组织芯片简易制作方式及免疫组化有效性分析.docx
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组织芯片简易制作方式及免疫组化有效性分析
组织芯片简易制作方式及免疫组化有效性分析
漆楚波,朱润庆,夏和顺,王明伟
【摘要】目的探讨一种组织芯片的简易制作方式,并对它的有效性进行分析。
方式在实验中探讨出组织芯片的制作方式,搜集乳腺癌病例124例,制作成直径的组织芯片,进行雌激素受体(ER)、孕激素受体(PR)及cerBb2受体免疫组化染色,同时与一般切片的免疫组化染色结果对照,并进行统计学分析。
结果组织芯片与一般切片的ER、PR及cerBb2染色积分(0~7分)显著相关,ER、PR及cerBb2的表达(阳性/阴性)一致率别离达%、%和%。
比较组织芯片与一般切片的ER、PR及cerBb2的表达,二者之间无统计学不同(P>),即组织芯片的结果与一般切片的结果是一致的。
结论自制直径的组织芯片在进行免疫组化染色时能够代表一般切片,自制组织芯片的方式靠得住有效。
【关键词】组织芯片;简易制作方式;雌激素受体;孕激素受体;cerBb2受体;免疫组化
ASimpleMakingMethodofTissueMicroarrayandValidationStudyonImmunohistochemistry
Abstract:
ObjectiveTosearchasimplemakingmothdoftissuemicroarrayandevaluateitsvalidation.MethodsAnew,simpleandeasymethodwasdesignedtoimprovethetechnologyofTMAduringtheexperiment.Tissuemicroarrayswithindiametertissuecorewereconstructedfrom124casesofbreastcancer.Thetissuemicroarrayswerestainedforoestrogenreceptor(ER),progesteronereceptor(PR)andcerBb2usingthesametimethestainsonthetissuemicroarrayswerecomparedwiththatfromthefulltissuesections.ResultsAhighlysignificantassociationwasobservedbetweenthestainingscores(0~7)obtainedfromthefulltissuesectionsandfromthetissuemicroarrays.Concordanceforthereceptorstatus(positive/negative)ofthewholesectionandthetissuecorewere%forER,%for%forcdiscordancebetweenfullsectionandtissuemicroarrayswasstudiedusingTwoRelatedSamplestestsandtheresulthadnostatisticalsignificance(P>).ConclusionTissuemicroarayswithindiametertissuecoremadebysimplemethodcanrepresentfulltissuesectiononimmunohistochemistrybelieveourmethodoftissuemicroarrayisareliableandvalid
Keywords:
Tissuemicroarrays;Makingmethod;Oestrogenreceptor;Progesteronereceptor;cerBb2receptor;Immunohistochemistry
0引言
组织芯片(tissuechip)又称组织微阵列(tissuemicroarrayTMA)。
它是将数十至上千个小组织依照设计,整齐地排放在一张载玻片上制成组织切片的技术。
这一技术由美国国立癌症研究院的Kononen等[1]于1998年在NatureMedicin上第一次报导。
它是继基因芯片、蛋白质芯片以后显现的又一种重要的生物芯片技术。
由于现有组织芯片设备昂贵且操作繁琐、取样点样本精度低等缺点,阻碍了组织芯片技术在病理诊断和研究中应用。
咱们参阅大量资料,自行设计工具,成功制作了高质量组织芯片。
依照工作需要,咱们选择比较乳腺癌组织芯片和一般切片中免疫组化的不同,来判定组织芯片的有效性,以期能用组织芯片技术提高工作效率。
1材料与方式
供体蜡块的选择搜集湖北省肿瘤医院病理科2005年12月~2006年6月诊断为乳腺癌并做过受体检测的病例160例,复查组织切片,包括苏木素-伊红(HE)和雌激素受体(ER)、孕激素受体(PR)、cerBb2受体染色切片,一些组织蜡块太薄的病例被排除,最终有124例入选本实验,均为4%甲醛固定、石蜡包理的组织。
其中浸润性导管癌101例,浸润性小叶癌14例,大汗腺癌1例,化生性癌1例,髓样癌7例。
组织芯片的构建
简易工具的制作
(1)打孔针和取样针的制作打孔针和取样针均能够用带实芯针的穿刺针自己磨制。
一套针有四件,两个空心针及配套的两个实心针芯。
针径能够是~,须注意打孔针径比取样针径小1号(即打孔针的外径与取样针的内径一致),以便取样组织的直径和打孔孔径一致,以防组织芯孔与受体组织连接不紧脱落。
咱们利用的取样针直径是,打孔针和取样针的外周套彩色塑料膜以标记针进入蜡块的深度,打孔针打孔的深度要比取样针深。
有人报导是采纳微雕开窗标记刻度技术,咱们以为不可取,因为针用久不锋利时要磨,会阻碍刻度[2]。
(2)通量定位模板的制作依照自己的需要,能够利用不同直径的针制作不同通量的模板(最好用透明材料),孔间距能够为到,建议刚开始操作不熟练时刻距大一点(),周围留白距离大一点(),以避免打孔打歪或石蜡块断裂,阻碍成效。
模板的周围最好是三周都有挡板,模板的内径大小和受体腊块相同,以便模板卡在受体蜡块上,操作起来很轻松。
咱们利用的通量模板有两种:
①通量阵列5×7,取样直径,间距;②通量阵列7×9,取样直径,间距;蜡块大小统一为×,厚度,便于治理。
制作方式
(1)受体蜡块的制作及打孔①能够利用熔点在60℃~62℃一般切片纯净石蜡制作,依据自己的需要设计制作规格与模板大小一致的各类包埋框;②倒入融化的液体石蜡,在蜡块的表面加上一般塑料包埋底盒,以便切片时固定蜡块和编号,也可直接用标签纸蜡封编号(切片时有可能使底盒与蜡块脱落,但蜡块仍然很规整不阻碍切片)。
浇注熔化石蜡后开始计时,40~50min后(具体时刻可能因为室温的不同而不同)蜡块成型而且处于未完全固体化状态,剥离包埋框,开始打孔;③打孔时先将定位模板卡住受体蜡块固定,然后用对应型号的打孔针通过定位模板上的阵列孔打孔,深度为。
打孔需快速进行,不然蜡块变冷变硬时容易发裂,现在也能够放入摊片机水箱中(水温46℃)水浴加热3~5min,使蜡块受热变软而不易发裂。
(2)待取位点标记及供体蜡块的制作这是技术创新的关键。
由于多数取材组织是四方形的,很少是不规那么的,使咱们在显微镜下阅片后很难回到蜡块上的某一点精准取材,经常使用方式是在玻片上画圈标记,再回到组织蜡块上目测找位点,这种方式由于取样位点象限不行确信而需要多处取样,这大大增加了咱们的工作量和本钱。
咱们的解决方式是坐标定位法准确信位:
①在取材时用大头针在蜡块的左上象限1/3处打孔做标记(也可在已成形的蜡块上用小针打孔标记),作为XY轴的原点。
②咱们阅片时以此打孔点位为原点,别离在显微镜下测出咱们要取材的位点在水平轴(X轴)和垂直轴(Y轴)上的坐标距离,再返回到蜡块上相应的坐标位点做标记,取样。
从而实现点对点的精准位点取样,仅一次就可成功。
(3)供体蜡块的取样①供体蜡块取样前需加热,方式有烤箱加热和水浴加热,咱们以为水浴更方便,且易于操纵。
水温46℃~48℃,加热5~10min;②依据前面测量的坐标找到需要取材的位点,用采样针在供体蜡块欲掏出部位上打孔采样,深度(比受体蜡块孔浅),深度先在针上用彩色塑料膜标记,采样时需缓慢使劲,避免供体蜡块裂开,抵达要求的深度后要旋转两周以便针芯充满。
③在阵列蜡块(受体蜡块)上找到要填入的位点,用实心针芯缓缓推出,准确植入,使组织芯的平面和蜡块的大体一致。
④为了更方便准确的取样,咱们制作了简单的取样定位工具,制作方式:
在两个内空的矩形直角边上刻上精准刻度,取样时用两个矩形相对的直角两边组成一个中空矩形,依照前面显微镜下测量的距离和方向,以打孔点为矩形的一个直角的极点,对角极点确实是要取样的位点的精准位置。
以上创新方式咱们取名为二维坐标定位矩形模板取样法。
(4)阵列位点信息记录①在植入组织芯时在左上象限非对角线上的某一个位点要空出,以便识别阵列的方位。
有报导采纳植入脑组织来定位,咱们实践后以为仍是不植入方便,因为:
一方面不植入组织芯的阵列,咱们肉眼就能够够确信方位,而植入脑组织的阵列要在显微镜才能确信;二是脑组织在摊片时有时容易散开,从而增加确信方位难度。
②信息记录采纳二维记录方式,精准记录每一名点的信息。
水平方向从左到右每一个点坐标标记为A、B、C、…,垂直方向每一个点坐标标记为一、二、3…,如此每一个位点都有由一个由字母和数字组成的坐标,如(A3),(B5),(G2)等等。
能够在记录本上记录每一个位点的信息,很方便的成立组织芯片库。
(5)阵列蜡块的处置阵列制作完毕后,将阵列蜡块含有组织的一面平放在一玻璃板上,置于56℃恒温箱内,每5min观看一次,待蜡块和玻璃板中间显现液体状的石蜡把蜡块掏出,置于冰箱内冰块上冷却。
有报导是在常温下冷却,咱们实践和比较后以为冰箱内冷却成效更好,因为:
常温下冷却蜡块必需底面(有组织芯片的面)朝上,这时液体石蜡容易流出,使蜡块的边角变钝,如此阻碍边角的组织芯的切片。
(6)切片冰腊块好后以4μm厚切片,裱贴于经2%3氨丙基三乙氧硅烷(APES)丙酮液处置过的载玻片上。
微阵列蜡块的切片用德国徕卡一次性刀片在徕卡切片机上切片,与常规组织切片大体相同,可是因为蜡块内的组织块多,在裱片时操作要轻,速度把握适宜,不然容易离断或组织阵列偏移,另外,还要注意水温,太低切片展不开,太高易拉长,拉断,维持在48℃左右较适合。
用一次性切片刀比用一般厚钢刀切片质量要好。
共制作腊块4个,各切片3张共12张切片,每张切片留一个为定位用空白点,其余62个为有效组织位点。
372例免疫组化只做了12张玻片。
工作量相当于以前免疫组化的3%。
免疫组织化学标记将组织芯片蜡块进行持续切片,厚度为4μm,裱贴于APES丙酮液处置过的载玻片上。
60℃烤箱内烤片1h,脱蜡入水,3%H2O2室温孵育10min,灭活内源性过氧化物酶,微波修复抗原100℃15min,一抗均为单克隆即用型抗体,免疫组织化学染色检测采纳非生物素即用型EliVisionTM二步法,DAB显色。
抗体及DAB显色剂及即用型第一代免疫组化ElivisionTMplus广谱试剂盒均购自福州迈新生物技术开发。
染色结果的判定ER和PR均为细胞核着色,cerBb2为胞膜着色。
阳性判定采纳快速积分法[3],第一将染色强度打分:
0分为未着色,1分为淡黄色,2分为棕黄色,3分为棕褐色。
再将阳性细胞所占的百分比打分:
阴性为0分,阳性细胞<25%为1分,25%~50%为2分,51%~75%为3分,>75%为4分。
最后将染色强度的得分与百分比的得分相加。
依照两种方式评定:
0~3分为阴性,4~7分为阳性。
统计学处置采纳直线相关分析比较组织芯片与一般切片之间的ER、PR及cerBb2得分的相关性,采纳配对的卡方查验检测组织芯片与一般切片之间的ER、PR及cerBb2表达(阴性/阳性)一致率。
2结果
组织芯片质量所有组织芯片组织排列整齐,12张切片,共744个组织位点,只有35个位点发生了部份缺失,且均低于50%,不阻碍结果的判定。
由于咱们采取的是精准位点取样,未显现无效组织。
免疫组织化学染色一般切片与组织芯片相较,二者的ER、PR、cerBb2得分显著相关(P<,见表1.
表1组织芯片与一般切片ER.PR和cerBb2得分的相关性(略)
一般切片ER、PR和cerBb2的阳性率别离是%、%和%,组织芯片的ER、PR和cerBb2的阳性率别离是%、%和%组织芯片与一般切片之间的ER、PR和cerBb2的阳性率表达(阴性/阳性)一致率别离为%、%和%。
假设采纳阴性/弱阳性/阳性系统评定染色结果,那么二者之间的ER、PR及cerBb2表达一致率别离为%、%和%。
尽管二者一致率很高,但并非是完全一致,因此咱们选用配对卡方查验检测它们之间的ER、PR和cerBb2表达是不是有不同,见表2。
表2组织芯片与一般切片ER、PR和cerBb2表达结果(略)
由2表可见,ER、PR和cerBb2在组织芯片和一般切片上的表达不同无统计学意义(P>,即组织芯片有专门好的代表性。
3讨论
组织芯片、基因芯片和蛋白质芯片并称为分子遗传学的三大芯片技术,而组织芯片结合了形态学、基因学和蛋白质学,能够同时分析成百上千种组织和细胞的核酸和蛋白质与临床疾病的关系[4]。
因此,开展组织芯片技术成立肿瘤和正常组织芯片库有着重大的意义。
本实验结果说明,直径的组织芯片从整体是能够代表一般组织切片进行免疫组化研究的。
若是照标准的程序制作组织芯片(专门是准确选取组织芯),直径的组织芯片代表性可不能显现明显误差,能够幸免无效组织芯片的显现。
同时本实验结果也显示,并非是组织芯片上每一个组织芯都能完全代表其原先的一般切片,但这细小的不同并非阻碍免疫组化的结果,在统计学上没成心义,经统计学处置后,单一数据的变异可不能阻碍整体的估量,本研究的观看结果与Kallioniemi等相同[5],因此,只要选择病例适当完全能够利用组织芯片免疫组化取代常规免疫组化,从而提高工作效率和科研水平。
本实验的切片和免疫组化的工作量仅常规的3%,节约了试剂也减少了实验误差。
组织芯片由于它的高通量,平行性和科学性无疑会给科学进展的飞跃提供一个超级优秀的平台,由于这项技术还不很成熟,需要专门的昂贵设备,且可操作性不行,国内对它的研究还处于起步时期,咱们设计制作的组织芯片质量较高,技术成熟,本钱低廉(已申请专利,专利申请号:
),超级有利于组织芯片技术在我国的进展,应用该技术能够迅速地在全国成立系列组织库。
咱们技术的优势:
(1)依托石蜡切片的现有设备,自己设计和制作各类工具和设备,本钱低,可操作性强,超级有利于开展工作。
(2)成功实现点对点的精准位点取材,从而幸免了以前报导的由于肿瘤异质性所造成的无效芯片误差。
(3)精准记录每一个芯片位点的信息,便于以后实验。
能够有效的成立系列正常和肿瘤组织芯片库。
(4)咱们的各类组织芯片蜡块全数统一大小规格,能够与包埋经常使用的底板兼容,方便了切片,也能够使技术标准化、标准化,便于以后运算机阅片。
(5)在实践中能够很方便的组合所需要的各类组织芯片。
TMA技术的提出,使以避免疫组织化学和原位PCR为代表的分子病理学研究进一步迈向标准化、科学化和高技术化[6],TMA具有一般切片无法比拟的优越性:
超级微小(直径~),数量多(目前可达1000个点阵),形状规那么,排列有序,具有高通量和平行性,检测结果的科学性和可比性强,信息量大,效率高,消耗试剂少。
在对肿瘤的分子改变与临床病理特点的联系研究上,TMA将提供庞大帮忙,同时TMA也可用于基因产物的挑选、生物试剂的测试、病理质量的操纵及标准化、教学和考试和制作微缩组织学和病理学图谱。
随着TMA技术的不断进展,肿瘤及正常组织库的成立,TMA的构建形成系列化,病理学的作用将面临转变,即在肿瘤分型时再也不把重点放在组织学形态改变上,而是从多方面、多水平地为临床医治提供更多资料。
相信在不久的以后,TMA技术在肿瘤的诊断和研究领域中将发挥加倍重要的作用。
【参考文献】
[1]KononenJ,BubendorfL,KallioniemiA,etal.Tissuemicroarrysforhighthroughputmolecularprofilingoftumorspecimens[J].NatMed,1998,4:
844847.
[2]蒋时红,刘旺根,王雪萍,等.组织芯片手工制作工具[J].解剖学杂志.2006,29
(2):
145.
[3]BarnesDM,HarrisWH,SmithP,etal.Immunohistochemicaldeterminationofoestrogenreceptor:
comparisonofdifferentmethodsofstainingandcorrelationwithclinicaloutcomeofbreastcancer[J].BrJCancer,1996,74(9):
14451451.
[4]TorhorstJ,BucherC,KononenJ,etal.Tissuemicroarraysforrapidlinkingofmolecularchangestoclinicalendpoints[J].AmJpatlol,2001,159(6):
22492256.
[5]KallioniemiO,WagnerU,KononenJ,etal.Tissuemicroarraytechnologyforhigh-throghputmolecularprofilingofcancer[J].HumMofGenetics,2001,10:
657662.
[6]HsuFD,SielsenTO,AlkushiA,etal.Tissuemicroarravsareaneffectivequalityassurancetoolfordiagnosticimmunohistochemistry[J].2002,15(12):
13741378
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