膝骨性关节炎患者关节液中MMP7MMP9TIMP1TNFα的表达及意义.docx

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膝骨性关节炎患者关节液中MMP7MMP9TIMP1TNFα的表达及意义

膝骨性关节炎患者关节液中MMP―7、MMP―9、TIMP―1、TNF―α的表达及意义

　　[摘要]目的观察并探讨膝关节骨性关节炎患者膝关节液中MMP-7、MMP-9、TIMP-1、TNF-α水平与病变程度的关系。

方法膝关节骨性关节炎患者97例，根据患者的X线片，把OA的严重程度分为0～Ⅳ级，并进行WOMAC骨关节炎指数评分，检测膝关节液中MMP-7、MMP-9、TIMP-1蛋白表达量及TNF-α水平，以健康志愿者10例为正常对照组。

结果骨性关节炎患者膝关节液中MMP-7、MMP-9、TIMP-1、TNF-α水平均高于正常对照组（P<0.05），随着病变程度加重，膝关节液中MMP-7、MMP-9、TIMP-1、TNF-α水平显著增加。

结论MMP-7、MMP-9、TIMP-1、TNF-α水平在骨性关节炎患者膝关节液中均升高，与病变程度密切相关，检测这些指标有助于对膝关节骨性关节炎病情的判断。

　　[关键词]骨性关节炎；膝关节；基质金属蛋白酶；肿瘤坏死因子α

　　[中图分类号]R684[文献标识码]A[文章编号]2095-0616（2015）22-11-05

　　膝关节骨性关节炎（KOA）是一种多见于中老年人的多发病、常见病。

它的病理特征是膝关节软骨不断褪变、软骨下骨的病变、骨赘逐渐形成的退行性骨关节病变。

但是，迄今为止，其具体的发病机理仍然没有阐明。

近年来，国内外大量研究发现基质金属蛋白酶（MMPs）、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）的表达及活性与OA发病机制之间存在着密切的关系。

目前对于MMP-7、MMP-9在骨性关节炎患者中的表达研究较少。

因此，在本研究中，我们研究各个阶段膝关节骨性关节炎的临床表现、相关的分子生物学代谢的改变，以寻找疼痛、僵硬、活动功能等临床指标基质金属蛋白酶-7、-9、TNF-α、TIMP1等指标的相关性，从而客观评估MMP-7、MMP-9、TIMP1、TNF-α和以及WOMAC骨关节炎指数在骨性关节炎诊断中的意义及价值，从而为找到早期、敏感、准确的膝关节骨性关节炎的诊断方法而做出探索。

　　1资料与方法

　　1.1一般资料

　　1.1.1骨性关节炎组

　　共97例，病例均来源于2013年10月～2014年3月就诊于广东省第二中医院骨伤一科门诊及住院部的患者，均符合骨性关节炎的诊断标准。

根据患者的x线片，以Kellgren和Lawrence影像学分级量化标准，把OA的严重程度分为0～Ⅳ级：

0级，正常；Ⅰ级，关节腔间隙≥7mm，关节表面骨赘形成；Ⅱ级，关节腔间隙4～7mm，有明显骨赘；Ⅲ级，关节腔间隙≤4mm，有中等量骨赘；Ⅳ级，关节腔间隙消失，有大量骨赘。

入选患者97例，其中Ⅰ级者33例，Ⅱ级者28例，Ⅲ级者20例，Ⅳ级者16例。

　　1.1.2正常人组

　　共10例，来源于2013年10月～2014年3月于广东省第二中医院骨伤一科门诊自愿接受膝关节液检查的健康体检者。

无关节炎和其他感染性疾病，肝肾功能等指标均正常。

　　1.2诊断标准

　　1.2.1西医诊断标准西医诊断标准参照1995年美国风湿病学院推荐的膝关节骨关节炎的诊断标准。

　　1.2.2影像学分级采用Kellgren和Lawrence影像学分级量化标准。

　　1.2.3膝骨关节炎临床严重度分级采用、美国西部Ontario和McMaster大学骨关节炎指数评分（WOMAC骨关节炎指数评分）。

包括疼痛、僵直、进行日常活动的难度，共三方面症状评分，以3项评分之和为WOMAC骨关节炎总指数。

　　1.3纳入标准

（1）年龄在40～70岁。

（2）符合上述诊断标准。

（3）排除合并有其他系统疾病者。

（4）对研究意义有正确认识，有良好的依从性者，并签署知情同意书。

　　1.4排除标准

（1）患者年龄在35岁以下或者在69岁以上者。

（2）不符合骨性关节炎诊断标准者。

（3）妊娠或哺乳期妇女。

（4）合并有重要脏器功能障碍及精神病患者等。

（5）合并骨结核等骨病以及急性创伤等患者。

（6）膝关节感染、皮肤破损、溃烂等不适应进行关节穿刺者。

（7）不能配合研究或不同意参加本研究者。

（8）正在参加其他临床试验的患者。

　　1.5研究方法1.5.1观察内容

（1）一般资料：

受试者姓名、年龄、性别、病程等。

（2）膝关节影像学特点：

膝X线特点，膝关节局部状况和全身的情况。

（3）WOMAC骨关节炎指数评分（包括疼痛、僵硬、进行日常活动的难度）。

（4）关节液中MMP-7、MMP-9、TIMP-1及TNF-α的含量。

　　1.5.2主要的实验仪器设备及试剂

　　酶标仪（芬兰，MK352型），冷冻高速离心机（SIGMA），ELISA试剂盒（美国R&DSystems公司）等。

　　1.5.3标本（关节液）的采集与保存受试者采用仰卧位，膝关节伸直体位放置，取大腿股四头肌外侧缘与髌骨上缘连线交汇处作为穿刺点，75%医用乙醇常规消毒穿刺部位，选用5mL注射器进行穿刺，当穿刺针头进入膝关节腔内，感觉有落空感时，抽取膝关节液0.5～2mL，注入含肝素试管内。

采集标本后2h内，离心，快速冷冻，置于-80%超低温冰箱保存。

　　1.5.4含量测定采用双抗体夹心法测定基质金属蛋白酶及金属蛋白酶组织抑制因子（MMP-7、MMP-9、TIMP-1）的含量；采用双抗夹心ABC-ELISA法测定膝关节液TNF-α的含量。

严格按试剂盒说明书步骤进行。

　　1.6统计学方法

　　采用统计软件SPSS13.0处理所得数据，计量资料用（x±s）表示，选用成组t检验分析OA患者及健康对照组MMPs、TIMP-1蛋白及其比值等指标的差异；WOMAC骨关节炎指数分级与MMPs、TIMP-1蛋白及其比值等指标的相关性、x线等级与关节液中MMPs、TIMP-1蛋白及其比值等指标的相关性用Spearman相关的统计分析，以P　　2结果

　　2.1两组关节液中MMP-7、MMP-9、TIMP-1含量、比值及TNF-α含量比较

　　所有关节炎组关节液中均可检测到MMP-7、MMP-9、TIMP-1、TNF-α。

各级膝关节关节炎组关节液中MMP-7、MMP-9、TIMP-1、TNF-α含量与正常人组比较，差异有统计学意义（P<0.05），表明各级膝关节关节炎组患者关节液中MMP-7、MMP-9、TIMP-1、TNF-α含量均高于正常人关节液中相应的含量。

MMP-7/TIMP-1、MMP-9/TIMP-1比值在各级膝关节炎组患者与正常人组之间的比较，差异有统计学意义（P<0.05）。

这表明膝关节骨性关节炎患者膝关节液中MMP-7/TIMP-1、MMP-9/TIMP-1均高于正常人。

见表1～3、图1～2。

　　2.2膝骨关节炎严重度指数与关节液中MMP-7、NIMP-9、TIMP-1含量及比值

　　按照膝关节骨l生关节炎严重度指数的分类标准，可以分为轻度、中度、重度、非常或及其严重4个等级，膝关节关节液中MMP-7、TIMP-1、MMP-7/TIMP-1与膝关节骨性关节炎严重度指数的相关性，经Spearman相关分析，膝关节骨性关节炎严重度4个等级与MMP-7、TIMP-1及其比值的相关系数rs分别为0.726、0.708、0.689，且P均<0.05。

见表4、图3。

　　关节液中MMP-9、TIMP-1、MMP-9/TIMP-1与膝关节骨性关节炎严重度指数的关系，膝关节骨性关节炎严重度4个等级与MMP-9、TIMP-1及其比值的相关系数rs分别为0.764、0.708、0.629，且P均<0.05。

见表5、图3。

　　2.3膝骨关节炎严重度指数与关节液中TNF-α含量的关系

　　经等级相关分析，膝骨关节炎严重度指数与TNF-α之间的等级相关系数rs=0.800，P=0.000，即随着膝骨关节炎严重程度越高，TNF-α量就越高。

见表6、图4。

　　3讨论

　　3.1膝关节骨性关节炎的早期诊断

　　目前，临床上对膝关节骨性关节炎的诊断主要依靠患者临床症状、体征、X线、磁共振等检查和传统的实验室检查，但这些检查不仅从时间上滞后于膝关节骨性关节炎病情的发展，而且缺乏特异性好灵敏l生。

一旦患者出现影像学改变时，其膝关节功能已经受到了严重的、不可逆的影响。

因此，早诊断、早治疗对于膝关节骨l生关节炎的预防和治疗意义尤为重要。

　　在本研究中，我们选取MMP-7、MMP-9、TIMP-1，TNF-α这些指标，来研究它们与膝关节骨性关节炎的关系，在探索膝关节骨性关节炎的诊断方面做出努力。

　　3.2膝关节骨性关节炎评价量表的选择

　　关于膝关节的评分标准，目前国际上常用的有很多种，包括美国西部Ontario和McMaster大学骨关节炎指数评分（WOMAC骨关节炎指数评分）、Lysholm评分、美国特种外科医院膝关节评分（HSS评分）、美国骨科协会膝关节评分（AAOS评分）、美国膝关节协会评分（AKS评分）、国际膝关节文献委员会膝关节评估表（IKDC评分）、美国骨科协会膝关节评分（AAOS评分）、膝关节损伤和骨关节炎评分（KOOS）等。

每种评分的侧重点、适用范围、评估的内容都不尽相同，在临床及研究中要针对研究的目的而进行仔细甄别选用。

其中，在骨性关节炎及类风湿性关节炎的研究中，WOMAC评分使用较多。

该评分评价膝关节的结构和功能是从以下三个方面来评估的：

疼痛、僵硬和关节功能。

WOMAC评分三方面中，功能评估的可靠性最高最高，为92%，疼痛评估为74%，僵硬评估的可靠性为58%。

该量表是国际上通用的评价膝关节骨性关节炎的评量表具有很高的重测信度。

因此，在本实验中，我们选取WOMAC骨关节炎指数作为评估膝关节骨性关节炎严重度的指数。

　　3.3膝关节oA早期诊断与MMP-7、MMP-9、TIMP-1

　　膝关节是人体最复杂的关节，由于它的运动量多、负重量大，因此膝关节骨性关节炎的发病率比较高，可占全身各骨性关节炎的31%。

随着人口老龄化进程的加速，膝关节骨性关节炎的发病率呈不断攀升的趋势，成为一种影响中老年人身体健康的隐形“杀手”，到了病程的晚期还可出现致残膝关节骨性关节炎的病理改变主要发生在关节的关节软骨，构成关节细胞外基质的主要成分基质胶原和蛋白多糖，软骨基质的完整性对于维持组织力学的特性非常重要。

　　基质金属蛋白酶（MMPs）的发现已有40多年的历史，但基质金属蛋白酶在关节炎中的作用研究最近几年才为研究者所重视。

基质金属蛋白酶能够降解绝大多数的软骨细胞外基质，广泛分布于结缔组织中，是一种结构相似的蛋白酶家族。

基质金属蛋白酶抑制剂（TIMP）通过对MMP的抑制来调节细胞外基质的代谢过程，保护软骨免受破坏。

正常软骨中基质金属蛋白酶和基质金属蛋白酶抑制剂的分泌保持平衡状态，二者的失衡可能是软骨退变的机制。

在KOA的病理过程中，关节的滑膜细胞与软骨细胞均受到累及，二者分泌过多的MMPs，MMPs/TIMP的平衡被破坏。

在各种因素的作用下，膝关节关节软骨的抗应力能力逐渐下降，关节软骨细胞不断发生凋亡，关节软骨中的细胞外基质成分游离，从而导致了软骨破坏的发生。

　　本研究结果显示发现，各级膝关节OA患者关节液中MMP-7、MMP-9、TIMP-1的含量与正常人比较，P<0.05，差异有统计学意义，表明各级膝关节OA患者关节液中MMP-7、MMP-9、TIMP-1蛋白含量均高于正常人。

MMP-7/TIMP-1、MMP-9/TIMP-1比值在各级膝关节OA患者与正常人之间比较，差异有统计学意义（P<0.05），表明膝关节骨性关节炎患者MMP-7/TIMP-1、MMP-9/TIMP-1均高于正常人。

因此，MMP-7、MMP-9、TIMP-1可以作为膝关节骨性关节炎的生物学标记物，可以作为早期诊断膝关节骨性关节炎的标志性酶。

本研究中还发现，MMP-7、MMP-9在OA中出现的峰值时期不同，二者具有表达的不同步性。

MMP-7在膝关节OA的后期逐步升高，而MMP-9在早、中期的表达明显增高。

对照出MMP-7、MMP-9表达增多的不同步性，相对于MMP-7而言，膝关节炎骨性关节炎患者关节液中的MMP-9能够更早、更及时的反映OA的病理性改变，可作为OA早期检测诊断的一个重要指标。

　　3.4膝关节早期诊断与TNF-α

　　肿瘤坏死因子-α（TNF-α）参与并介导了人体内的多种炎症过程，是体内主要的炎性细胞因子之一。

TNF-α对关节炎的病程产生作用是从以下两个方面发挥作用：

降低软骨细胞合成和促进软骨分解。

肿瘤坏死因子-α能选择性地抑制关节软骨胶原的产生，抑制蛋白聚糖合成，同时促进蛋白聚糖的降解。

江锋等研究发现，肿瘤坏死因子-α直接参与了膝关节骨l生关节炎疾病的发生。

　　在本研究中，按照肿瘤坏死因子-α在膝关节液中的含量的高低对膝骨关节炎严重度进行排列：

非常或及其严重>严重>中度>轻度。

这种排列顺序表明，膝关节骨性关节炎程度越严重，TNF-α呈上升趋势。

TNF-α在OA患者关节液中较正常人有较高表达，并且与KOA病情严重度相关，在晚期尤为明显。

因此，TNF-α可以作为判断膝关节炎OA严重程度的一个重要指标。

　　3.5MMPs、TNF-α在膝关节骨性关节炎中相互作用

　　TNF-α能上调关节炎软骨中多种基质金属蛋白酶的表达，是关节炎软骨降解时重要的前炎症细胞因子。

TNF-α可以刺激滑膜与软骨细胞合成胶原酶与PGE2（前列腺素E2），刺激关节软骨细胞合成金属蛋白与丝氨酸蛋F1酶，从而产生关节软骨细胞外基质的降解作用。

在膝关节骨性关节炎中，肿瘤坏死因子-α究竟来源于软骨细胞还是骨膜组织，目前尚无定论。

在本研究中，同时对关节液中MMP-7、MMP-9、TNF-α进行检测，结果提示MMP-7、MMP-9、TNF-α的水平显著相关，究其原因，可能是三者存在同源关系，但是三者之间是否有协同作用、具体机制如何，还有待于在以后的研究中进一步探索。

　　（收稿日期：

2015-07-15）