射进小鼠雄原核中制备而成。
显微注射法自发明以来广泛应用,当前世界上已经有众多实验室建立了相关的标准试验程序。
显微注射法的优点在于外源基因整合到染色体上的效率高;导入的外源基因片段大,可达100Kp;实验所需时间短,可以加快制备转基因动物的周期;可以不需要载体直接进行注射;但是,显微注射技术在实际生产应用受许多因素制约。
显微注射需要专门的仪器,其价格昂贵操作繁琐,需要培训专门的技术人员进行操作,成本高。
据统计,利用显微注射技术生产一头转基因牛的成本高达30万美元[23]。
显微注射会对受精卵造成机械损伤且损伤效应具有不确定性。
显微注射进行转基因动物生产,只会增加DNA而不能定点修饰基因片段也不能切除原有的DNA序列,外源基因注射到核内后与染色单体的整合位点是随机的,不能保证遗传的稳定性和基因的表达,得到基因后代概率低,并且存在致癌风险[24]。
1.2.3逆转录病毒感染法
逆转录病毒载体法是利用将外源目的基因以RNA病毒作为载体,通过人为感染宿主细胞,使其在宿主细胞体内以其RNA为模板进行反转录得到cDNA,cDNA能够通过其特殊的末端序列整合到宿主基因组中成为宿主基因组的一部分,从而能长期稳定的表达。
此方法一般采用将病毒基因用目的基因替换重组产生高滴度的病毒颗粒,然后用其感染受精卵或者处于着床前期或者着床后期的胚胎,也可以采用胚胎与能释放逆转录病毒的单层细胞共同培养的方法使胚胎感染,最后获得转基因动物。
该制备转基因动物的方法最早由Janenisch[25]等在1974年开展研究,他们将SV40DNA注入小鼠胚囊腔中,发现SV40DNA在小鼠体内有整合。
在这之后,他又以Murineleukosisvirus(MLV)作为载体,成功地将外源基因导入到小鼠胚胎中,进而整合到小鼠的基因组[26]。
在转基因猪制备方面,2003年,Hofmann等[27]以该方法成功地将EGFP基因用慢病毒载体LV-PGK转入猪受精卵中,制备了EGFP转基因猪。
2009年,Ramsoondar等[28]利用逆转录病毒载体法将anti-gagand-polshRNAs基因导入猪基因组中,成功制备了能够表达小干扰RNA的转基因猪。
2012年,Zhang等[29]通过缺陷型慢病毒载体携带外源基因与精子共同孵育,成功培育了6头转基因猪。
逆转录病毒法的优点在于技术并不复杂,不需要昂贵的精密仪器设备;效率高,是原核显微注射法的近50倍;整合效果稳定,目的基因能够以单拷贝形式插入到宿主染色体内,数量可控;基因表达效率高,出现嵌合体的几率低,整合位点较少发生重排;当前已经有商业化产品,简化了试验流程。
但逆转录病毒载体转染法也存在诸多缺陷:
逆转录病毒载体的容量小,其携带得外源基因片段长度受到限制,只能在7kb以下难以实现大片段DNA的转移;外源基因难以突破血胎屏障,血脑屏障,成功效率较低;安全性低,染色体上的整合位置不确定,有插入突变、激活癌基因的潜在危险,不宜用于商业化生产转基因动物[30]。
1.2.4体细胞核移植技术
1996,首例体细胞核移植哺乳动物,克隆羊“多利”的诞生,引起世界轰动。
体细胞克隆技术即体细胞核移植技术是利用细胞核的全能性,将体细胞核移入去核卵母细胞中,使其发生再程序化并发育为新的胚胎,这个胚胎最终发育为动物个体。
转基因动物的制备可以利用体细胞克隆技术,通过转基因技术将外源基因导入到细胞核中,再通过体细胞克隆技术将其移植到去核卵母细胞中,经妊娠分娩最终获得转基因动物。
该技术是以克隆技术为基础,优点在于外源基因的整合率极高,能够在细胞水平上对基因组进行特定的改造。
通过对导入外源基因的供体细胞进行阳性后再进行核移植可以100%的得到转基因动物,并且不会存在嵌合体问题。
其缺点是该技术目前还不成熟,有许多技术上的细节需要完善;另外体细胞核移植克隆的效率不高,需要大量的受体动物及卵母细胞;成本较高,需要精密的仪器与熟练的技术人员进行操作。
体细胞核移植技术自克隆羊多利诞生以来,已被应用并制备出转基因绵阳[31]、奶山羊[32]、牛[33]、猪[34]等克隆动物。
在基因打靶技术兴起后,通过与基因打靶技术相结合,使体细胞核移植技术制备转基因动物得到了更迅速的发展。
基因打靶绵羊[35],无疯牛病牛[36],基因敲除猪等相继诞生,2003年,赖良学等[37]以FetalFibroblasts(PGEF)作为供体,通过体细胞核移植技术,成功获得了转基因克隆猪。
2009年,潘登科等[38]将sFat-1基因转染到大白猪PGEF,然后以得到的转基因细胞为核供体移植到体外成熟的去核猪卵母细胞中构建克隆胚胎,通过胚胎移植将构建
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