干热河谷地区几种豆科植物根瘤菌纯培养及生理生化的初步研究论文.docx
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干热河谷地区几种豆科植物根瘤菌纯培养及生理生化的初步研究论文
西南林业大学
本科毕业(设计)论文
(2010届)
题目:
干热河谷地区几种豆科植物根瘤菌纯培养及生理生化的初步研究
Preliminarystudyofseverallegumerhizobiapurificationandphysiologicalandbiochemicalcharacteristicsindry-hotvalley
教学院系:
保护生物学学院
专业:
植物保护06级
学生姓名:
代志浩
指导教师:
张东华(讲师)
评阅人:
刘丽(实验师)
2010年6月8日
干热河谷地区几种豆科植物根瘤
菌纯培养及生理生化的初步研究
代志浩
(西南林业大学保护生物学学院昆明650224)
摘要:
本试验对采自云南元谋和元江干热河谷地区的10种豆科植物根瘤样品进行了分离纯化培养,共纯化出34株菌,其中具有根瘤菌特征的的有4个菌株,对其进行耐酸碱性、耐盐性、生长温度范围3种生理生化的初步分析测定,所测4个菌株均表现出耐酸碱性和耐盐性的性状,在短时间的低温和高温下处理后,仍能保持活性,表现出良好的生长势。
并对分离出来的10株革兰氏阴性菌进行回接实验,选择沙土、蛭石、营养液等不同的培养载体,并选择台湾相思作为回接豆科植物,以确定供试豆科植物与所分离培养菌种之间的共生结瘤关系、获得并保存高效优良的根瘤菌菌株。
关键词:
干热河谷根瘤菌分离纯化回接试验生理生化
Preliminarystudyofseverallegumerhizobiapurificationandphysiologicalandbiochemicalcharacteristicsindry-hotvalley
DaiZhihao
(Facultyofconservationbiology,SouthwestForestryUniversity,Kunming,650224)
Abstract:
ThisstudytakentenkindsoflegumerhizobiaforpurifiedculturefromtheYuanmouandYuanjiangdry-hotvalley,and34strainswerepurified,whichhasthecharacteristicsofRhizobiastrains,4.Determinedbythepreliminaryanalysis,4strainsshowedacidandsalttolerancetraits,inshortlowandhightemperaturetreatment,remainactiveandshowinggoodgrowthpotential.Ontheisolated10strainsofGram-negativebacteriato-backexperiments,selectedthesand,vermiculiteandnutrientsolutionsuchasdifferenttrainingvectors,andselectAcacialegumesasbackthen,todeterminethetestedlegumesandThestrainswereisolatedandculturedrelationsbetweenthesymbioticnodulation,acquireandsavethehighqualityoftheRhizobiumstra.
Keywords:
dry-hotvalley,rhizobium,purification,inoculatingtest,
physiologicalandbiochemical.
1研究背景
1.1干热河谷概况
干热河谷包括干旱和半干旱、热带和亚热带的河谷,是河流流域地形深陷封闭、气候炎热干燥生境条件下的特殊河谷盆地,是横断山脉地区最突出的自然景观之一,干热是其特点,主要分布在横断山脉地区金沙江、怒江、澜沧江、元江、雅砻江、岷江、大渡河、安宁河等及其支流的河的部分地段,垂直幅度200—1000m,干旱河谷总长4105km,总面积11230km[1].干热河谷是干旱河谷的一种亚类型,只分布在怒江海拔1200m以下、元江海拔1000m-1400m以下、澜沧江海拔1000m以下不间断河谷、金沙江800m—1200m以下河谷、另外在南盘江局部地域1000m以下的河谷,这些地区主要包括攀枝花的部分地区、元谋、东川、巧家、怒江、元江、红河、开远等[1.2]。
干热河谷地区年平均降水<800mm,年平均气温>17.5℃,最冷月日平均温度≥10℃,全年积温 ≥6000℃,≥10℃天数>30d,月均最低温>0℃,全年平均气候干燥度≥1.5[3];干旱河谷现存植被均为耐旱乔木、灌丛、草丛,一些地段已呈半荒漠化景观,大部分地段盖度大多在20~30%,个别植被较好的地段可达60%,群落层次结构单一,所有种类基本上都是阳性的,呈现多毛、具刺、叶小、质厚、低矮或匍匐生长等典型旱生植被特征。
除在横断山区南段的一些干热河谷有一些耐旱乔木如木棉等零星分布外,随着积温等的逐渐降低,北段河谷只有落叶低矮小灌丛、草丛分布。
土壤类型有燥红土、褐红壤、赤红壤、紫色土等,有典型的干热生物气候特征。
1.2生物固氮
空气中约80%的氮气不能被植物直接利用,而有一些生物能够直接吸收空气中的氮素作为养料,它们将分子态氮先还原成氨,再转化为氨基酸和蛋白质,这就叫生物固氮。
当今由生物固定的氮已达2.0亿t/a,占地表化合态氮的65%~70%,而根瘤菌豆科植物共生体固定的氮又占生物固氮量的65%。
生物固氮是自然生态系统中氮的主要来源,全球生物固氮的量是巨大的,海洋生态系统每年生物固氮量在4×1013~2×1014g,陆地生态系统生物固氮量在9×1013~1.3×1014g,而工业固氮量在20世纪90年代中期每年约为1.4×1014g。
可见,生物固氮在农、林业生产和氮素生态系统平衡中的作用很大。
我国农民利用豆科植物固氮肥田历史悠长,直至现在仍保留着豆科植物和非豆科植物轮作、套作和间作等耕作制度。
国外也十分重视固氮生物在农业中的作用[4.5],豆科植物等,其根部长有许多小球,它是由根瘤菌共生形成的根瘤,就具有固氮作用,根瘤菌—豆科植物共生固氮体系是自然界固氮效率很高的一个体系,该体系广泛分布于地面各处。
据估计,其年固氮量约占各种生物固氮体系总量的50%,大大超过世界化工合成氨产量的总和(约4000万吨),成为农业生产的主要氮源[6]。
又如稻田中的水生蕨类植物满江红(俗称红萍),由于叶腔中有固氮鱼腥藻共生而能吸收和利用大气中的氮;以上两种形式称为共生生物固氮.生物固氮的形式除共生生物固氮外,还有细菌自生固氮联合固氮.联合固氮(又称为半共生固氮)它又分为内生联合固氮和外部联合固氮.目前已发现有固氮能力的微生物有60多属约数百种,包括细菌、放线菌、蓝绿藻等。
1.3豆科植物的根瘤菌
根瘤菌(rhizobia)是一类能与豆科植物共生,形成根瘤并固定空气中的氮气,为植物生长提供氮素营养的革兰氏阴性细菌[7]。
1888年,荷兰学者Beijerinck从豆科植物根瘤中分离出固氮细菌,命名为根瘤菌。
1895年Nobbe和Hiltner将根瘤菌接种剂第一次用于试验室,并在英美申请豆科植物接种剂专利。
从此,各国科学家对生物固氮产生了浓厚的兴趣,并进行了大量的研究。
经过不断的探索与实践,豆科植物固氮已在生产实践中取得了很大的成功。
目前已知能够与豆科植物结瘤的细菌约40个种,均为革兰氏阴性细菌,属于细菌域(Bacteria)、变形杆菌门(Proteobacteria)[8]。
自从Deley于1978年首次采用根瘤菌分类系统分类方法以来,特别是自根瘤菌多相分类系统被广泛应用以来,随着大规模资源调查的展开,到目前为止,已发表的根瘤菌已由原来1984年的2属4种增加到2004年的9属43种[9、10]。
1.4干热河谷根瘤菌国内外研究进展
自1888年,荷兰学者BeijerinckMW从豌豆根瘤中第一次成功分离出根瘤菌菌,并将其命名为Bacillusradicicda。
1989年建议将可在豆科植物上结瘤的细菌属改名为根瘤菌属(Rhizobium),并沿用至今。
至1984年新属不断建立,发展到7属36种。
90年代后,新的根瘤菌属种不断被发现。
近年来,随着16SrRNA序列分析技术的应用,使根瘤菌系统发育的研究有了重大突破。
随着分子生物技术的发展,传统的根瘤菌分类已经被以系统发育为主的多相分类所取代。
目前,根瘤菌新属新种不断涌现,已确立的有12属,51种。
我国在20世纪50年代使用大豆根瘤开始了生物固氮在农业生产中的应用,至80年代,我国一方面从分子水平进一步研究根瘤菌在豆科植物的固氮机理,一方面通过人工诱发非豆科植物根部根瘤,试图使非豆科植物也能共生固氮。
其中相继对水稻、小麦、玉米和高粱等作物的联合固氮进行深入研究,并成功分离出一批具有高效固氮功能的联合菌株。
同其他生物一样,根瘤菌的生存及其共生固氮过程往往受到外界不良环境条件的影响,而土壤的干旱和高盐是重要的限制因子[11]。
近年来,不少学者对根瘤菌抗旱性及其机制进行了研究,初步了解了根瘤菌的抗旱机制,并分离出与耐旱性有关的调节基因,从而构建出相应的具有抗性的细菌和植物,为根瘤菌的进一步研究提供了理论依据,也为利用该类微生物在干热河谷等受干热高温条件影响的地区植被状况改善,及农业生产能力提高提供新的方法
1.4.1根瘤菌耐旱性研究进展
干旱是干热河谷的主要特征之一,也是根瘤菌—豆科植物共生结瘤固氮的限制因素。
在干燥土壤中,由于缺少正常根毛,而使感染受到限制。
缺水导致固氮作用钝化,失水如果不超过根瘤鲜重的20%,浇水后活性可以恢复。
如失水更多,就会导致根瘤构造的永久性损伤—根瘤脱落[12]。
当土壤水分从5.5%下降到3.5%时,会明显的减少根毛侵染线的形成并完全限制根瘤的形成[13]。
不同品系的根瘤菌,对高温和干旱的反应不同。
Shoushtari和Pepper[14]发现分离自沙漠中的Prosopis(牧豆树属)根瘤菌可以在沙漠土壤中存活一个月。
水分胁迫对紫苜蓿M.sativa[15]、落花生(Arachishypogaea)[16]、扭曲山蚂蝗(Cyamopsistetragonoloba)[17]和一些热带豆科植物瓜尔豆(Desmodiumintortum)[18]的共生固氮影响很小。
绿豆(Vignaradiata)[19]和白花三叶草(Trifoliumrepens)[20]在干旱胁迫下产生了基因型变异,来适应干旱的条件。
黄明勇等[21]对花生根瘤菌的抗旱性研究发现,花生根瘤菌在不同的土壤水分条件下其存活数量不同,且所研究的花生根瘤菌中存在其抗旱性较强的菌株。
曾小红等[22]研究干热河谷根瘤菌的耐干热性,发现分离自干热河谷的根瘤菌均具有较好的耐高温抗干旱的特性。
关桂兰[23]等对新疆干旱地区根瘤菌资源研究发现,新疆地区根瘤菌的生长繁殖及对寄主植物侵染结瘤和固氮作用明显不同于其他的生态区,它不仅能在干旱、高温、盐碱等不利条件下很好的生长繁殖,而且还能侵染寄主并使之结瘤固氮,表现出对环境的良好适应性。
可以看出,根瘤菌的这种对干热环境出现出来的不同反应,不仅与其本身对干热条件的耐受力和寄主的抗干热能力有关,也与生活环境有关,是一种协同进化。
1.4.2温度对根瘤菌的影响研究进展
温度的高低是影响一切生物生长发育的因素之一,同样温度也是影响根瘤菌生长发育的限制因素之一。
一般认为,根瘤菌的最适生长温度为25~30℃,但也一些根瘤菌表现出耐热和耐低温的多样性。
张慧等[24]从广西分离的相思树根瘤菌菌株中,有3个耐高温的菌株,表明在相思树根瘤菌中普遍存在着耐高温菌株。
黄宝灵等研究了15个分离自不同生态环境的相思树种根瘤菌菌株对温度的耐受性,结果表明,相思树种的根瘤菌能在高温(39℃)下生长良好的菌株S09号。
万晓红等[25]对陕西杨陵某试验田的22个紫花苜蓿品种的新鲜根瘤分离纯化后得到的52株根瘤菌株进行了耐低温耐高温的研究报道,发现供试菌株在低温4℃时停止生长,在高温40℃时均能生长,50℃时均停住生长,60℃处理10min后在28℃培养,所有菌株正常生长,根瘤菌株能瞬间耐高温。
李兴芳[26]等在对相思根瘤菌的抗逆性初步研究中,把21株相思根瘤菌和2株大豆根瘤菌菌株直接置于气温为8℃、28℃、37℃、43℃的环境下培养生长和在55℃下处理20min和65℃下处理10min后在适宜条件下培养生长[27],发现全部能在37℃条件下生长,经55℃下处理20min在28℃条件下培养生长,快生大豆根瘤菌USDA205和8株相思根瘤菌能够较好的生长,有4株微弱生长;经65℃下处理10min后有快生大豆根瘤菌USDA205和5株相思根瘤菌能够生长,说明有的菌株耐热性较高[28]。
但谷俊等[29]发现中国北方地区甘草根瘤菌对低温(4℃)具有很强的耐受性。
而关桂兰等研究表明,在高温、干旱地区根瘤菌的生长繁殖以及寄主植物侵染和结瘤固氮作用均有别于一般生态地区,而且还表现出与干旱地区相适应的耐高温耐盐的特点[23]和温度对干旱地区豆科植物根瘤的形成和固氮活性不是限制性因子[28]。
因此在干热河谷地区也应该存在适应该地区的恶劣环境的耐高温干旱的根瘤菌资源,这也是干旱地区植物对干旱环境适应的表现。
1.5该实验的目的意义
本试验对采自云南干热河谷地区(元江和元谋)的部份豆科植物根瘤菌进行分离纯化,生理生化特性分析和回接结瘤试验,以系统获得该地区根瘤菌的耐盐性、抗性等主要生理生化指标的特性;同时通过回接结瘤试验,以确定供试豆科植物与所分离培养菌种之间的共生结瘤关系、获得并保存高效优良的根瘤菌菌株,为干热河谷地区可持续发展农、林、牧业提供相关的理论基础.
2材料
2.1实验试剂及药品
升汞(1%)、丙三醇、甘露醇、磷酸氢二钾、磷酸二氢钾、无水硫酸镁、氯化钠、酵母粉、琼脂粉、氢氧化钠、盐酸、PH试纸(1-14)、结晶紫、碘液、番红染液、乙醇(75%)
2.2实验仪器
电子天平(0.0001g,0.001g)、高压灭菌锅、电热恒温培养箱、光照培养箱、超低温冰箱、4℃冰箱、摇床、光学显微镜、超净工作台、移液枪
2.3实验材料
本次试验共采用所采集样品中的10种豆科植物根瘤作为材料,其中元谋5种(见表2-1),元江5种(见表2-2)
表2-1元谋采集试验用样品一览表
编号
时间
地点
海拔
(m)
温度
(℃)
湿度
(%)
生境
宿主
根瘤特征
M1
2009
9.16
元谋县能禹镇
凤仪村
N25°969617′
E101°85041′
1086
40
30
河滩沙石地中,与芝麻混种,光照强度高,土壤水分含量低
兵豆
LensculinarisMedic.
近球形
黄色
M3
2009
9.17
元谋县牛街村
N25°76342′
E101°84765′
1078
34
31
公路边大豆田中,光照充足,土壤为砖红壤,水分含量高,周围为番茄田
大豆
Glycinemax(L.)Merr.
球形
M4
2009
9.17
元谋县黄瓜园镇河西村
N25°76203′
E101°83303′
1060
38
47
河滩沙地上,水分含量高,光照充足,周围生长有桉树、竹子
响铃豆
CrotalariaalbidaHeyne
不规则
M6
2009
9.17
元谋县黄瓜园镇河西村
N25°76216′
E101°83311′
1060
34
48
河滩沙地上,水分含量高,光照充足,周围生长有桉树、竹子
小叶三点金
Desmodiummicrophyllum(Thunb.)DC
球形黄色
续表2-1
编号
时间
地点
海拔
(m)
温度
(℃)
湿度
(%)
生境
宿主
根瘤特征
M8
2009
9.18
元谋县元马镇
沙地村后山
N25°69673′
E101°87396′
1092
32
55
小山丘上的夹杂有按树,竹子的银合欢林中,光照丰富,土壤为红壤,林中有小水沟
银合欢
Leucaenaglauca
(L.)Benth.
球形黑色
表2-2元江采集试验用样品一览表
编号
时间
地点
海拔
(m)
温度
(℃)
湿度
(%)
生境
宿主
根瘤特点
J1
2009
10.21
元江县新村
N23°5914′
E101°9917′
392
27
70
农田边草丛
银合欢
Leucaenaglauca
(L.)Benth.
梭形褐色
J4
2009
10.21
元江县黄秧数村
N23°58318′
E101°98345′
387
31
50
茉莉花地边,光照强度大,土壤为黄壤,水分含量低
山蚂蝗属
DesmodiumDesv
椭圆形
褐色
J6
2009
10.21
元江县那整村
N23°58991′
E101°99180′
405
41
30
公路边的草丛中,光照强,土壤为沙石土,水分少
响铃豆
CrotalariaalbidaHeyne
球形黄色
J8
2009
10.22
元江县元江河边
N23°60450′
E102°00438′
388
38
46
桂圆林下,光照丰富,紫色土壤,水分含量大
花生
Arachis
Hypogaealinn.
球形褐色
J14
2009
10.22
元江县元江河边
N23°60992′
E102°00173′
382
20
70
河边沙滩上,光照强,土壤沙质,周围为芦苇丛
兵豆
LensculinarisMedic.
球形黄色
3研究区域概况及研究方法
3.1研究区域概况
元谋位于云南中北部,东经101°35′—102°06′,北纬25°23′—26°06′之间。
东倚武定,南接禄丰,西邻大姚,北连四川会理;西南与牟定接壤,西北与永仁毗邻。
最大纵距82公里、横距42公里,总面积2021.69平方公里。
其中,坝区面积占55.7%,山区占44.3%,海拔1087米,。
元谋盆地是金沙江干热河谷的典型代表,年平均降雨量613.7mm,90%以上的降雨量集中在雨季(5—1O月份),年均蒸发量3426.3mm,年均相对湿度54%,无霜期350~365[30]属南亚热带干燥气候,年平均气温21.5℃,素有“天然温室”之称。
元谋干热河谷区水土流失严重,土壤肥力低,生态环境脆弱,近代不合理的开发利用使本区成为土壤退化严重的地区之一。
豆科牧草和灌木是元谋干热河谷的主要自然覆盖植被。
豆科牧草具有保持水土,改善土壤结构,增进土壤肥力等作用,对元谋干热河谷植被恢复具有重要作用。
元江干热河谷(23°00′~25°00′E,100°30′~103°30′N)是中国西南最典型的干热河谷,位于云南高原的中南部,西北至东南走向,河谷深陷,其西南一侧有与大江平行而高大的哀牢山和无量山脉.主要包括云南省的元江、红河、石屏等12个县市,其中最典型的是元江坝的干热河谷[31.32]。
高大山脉的屏障作用阻挡了来自孟加拉湾的西南暖湿气流,在河谷底部形成“焚风效应”.同时,河谷地形比较闭塞,降雨稀少,晴天较多,太阳辐射强度大,河谷底部受热剧烈,散热不易,造成了河谷区干燥、闷热的气候特征[32].另一方面,由于河谷各地的小环境,如土壤、地形以及人为干扰程度不尽相同,河谷区气候条件的局部差异较大,不同坡向、坡度的降雨量和气温存在较大差别.元江干热河谷区的年平均温度2317℃,最冷月平均气温1617℃,最热月平均气2816℃,≥10℃年积温达8708.9℃;干湿季节分明,干季为11月~翌年4月,雨季为5月~10月;年平均降水80511mm,其中81%的降雨集中在雨季[33.34].
3.2样品采集
2009.9.15~2009.9.18赴元谋干热河谷地区采集,2009.10.20~2009.10.23赴元江干热河谷地区采集豆科树种根瘤样品。
在两地共采集到22份根瘤样品,其中元谋8种(见表3-1)、元江14种(见表3-2)。
采集方法如下:
用铁铲刨取豆科植物根系(主根或侧根),用枝剪将生长着的根瘤菌剪下,如根瘤紧贴主根生长时,用尖刀将根瘤连同主根组织一起挖下(见附图
)。
小心地解开缠绕的部分,同时用纯净水洗去粘在根系上砂粒或土粒,注意不要扭伤根,将根瘤装入充满甘油(50%)的试管中,封口编号。
并记录采集时间、地点、生态植被、土壤类型、水分条件等情况。
带回实验室后于4℃冰箱保存待用。
表3-1元谋采集样品一览表
编号
时间
地点
海拔
(m)
温度
(℃)
湿度
(%)
生境
宿主
根瘤特征
M1
2009
9.16
元谋县能禹镇
凤仪村
N25°969617′
E101°85041′
1086
40
30
河滩沙石地中,与芝麻混种,光照强度高,土壤水分含量大
兵豆
Lens
culinarisMedic.
近球形
黄色
M3
2009
9.17
元谋县牛街村
N25°76342′
E101°84765′
1078
34
31
公路边大豆田中,光照充足,土壤为砖红壤,水分含量高,周围为番茄田
大豆
Glycineax
(Linn.)Merr
球形
M4
2009
9.17
元谋县黄瓜园镇河西村
N25°76203′
E101°83303
1060
38
47
河滩沙地上,水分含量高,光照充足,周围生长有桉树。
竹子
响铃豆
Crotalariaalbida
Heyne
不规则
M5
2009
9.17
元谋县黄瓜园镇河西村
N25°76216′
E101°83311′
1062
35
48
河边小山坡的草甸上,光照充足,土壤水分含量低
山蚂蝗属
DesmodiumDesv
球形黑色
M6
2009
9.17
元谋县黄瓜园镇河西村
N25°76216′
E101°83311′
1060
34
48
河滩沙地上,水分含量高,光照充足,周围生长有桉树。
竹子
小叶三点金
Desmodiummicrophyllum(Thunb.)DC
球形黄色
M7-1
2009
9.17
元谋县黄瓜园镇河西村
N25°76216′
E101°83311′
1060
38
47
河滩沙地上,水分含量高,光照充足,周围生长有桉树。
竹子
银合欢
Leucaenaglauca(L.)Benth.
球形黑色
续表3-1
编号
时间
地点
海拔
(m)
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