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Red同源重组在大肠杆菌基因敲除中的应用
Red同源重组在大肠杆菌基因敲除中的应用
吕沈聪,赵颖颖,钟卫鸿
【摘要】大肠杆菌基因敲除技术发展迅速,各种新型技术的出现使得其基因组的改造较以往更为快速、简单,尤其是Red同源重组技术在大肠杆菌基因敲除中的应用已经越来越成熟。
综述了几种不同的Red同源重组技术,并分析了每种方法的原理及操作策略,指出了各种方法的特点及优势。
【期刊名称】化学与生物工程
【年(卷),期】2013(030)006
【总页数】6
【关键词】大肠杆菌;Red同源重组;基因敲除
随着多种细菌基因组测序工作的完成,获得了大量的分子遗传学信息。
然而对分子遗传结构以及其中编码基因的了解却很有限。
基因突变提供了一种了解单个基因功能的方法。
基因的修饰以及修饰后细菌表型的研究对于功能基因组学的发展尤为重要。
20世纪80年代以来,生物学家发展了一种新型分子生物学技术——基因敲除。
至今已涌现出多种不同的基因敲除技术[1-3],广泛应用于分子生物学、医学细胞生物学、食品发酵工程等多个领域,展现出极大的发展空间。
大肠杆菌作为分子生物学的重要研究对象,是生产重组蛋白、氨基酸、有机酸等昂贵物质的主要微生物。
通过修饰大肠杆菌的基因组,改变其代谢途径,以发酵生产有用物质,已成为国内外研究的热点。
作者在此简要介绍了近几年发展的几种不同的Red同源重组技术及其在大肠杆菌基因敲除中的应用。
1Red同源重组作用机理
长的同源臂,往往长达几百个碱基,而且同源重组效率低,往往不能得到所需的重组子。
1998年,Murphy[4]首次报道了利用λ噬菌体Red同源重组系统在大肠杆菌中进行基因修饰的方法,将λ噬菌体的重组功能基因exo、bet、gam克隆到质粒pTP223上,用于野生型大肠杆菌宿主的基因替换。
Red同源重组又称ET重组[5],它不依赖宿主本身的重组系统,编码Exo、Beta、Gam3种蛋白质。
Exo蛋白是λ核酸外切酶,可以结合在双链DNA的末端,从5′端向3′端降解DNA单链,产生3′突出末端[6]。
bet基因编码的Beta蛋白可以介导互补链之间的退火[7-10]。
gam基因编码一个分子量为16000Da的多肽,该多肽可与宿主RecBCD核酸外切酶结合,抑制核酸外切酶活性,防止外源DNA进入细胞后被宿主降解[11,12]。
这3种蛋白协同作用,促进同源重组的发生。
该方法以其较短的同源臂、较高的重组效率等特点广泛应用于大肠杆菌的基因敲除中。
大肠杆菌基因敲除的传统方法是利用其自身的RecA同源重组系统编码的RecA和RecBCD蛋白介导DNA的同源重组。
但是以该系统为基础的基因打靶存在较多的缺点:
首先,由于RecBCD具有核酸外切酶活性,线性的打靶DNA将被降解,打靶基因必须整合于载体上才能进行同源重组;其次,打靶片段需要较
2几种不同的Red同源重组技术
2.1两步同源重组法
2000年,Datsenko等[13]提出了两步同源重组法在大肠杆菌K-12中进行基因敲除的策略。
该方法以pKD46[14]作为同源重组质粒,该质粒为低拷贝温敏型质粒,具有氨苄抗性,并将噬菌体的exo、bet、gam基因整合于阿拉伯糖启动子控制下;质粒pKD3和pKD4为打靶DNA的获得提供模板,分别带有氯霉素和卡那霉素抗性基因,并赋有FRT位点[15](翻转酶结合位点);pCP20质粒含有flippase基因[15],表达的FLP翻转酶可以与FRT位点结合并消除抗性基因片段。
方法:
第一步,将一段含有FRT位点的抗性基因置换入宿主染色体待敲除区域;第二步,将质粒pCP20电转化入宿主细胞,利用其表达的FLP翻转酶将抗性基因敲除。
将pKD46转化入宿主菌中,使其能够表达λRed重组酶。
以pKD3或pKD4为模板,PCR合成一段两端与目的基因同源、中间含有抗性基因的双链打靶DNA[16]。
将该片段电转化[17]入宿主细胞。
L-阿拉伯糖诱导重组酶的表达,在重组蛋白的作用下,打靶DNA和细菌染色体基因的同源处发生交换,将抗性基因置换入宿主染色体,使其获得相应抗性。
复苏后抗性平板筛选得到突变子。
将质粒pCP20电转化入宿主,利用其表达的FLP翻转酶将染色体上的抗性基因敲除[14],得到重组框架正确的突变株,如图1所示。
以敲除大肠杆菌K-12的lac操纵子为例[13],敲除前后基因的序列结构如图2所示。
分别以pKD3和pKD4为模板,PCR得到打靶DNA,将打靶片段电转化入宿主细胞,在重组酶的作用下完成同源重组。
抗性平板筛选转化子。
转化子用各自位点特异性引物验证,证明得到的转化子获得了预期大小的重组结构。
测序结果表明lacZYA片段已经被准确敲除,留下完整的lacI片段。
应用该敲除系统,美国普渡大学在大肠杆菌中成功敲除了40多个基因[13]。
该方法所需要的打靶同源臂短,只需36~50bp,因此可以直接设计在引物上,而不需要DNA酶切和连接等程序,大大加快了实验进程。
两步同源重组法操作简单、实验周期短、打靶精确度高,是目前大肠杆菌基因敲除领域应用最为常见的方法。
但该方法需要将外源DNA电转化入宿主细胞,因此对DNA片段的浓度以及感受态的效率要求较高。
然而某些菌株对外源DNA的吸收效率不高,进入细胞的DNA量往往不足以进行同源重组。
同时,电转化会导致大量细胞死亡,只有很少部分宿主细胞能存活[18]。
导致两步同源重组法在这些菌株中未能实现成功敲除。
2.2双质粒基因敲除法
双质粒基因敲除法包含一个辅助质粒和一个供体质粒。
供体质粒为打靶DNA提供来源,辅助质粒含有重组酶和归巢内切酶基因。
将两种质粒共转化入宿主细胞,在诱导剂的作用下,归巢内切酶切割供体质粒产生打靶DNA,重组酶促进同源基因序列完成重组。
2.2.1Genegorging法
Genegorging法由Herring等[18]在2003年报道,供体质粒为高拷贝质粒,常用的构建骨架为pUC19、pACYC184、pDHA30、pCR-BluntⅡ-Topo。
通过酶切方法将打靶序列以及归巢内切酶酶切位点(I-SceI归巢内切酶识别的长18bp的特异序列)克隆于质粒上。
I-SceI识别位点位于打靶序列两侧。
辅助质粒pACBSR上整合了表达Red重组酶和I-SceI内切酶的基因。
在阿拉伯糖诱导下,表达的I-SceI内切酶特异性切割供体质粒,产生打靶DNA。
同时,Red重组酶则促进打靶DNA与宿主染色体同源序列之间的重组,实现基因敲除。
Genegorging法不同于两步同源重组法,其打靶片段不需要外源转化,而是在宿主细胞内产生。
质粒在宿主内大量复制,通过归巢内切酶的切割,导致每个细胞都产生打靶DNA,数量大大增加,提高了可能发生同源重组的细胞基数。
据报道,在不使用任何筛选标记的条件下,该方法筛选到突变株的概率达到1%~15%[18]。
某些大肠杆菌病原菌对于外源DNA的吸收效率低,运用两步同源重组法很难得到重组子。
Genegorging法不依赖于外源DNA的转化,适合于在这些菌株中进行基因敲除的尝试。
2.2.2Genedoctoring法
Genedoctoring法包含供体质粒pDOC以及辅助质粒pACBSCE,原理与Genegorging法类似,但在其基础上增加了筛选条件,提高了筛选率。
供体质粒pDOC来源于pEX100T[19],整合了打靶基因的左右同源臂以及卡那霉素抗性基因,同源臂两侧为归巢内切酶酶切位点,此外还携带sacB基因[19]。
辅助质粒pACBSCE含有受阿拉伯糖调控的λ-Red重组酶基因和I-SceI内切酶基因。
在L-阿拉伯糖的诱导下,两种酶在细胞内表达。
I-SceI内切酶切割pDOC产生线性DNA打靶片段,同时也切割pACBSCE,使该质粒逐渐消失,防止因λ-Red重组酶的过量表达导致染色体二次修饰[20-22]。
在重组酶的作用下,线性打靶DNA和染色体的同源区发生交换,将卡那霉素抗性基因置换到宿主基因组上。
菌液涂布于含有卡那霉素和蔗糖的LB琼脂培养基上生长,筛选重组子。
sacB基因的存在,使得含有供体质粒的菌株无法在含有蔗糖的培养基上存活,因为sacB基因表达的酶会水解蔗糖生成高分子果糖聚合物毒害宿主细胞。
因此只有携带抗性基因、并且不含质粒pDOC的重组子才能在该培养基上生长,避免了假阳性转化子的产生。
FLP翻转酶敲除筛选得到重组子的抗性片段,如图3所示。
Lee等将pDOC-C和pACBSCE分别电转化入不同E.coli菌株K-12MG1655[23]、EHECO157:
H7Sakai和UPECCFT073[24]中,应用Genedoctoring法对基因Rsd和Yocl进行敲除(表1)。
在含有卡那霉素和蔗糖的培养基上长出大量转化子。
PCR验证发现,绝大多数的克隆拥有正确的重组框架,并且超过90%的克隆对氨苄青霉素和氯霉素敏感,表明pDOC质粒和pACBSCE质粒已经在细胞中消除。
其中一个克隆经PCR验证,发现其待敲除部分基因框架与野生型的一样,估计是卡那霉素基因插入到了该菌株染色体的其它部位。
应用Genedoctoring法在这些菌株中进行敲除实验,可以得到150个以上遗传重组框架正确的突变子。
Lee等[19]比较了应用pACBSCE与Genegorging法中的pACBSR分别进行基因敲除的同源重组效率(表2)。
应用pACBSR作为重组质粒能够得到更多具备卡那霉素抗性、对蔗糖不敏感的重组子,其中丢失pDOC质粒的克隆数跟应用pACBSCE质粒所得到的克隆数持平,但是其中大部分克隆仍含有pACBSR,只有很小部分消除了该重组质粒。
这就导致宿主细胞会过多地暴露于重组蛋白的作用下而发生二次重组,需要另外将其从宿主中消除[10,25,26]。
因此选用pACBSCE质粒更合适。
Genedoctoring法已经成功应用于各类大肠杆菌的基因敲除,包括一些运用两步同源重组法很难敲除的致病菌。
该方法不仅继承了Genegorging法高打靶效率的优点,并且增加了筛选标记,在完成基因敲除的同时消除了同源重组辅助质粒,提升了筛选效率。
2.3单质粒敲除法
单质粒敲除法由Yu等[27]于2008年首次报道。
该方法的特点在于只需单个质粒即可完成宿主基因组的修饰,并且在染色体上不留残余序列,重组效率高。
质粒pREDI[27](图4)携带有2个独立的启动子:
一个为阿拉伯糖启动子,可诱导λ-Red重组蛋白表达,介导带标记的线性DNA打靶片段与目的基因区域的置换;另一个为鼠李糖启动子,诱导I-SceI归巢内切酶的表达,切割基因组,促进双链断裂实现分子内重组。
剔除筛选标记后,完成基因组的修饰。
图5为应用质粒pREDI快速无痕敲除策略示意图。
为了敲除大肠杆菌基因组A区与C区之间的基因片段,通过PCR克隆出包含正筛选标记(CmR)、负筛选标记(sacB)、1个归巢内切酶酶切位点和3段同源区(A-C)的线性DNA打靶片段。
将线性DNA打靶片段电转化入含有质粒pREDI的大肠杆菌中,涂布于含有阿拉伯糖的培养基上生长。
在pREDI表达的重组酶作用下,打靶片段与目的基因发生置换。
将菌株从含有10mmol·L-1阿拉伯糖的培养基转移到含有10mmol·L-1鼠李糖的培养基中,诱导I-SceI归巢内切酶的表达。
归巢内切酶切割染色体上的I-SceI酶切位点,形成DSB(双链断裂模型)[28-30]。
DSB介导两个同源区(boxC)之间的重组,去除外源整合片段,达到无痕修饰的目的。
I-SceI归巢内切酶作用于细胞染色体上的酶切位点使DNA双链断裂,导致细胞死亡,因此只有去除了整合位点、修复了缺口、形成了正确突变结构的细胞才能存活。
据报道,该方法的敲除成功率达到70%~100%[27]。
单质粒敲除法只需单个质粒pREDI就可成功进行基因组上的突变,完成一次敲除只需要2d,而且突变菌株染色体上不留任何痕迹。
相比于之前的方法有了更大的进步,适用于一系列的基因修饰工作,例如在大肠杆菌或其它革兰氏阴性菌株中进行基因的点突变、基因定点插入等。
3结语
两步同源重组法所需同源臂短,不需要构建于载体上,非常适合应用于常见大肠杆菌的基因敲除,例如K系列菌株,对外源DNA的吸收效率较高,打靶成功率大。
Genegorging法不含筛选标记,因此在某些情况下筛选工作较大、实验周期长。
基于Genegorging的Genedoctoring法以高打靶率、高筛选率等优点逐渐应用于各类致病菌的基因敲除,例如EHECO157:
H7Sakai和UPECCFT073等,它们对外DNA吸收效率低,运用两步同源重组法很难成功。
单质粒敲除法实验周期短、打靶效率较高,也逐渐应用于各类大肠杆菌的基因修饰工作中。
作为与人类最为密切的微生物,大肠杆菌的代谢工程研究意义重大。
通过修饰其基因组,使其获得新的优良性状和生产能力是目前国内外研究的热点。
Red同源重组技术的诞生为大肠杆菌染色体的修饰提供了强有力的工具,是基因工程领域的一场革命。
而且该技术在其它细菌中成功进行基因敲除的报道也越来越多。
作为一项高效基因打靶技术,Red同源重组技术的应用领域将会越来越广,有望为基因功能的改良及后基因组时代功能研究作出巨大贡献。
参考文献:
[1]RussellCB,ThalerDS,DahlquistFW.ChromosomaltransformationofEscherichiacolirecDstrainswithlinearizedplasmids[J].JournalofBacteriology,1989,171(5):
2609-2013.
[2]HamiltonCM,AldeaM,WashburnBK,etal.NewmethodforgeneratingdeletionsandgenereplacementsinEscherichiacoli[J].JournalofBacteriology,1989,171(9):
4617-4622.
[3]LinkAJ,PhillipsD,ChurchGM.Methodsforgeneratingprecisedeletionsandinsertionsinthegenomeofwild-typeEscherichiacoli:
Applicationtoopenreadingframecharacterization[J].JournalofBacteriology,1997,179(20):
6228-6237.
[4]MurphyKC.UseofbacteriophageλrecombinationfunctionstopromotegenereplacementinEscherichiacoli[J].JournalofBacteriology,1998,180(8):
2063-2071.
[5]MuyrersJPP,ZhangYM,StewartAF.Techniques:
Recombinogenicengineering-newoptionsforcloningandmanipulatingDNA[J].TrendsinBiochemicalSciences,2001,26(5):
325-331.
[6]PoteeteAR.WhatmakesthebacteriophagelambdaRedsystemusefulforgeneticengineering:
Molecularmechanismandbiologicalfunction[J].FemsMicrobiologyLetters,2001,201
(1):
9-14.
[7]CopelandNG,JenkinsNA,CourtDL.Recombineering:
Apowerfulnewtoolformousefunctionalgenomics[J].NatureReviewsGenetics,2001,2(10):
769-779.
[8]MuniyappaK,ShanerSL,TsangSS,etal.MechanismoftheconcertedactionofrecAproteinandhelix-destabilizingproteinsinhomologousrecombination[J].ProceedingsoftheNationalAcademyofSciencesoftheUnitedStatesofAmerica,1984,81(9):
2757-2761.
[9]TakahashiN,KobayashiI.Evidenceforthedouble-strandbreakrepairmodelofbacteriophagelambdarecombination[J].ProceedingsoftheNationalAcademyofSciencesoftheUnitedStatesofAmerica,1990,87(7):
2790-2794.
[10]EllisHM,YuD,DiTizioT,etal.Highefficiencymutagenesis,repair,andengineeringofchromosomalDNAusingsingle-strandedoligonucleotides[J].ProceedingsoftheNationalAcademyofSciencesoftheUnitedStatesofAmerica,2001,98(12):
6742-6746.
[11]MurphyKC.LambdaGamproteininhibitsthehelicaseandchistimulatedrecombinationactivitiesofEscherichiacoliRecBCDenzyme[J].JournalofBacteriology,1991,173(18):
5808-5821.
[12]WarmingS,CostantinoN,CourtDL,etal.SimpleandhighlyefficientBACrecombineeringusinggalKselection[J].NucleicAcidsResearch,2005,33(4):
e36.
[13]DatsenkoKA,WannerBL.One-stepinactivationofchromosomalgenesinEscherichiacoliK-12usingPCRproducts[J].ProceedingsoftheNationalAcademyofSciencesoftheUnitedStatesofAmerica,2000,97(12):
6640-6645.
[14]DoubletB,DouardG,TargantH,etal.AntibioticmarkermodificationsoflambdaRedandFLPhelperplasmids,pKD46andpCP20,forinactivationofchromosomalgenesusingPCRproductsinmultidrug-resistantstrains[J].JournalofMicrobiologicalMethods,2008,75
(2):
359-361.
[15]BroachJR,HicksJB.Replicationandrecombinationfunctionsassociatedwiththeyeastplasmid,2μcircle[J].Cell,1980,21
(2):
501-508.
[16]CourtDL,SawitzkeJA,ThomasonLC.Geneticengineeringusinghomologousrecombination[J].AnnualReviewofGenetics,2002,36:
361-388.
[17]OrkinS.Molecular-Cloning——ALaboratoryManual,2ndEdition-SambrookJ,FritschEF,ManiatisT[J].Nature,1990,343(6259):
604-605.
[18]HerringCD,GlasnerJD,BlattnerFR.Genereplacementwithoutselection:
RegulatedsuppressionofambermutationsinEscherichiacoli[J].Gene,2003,311:
153-163.
[19]LeeDJ,BingleLEH,HeurlierK,etal.Genedoctoring:
AmethodforrecombineeringinlaboratoryandpathogenicEsche-richiacolistrains[J].BMCMicrobiology,2009,9:
252.
[20]HobmanJL,PatelMD,Hidalgo-ArroyoGA,etal.ComparativegenomichybridizationdetectssecondarychromosomaldeletionsinEscherichiacoliK-12MG1655mutantsandhighlightsinstabilityintheflhDCregion[J].JournalofBacteriology,2007,189(24):
8786-8792.
[21]PoteeteAR,FentonAC,NadkarniA.ChromosomalduplicationsandcointegratesgeneratedbythebacteriophagelamdbaRedsysteminEscherichiacoliK-12[J].BMCMolecularBiology,2004,5:
22.
[22]MurphyKC,CampelloneKG.LambdaRed-mediatedrecombinogenicengineeringofenterohemorrhagicandenteropathogenicE.coli[J].BMCMolecularBiology,2003,4:
11.
[23]BlattnerFR,PlunkettG3rd,BlochCA,etal.ThecompletegenomesequenceofEscherichiacoliK-12[J].Science,1997,277(5331):
1453-1462.
[24]WelchRA,BurlandV,PlunkettG,etal.Extensivemosaicstructurerevealedbythecompletegenomesequenceofuropathogeni
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