化学生物学小论文 5.docx
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化学生物学小论文5
化学生物学论文
班级:
2009级化学生物学班
姓名:
韩毅
学号:
2009111101
酶结构及纤维素酶研究
(Enzymestructureandcelluloseenzymeallresearch)
韩毅2009111101化生班
摘要:
酶是活细胞产生的一类具有催化功能的生物分子,在酶的作用下,许多生物化学反应过程可以在温和的条件下以很高的速率进行。
对酶结构的研究对于研究生物体内各种反应具有重要意义。
Abstract:
theenzymeisakindoflivingcellsproducecatalyticfunctionsofbiologicalmolecules,intheroleoftheenzyme,manybiologicalchemicalreactionprocessundermildconditionsathighvelocities.Thestudyofenzymestructureforresearchonbiologicalinbodyvariousreactiontohavetheimportantmeaning.
关键词:
蛋白类酶酶RNA酶结构纤维素酶
酶的化学结构:
酶有蛋白类酶和核酸类酶两大类别,蛋白类酶的主要组分是蛋白质,成为酶蛋白,核酸类酶的主要组分是RNA,称为酶RNA,所以酶的化学结构主要包括酶蛋白的化学结构和酶RNA的化学结构。
一:
酶蛋白是由各种氨基酸通过肽键联结而成,酶蛋白的化学结构主要包括组成蛋白质的氨基酸的种类,数目,排列次序,二硫键的数目和位置,肽键的数目等。
酶RNA由各种核苷酸通过3’,5’-磷酸二酯键联接而成,酶RNA的化学结构主要包括组成RNA的核苷酸种类、数目、排列次序等。
酶蛋白的化学结构:
又称酶蛋白的一级结构。
组成酶蛋白的氨基酸一般不超过20种,氨基酸数目从几十个至几千个,氨基酸的排列次序从氨基端开始算起,氨基酸通过肽键连接而成的肽链。
1、肽键与肽链:
一个氨基酸的-羧基与另一个氨基酸的-氨基反应,脱去一分子的水,生成由肽键联接而成的二肽。
肽键的键长大于C=N双键,而小于C-N单键,具有部分双键性质,不能自由旋转,每个肽单位的六个原子都被酰胺键固定在同一平面上,此平面称为酰胺平面。
由于排列次序的不同生成的二肽有两种。
例如,丙氨酸(A)与甘氨酸(G)可以生成丙氨酰甘氨酸(A-G)和甘氨酰丙氨酸(G-A)两种二肽。
三种不同的氨基酸可生成两个肽键联接起来的六种三肽。
根据排列组合规律,n个不同的氨基酸可以生成n!
个n肽。
蛋白质由20种氨基酸组成,氨基酸的数目成百上千,所以可生成的蛋白质种类是非常繁多的,若干个氨基酸通过肽键连接而成为多肽链,简称为肽链,有些酶蛋白只有一条肽链,有些酶蛋白则由多条肽链通过二硫键联接而成。
蛋白质分子中的二硫键(-S-S-)由两个半胱氨酸的巯基脱氧联接而成。
2、酶蛋白化学结构的测定方法:
酶蛋白化学结构的测定一般包括下列步骤:
(1)酶蛋白的分离纯化:
采用各种生化分离方法,将酶蛋白进行分离纯化,除去蛋白质等杂质。
(2)氨基酸种类和数目的确定:
先将酶蛋白水解,然后采用层析技术(纸层析、薄层层析、柱层析等)将氨基酸分离鉴定。
现在,采用氨基酸自动分析仪等可以方便、快捷的测定氨基酸的种类和数目。
(3)肽链数目的确定:
采用末端分析等方法测定酶蛋白中肽链的数目,然后还原方法打开二硫键,使各条多肽链分开。
(4)氨基酸顺序测定:
将酶蛋白或多肽链进行不完全水解,生成各种小肽,将各个小肽分离纯化后通过末端分析,从氨基端或羧基端开始逐个分析各个氨基酸,从而确定各个小肽种氨基酸的排列顺序。
末端分析方法主要有用于N端分析的二硝基氟苯(FDNB,fluorodinitrobenzene)法和用于C端分析的肼解(hydrazinolysis)法等,二硝基氟苯法是一种肽链N端分析法。
在弱碱性溶液中肽链N端的氨基酸残基可与2,4-二硝基氟苯反应生成二硝基苯肽(DNP-肽),经盐酸水解生成黄色的2,4-二硝基苯胺基酸,可用乙醚提取后,用层析法鉴定。
肼解法是一种肽链C端分析法,此法是将蛋白质或多肽与肼在无水条件下一起加热,使肽链C端氨基酸可与FDNB实际生成DNP-氨基酸。
经乙醚提取后进行鉴定。
二:
酶RNA的化学结构
1、RNA化学结构的内容:
酶RNA的化学结构又称酶RNA的一级结构,主要内容包括组成RNA的核苷酸种类、数目、排列次序等。
组成酶RNA的核苷酸主要有腺苷酸(AMP)、鸟苷酸(GMP),胞苷酸(CMP),和尿苷酸(UMP)四种,酶RNA一般含有几百个至几千个核苷酸。
一个核苷酸的5’位磷酸基与另一个核苷酸的3’位羧基脱水生成由磷酸二酯键联接的二核苷酸。
生成的二核苷酸再与另一个核苷酸反应生成三核苷酸,由此,n个核苷酸可通过磷酸二酯键生成寡核苷酸分子,RNA是单链分子,其核苷酸的排列次序是从5’端开始3’端结束。
2、RNA化学结构的测定方法:
酶RNA化学结构的测定可以采用核酸自动测序仪进行自动分析,也可采用下列方法进行顺序测定。
(1)酶RNA的分离纯化,通过各种生化分离方法,得到纯化的RNA。
(2)将RNA水解生成各种核苷酸,通过分析确定组成RNA的核苷酸的种类和数量。
(3)用特异性酶切法或双脱氧终止法等进行RNA的系列测定,特异性酶切法首先用T4多核苷酸激酶和32P-dNTP进行RNA5’-OH标记,或用RNA连接酶和32PpCp进行RNA3’-OH标记,然后用适量的特异性RNA酶进行部分水解,再进行聚丙烯酰胺凝胶电泳和放射自显影测定RNA分子中核苷酸的排列顺序。
双脱氧终止法首先以RNA为模板通过逆转录酶作用生成互补DNA(cDNA),然后以cDNA为模板,以双脱氧核苷三磷酸(2’,3’-ddNTP)为核苷酸链合成的终止剂,加入标记的引物,通过PCR反应生成不同长度的寡核苷酸,再进行聚丙烯酰胺凝胶电泳和放射自显影得出RNA中核苷酸排列顺序。
酶的空间结构酶的催化功能和特性是由酶完整的空间结构所决定,酶的空间结构主要是指酶蛋白的空间结构和酶RNA的空间结构。
酶蛋白的空间结构:
酶蛋白的空间结构包括二级结构,三级结构和四级结构,酶蛋白空间基本结构单位包括螺旋结构、折叠结构、转角结构和卷曲结构等。
1、酶蛋白的副价键:
蛋白质的空间结构是通过各种副价键连接而成的,副价键对于蛋白质空间结果的稳定至关重要,主要有氢键、盐键、二硫键、范德华力和金属键等。
氢键:
氢键是由肽链中的羰基中的氧原子等电负性较大的原子
与亚氨基,羟基、氨基等集团中的氧原子联接而成的副价键,氢键是蛋白质的空间结构中的主要副价键,普遍存在于蛋白质分子中,可以在肽链之间或同一条肽链之中经过卷曲折叠后在互相接近的原子之间形成,对蛋白质空间结构的稳定性起重要作用。
2、盐键:
盐键由蛋白质分子中的氨基和羧基在一定条件下形成,盐键的结合力较强,是蛋白质空间结构的一个主要稳定因素之一,盐键在蛋白质分子中的数量不多,在酸碱的作用下容易破坏。
3、酯键:
酯键由蛋白质分子中酸性氨基酸残基或末端氨基酸残基上的羧基与氨基酸上的羟基脱水缩合而成,在蛋白质分子中数量不多。
4、二硫键:
由蛋白质分子中两个半胱氨酸残基上的巯基通过氧化脱氢而形成,在蛋白质结构的稳定方面有重要作用,二硫键可以在两条肽链之间或在同一条肽链中形成,二硫键的结合比较牢固,二硫键越多,蛋白质的稳定性越好,非极性溶剂会使二硫键破坏。
5、疏水键:
疏水键有蛋白质分子中一些疏水性较强的侧链集团聚集而成,对蛋白质的稳定性起一定的作用。
6、范德华力:
范德华力又称范德华引力,借助静电引力而形成,范德华力的键能较小。
7、金属键:
金属键是通过金属离子,特别是二价金属离子与蛋白质分子中的集团联接而成,在维持蛋白质分子的空间构型方面起作用,在有四级结构的蛋白质分子中,金属键将各个亚基联接在一起,一旦金属离子被除去,蛋白质的四级结构就会受到破坏。
2:
酶蛋白的二级结构
蛋白质的二级结构是指多肽链主链原子的局部空间排列,一般没有考虑侧链的构象。
二级结构的基本构象主要包括螺旋结构、片状结构、转角结构和无规则卷曲。
(1)螺旋结构:
螺旋结构是由蛋白质的肽链环绕中心轴有规则地一圈一圈盘旋而成的螺旋状构象。
根据盘旋方向的不同,有左手螺旋和右手螺旋之分,天然蛋白质中存在的主要是右手螺旋。
右手螺旋又称螺旋每旋转一周,螺距为5.4A,平均含有3.6个氨基酸残基。
每个氨基酸残基的亚氨基上的氢原子与它前面第4个氨基酸残基的羧基上的氧原子形成氢键,氢键与螺旋轴近乎平行,氨基酸残基的侧链集团都在螺旋外侧。
螺旋的结构常用Sn表示,S代表每圈螺旋含有的氨基酸残基数目,n表示氢键封闭环本身的原子数。
上述典型的螺旋,为3.6,n为13。
不同酶分子可能有不同的螺旋结构,同一种酶分子也可能含有不同的螺旋结构。
螺旋的稳定性主要靠氢键维持,氢键一旦被破坏,螺旋结构也受到破坏。
(2)片状结构:
片状结构最早是在蚕丝蚕心蛋白(角蛋白)中发现的,又称折叠结构。
片状结构是两条或多条肽链充分伸展呈锯齿状的折叠结构,通过侧向聚集,形成与肽链长轴方向平行的扇状构象。
根据肽链的排列方向不同,片状结构可以分为平行式和反平行式两种。
平行式的片状结构,其所有肽链都按相同的顺序排列,即N端都在同一端,而C端都在另一端。
反平行式片状结构则肽链的排列顺序相反。
片状结构的稳定性也靠氢键维持,一条肽链的亚氨基上的氢原子与相邻肽链上的羰基上的氧原子之间形成氢键,有规律的排列在一起。
(3)转角结构:
转角结构又称转弯或发夹结构,是在球状蛋白质分子中发现的一种肽链主链构象。
球状蛋白肽链的盘绕折叠构象往往会发生180°的急转弯,从而产生转角结构。
转角结构是由4个连续的氨基酸残基组成,第一个氨基酸残基的羰基与第四个氨基酸残基的亚氨基形成氢键联接。
在转角结构中常出现的氨基酸残基有甘氨酸、脯氨酸、天冬氨酸、天冬酰胺和色氨酸等。
(4)无规则卷曲:
无规则卷曲是在肽链的主链不规则、多向性地随机盘曲所形成的构象。
无规则盘曲是一种有规律的稳定的构象。
但是在不同的蛋白质分子或相同蛋白质分子的不同肽段中,无规则盘曲却没有固定的构想而有多种形式。
3:
酶蛋白的三级结构
酶蛋白的三级结构是在二级结构的基础上,肽链进一步盘绕折叠而成的三维空间构象,是指蛋白质或多肽连分子中主链和侧链上所有原子的空间排布,而没有考虑亚基和分子间的互相关系。
有一个具有三级结构的酶蛋白组成的酶分子称为酶单体(monomericenzyme)。
单体酶一般只由一条肽链组成,也可由多条肽链组成。
酶蛋白的三级结构具有如下特征:
(1)三级结构是具有二级结构的肽链盘绕折叠形成的三维球状结构。
(2)分子中的非极性基团中在分子内部,形成酶分子的骨架,称为疏水核;而极性基团相对集中于酶分子表面,形成亲水区。
(3)酶分子表面往往有一个内陷的凹槽,又称为裂隙,酶分子的活性中心就在其中。
4、酶蛋白的四级结构
酶蛋白的四级结构是指寡聚蛋白中亚基的种类、数目、各亚基的空间排布及其相互作用等。
亚基是指寡聚蛋白中各个具有三级结构的单位,是蛋白质分子中最小的共价单位,亚基之间通过非共价键相结合。
寡聚蛋白中亚基的数目相差很大,少则两个,多则数十个甚至更多,其中以2个或4个亚基组成者最多。
例如,过氧化氢酶有4个亚基,大肠杆菌天冬氨酸转氨甲酰基酶有12个亚基而烟草花叶病毒蛋白由2300个相同的亚基组成。
寡聚蛋白四级结构的稳定性主要靠各个亚基之间的疏水键来维持,而氢键、范德华力、离子键等也有一定的作用。
寡聚蛋白根据其功能和催化特性的不同,可以分为寡聚酶、别构酶和多酶复合体三种。
(1)寡聚酶:
寡聚酶(oligomericenzyme)是由两个或多个亚基组成的酶,一般只催化一种反应。
寡聚酶中亚基的种类可以相同,也可以不同。
由两个或多个相同的亚基组成的称为均一寡聚酶。
由不同结构的亚基组成的称为非均一寡聚酶。
有些寡聚酶由相同的亚基组成,每一个亚基上都有一个催化部位,但是没有调节部位,称为多催化位点寡聚酶(multisiteoligomerricenzyme).其催化反应其催化反应符合米氏动力学方程,属于米氏型酶。
有些寡聚酶分子上除了有催化部位以外还有调节部位,称为调节酶(regulatoryenzyme)主要指别构酶。
(2)别构酶:
(allostericenyme)又称别位酶属于调节酶(regulatoryenzyme),是指当一种化合物与酶活性中心以外的位点结合以后,酶的构象发生变化,从而导致酶与底物的亲和力发生变化的一类酶。
别构酶含有多个亚基,亚基的结构和功能可以相同也可以不同,别构酶分子中有两种与功能有关的部位,即催化部位和调节部位,调节部位远离酶的活性中心,可以在不同的亚基上,也可以在同一亚基的不同部位。
一种化合物与酶的活性中心以外的部位结合,引起酶的构象发生变化的现象称为别构效应(allostericeffect),与酶活性中心以外的部位结合,引起酶的构象发生变化的现象成为别构效应(allostericeffect)。
与酶活性中心以外的部位结合后,引起酶的构象发生改变的物质称为别构效应剂(allostericeffecter),主要包括各种抑制剂和激活剂,别构效应剂和酶的底物合称配体(ligand)。
一个别构酶分子可以与一个以上的配体结合。
配体与酶蛋白的不同部位(或不同亚基)结合后可以影响另一个配体与霉结合的现象称为协同效应(cooperativeeffect)根据配体对别构酶所产生的影响不同协同作用可以分为同配体效应、异配体效应、正协同效应、无协同效应。
(3)多酶复合体:
多酶复合体也具有四级结构,是由两个或两个以上酶通过非共价键联接而成,其中一个酶各自催化一个反应,所有的反应依次连接,构成一条代谢途径的一部分。
二:
酶RNA的空间结构
酶RNA的空间结构主要包括二级结构和三级结构。
(一)酶RNA的二级结构是指单键RNA分子的自身回折,链内互补碱基配对形成的局部双螺旋区及非配对顺序形成的突环之间的空间排布。
双螺旋是由RNA链中互补的碱基配对而形成的,互补的碱基对通常是G-C,A-U,G-U碱基对。
每个局部双螺旋区至少含有4~6对碱基才能保持稳定。
突环是由RNA链中不互补配对的碱基组成,根据图换的位置不同突环可以有发夹环、内环、膨胀环、多分枝环等。
在核酸类酶中酶RNA的典型二级结构有锤头结构、发夹结构和多分枝环结构等。
(二)酶RNA的三级结构是在二级结构的基础上,进一步盘绕折叠而成的,三级结构,酶RNA的三级结构繁杂分析测定方法还有待发展。
由于纤维素全酶分子呈蝌蚪状、其linker高度糖基化且具有较强柔韧性,故很难得到结晶.而结构域的拆分使呈球形催化域的结晶成为可能,为纤维素酶的结构和功能研究开辟了道路.三维结构的研究为内切酶和外切酶底物的特异性作出了合理的
解释:
内切酶的活性位点位于一个开放的cleft中,它可结合与纤维素链的任何部位并切断纤维素
链;外切酶的活性位点位于一个长Loop所形成的tunnel里面,它只能从纤维素链的非还原性末端切下
纤维二糖.1995年Meinke[6]利用蛋白质工程的方法将C.fimi的外切酶CbhA分子的Loop删除后,发现该酶的内切酶活性果然提高,这进一步证实了上述分析.
催化域功能的研究.1990年Sinnott[7]从化学机制的角度出发论述了酶催化糖基转移的机制,他认为糖苷配基的离去是涉及到两个氨基酸残基的酸碱催化的双置换反应,这实际与溶菌酶的作用机制是相似的.1988年至1994年采用定点突变技术和酶专一性抑制剂做了大量研究[8~12],终于证明Glu位于细菌、真菌的内切酶、外切酶、葡萄糖苷酶的活性位点;在异头碳原子位通过构型的保留或
构型的转化完成催化反应,其中两个保守的羧基氨基酸分别作为质子供体和亲核试剂[13,14]水解双置换机制得以证明.纤维素酶的分子折叠
糖苷酶主要包括水解酶和转移酶,根据其氨基酸序列的相似性至少可分为45个族[23,24],其中
第1,2,5,10,17,30,35,39,42族中的水解酶分子的催化域近来认为可能是来自同一祖先[25,26],这其中150
余个酶的氨基酸序列得到了测定,它们对16种不同的底物表现出了水解活力.
纤维素酶和半纤维素酶是这个庞大家族中的成员,这些酶分子一般由催化结构域、纤维素结合域
和一个连结二者的连接桥三部分组成.结晶结构的证据表明:
同一族的酶分子遵循相同的机制;这些酶水解葡萄糖苷键通过一般的酸催化机制.与此相反,不同族的酶分子可能有不同的机制,并且可能有不同的折叠模型[27].在纤维素酶和半纤维素酶的研究中,人们又根据同源性将它们分成九个族(A~J)[28].目前,A,B,C,E,F族中已有酶分子的结晶结构得到解析
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