第二篇第八章多聚酶链式反应.docx
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第二篇第八章多聚酶链式反应
第二篇技术篇
第八章多聚酶链式反应
1、基本原理PCR技术是在模板DNA、引物(人工合成)、Mg2+和4种脱氧核糖核苷酸(dNTP)存在的条件下,利用DNA聚合酶(Taq酶)催化作用,经过DNA变性、引物与模板结合(复性)和延伸的循环过程,体外大量扩增特异DNA片段。
(1)引物设计与合成设计合成一对与目的DNA片段两侧翼序列分别互补的寡核苷酸引物。
其中一引物与目的区段上游一条模板链的序列相互补,而另一引物与目的区段下游另一条模板链的序列相互补。
(2)DNA模板的变性加热或强酸、碱性作用可以使DNA双螺旋的氢键断裂,双链解离,形成单链DNA,这称为DNA的变性。
(3)模板与引物的结合(退火或复性)解除变性的条件后,变性的单链可以重新结合起来,形成双链,其原有的特性和活性可以恢复,这称DNA复性,也叫退火。
(4)引物延伸
将反应体系温度升到72℃左右,在Mg2+存在的条件下,Taq聚合酶催化dNTP按碱基互补原则连接在DNA引物3ˊ端(5’→3’方向延伸),使引物延伸,形成两条与模板互补的新链。
以上为一次PCR循环(变性、复性和延伸),新合成的链可作为下一轮循环的模板
PCR原理Flash演示
2、PCR反应体系与反应条件
(1)PCR反应体系
◆模板
单、双链DNA均可。
不能混有蛋白酶、核酸酶、DNA聚合酶抑制剂、DNA结合蛋白类。
DNA模板一般100ng/100L。
模板浓度过高会导致反应的非特异性增加。
◆引物浓度
0.1-0.5mol/L
浓度过高易导致模板与引物错配,反应特异性下降
◆TaqDNA聚合酶
0.5-2.5U/50l
酶量增加使反应特异性下降;酶量过少影响反应产量。
◆dNTP
dNTP浓度取决于扩增片段的长度
四种dNTP浓度应相等
浓度过高易产生错误碱基的掺入,浓度过低则降低反应产量,dNTP可与Mg2+结合,使游离的Mg2+浓度下降,影响DNA聚合酶的活性
◆Mg2+
Mg2+是DNA聚合酶的激活剂。
适宜浓度为0.5-2.5mmol/L反应体系。
Mg2+浓度过低会使Taq酶活性丧失、PCR产量下降;Mg2+过高影响反应特异性。
Mg2+可与负离子结合,所以反应体系中dNTP、EDTA等的浓度影响反应中游离的Mg2+浓度。
(2)反应条件3、引物的复性(退火)温度复性温度的选择可以根据引物的长度及其G+C的含量确定。
当长度在15~25bp时,引物的复性(退火)温度可以通过Tm=4(G+C)+2(A+T)计算得到。
在Tm允许范围内,Tm越高,PCR特异性越强。
4、PCR引物设计的一般原则
(1)序列应位于高度保守区,与非扩增区无同源序列。
(2)引物长度适宜,一般为15-30bp;(3)引物中G+C占40-60%;(4)碱基尽可能随机分布,尤其3’端不能以3个连续G或者3个连续C结束。
否则,会使引物在模板G十C富集区引发错误;(5)引物内部避免形成二级结构(不存在互补序列);(6)两引物间避免产生引物二聚体(互补碱基不超过4个);(7)引物3’端为关键碱基;5’端无严格限制;(8)引物3’端就不要终止于密码子的第三位,因为密码子的第三位易出现简并现象引物设计流程
Cytb基因全场扩增引物(通用)L147245’–GACTTGAAAAACCACCGTTG–3’H159155’–CTCCGATCTCCGGATTACAAGAC–3’
5、引物的5’端修饰PCR的延伸从两个引物的3’端开始,决定PCR产物的特异性。
而5’端则限定着PCR产物的长度。
对引物5’端进行修饰非但不影响正常的PCR,反而有助于对PCR产物的分析及进一步的操作。
6、未知序列的扩增
(1)锚定PCR(anchoredPCR,A-PCR)锚定PCR用于扩增已知一端序列的目的DNA。
在未知序列一端加上一段多聚dG(PolyG)的尾巴,然后分别用多聚dC(PolyC)和已知的序列作为引物进行PCR扩增。
锚定PCR帮助克服序列未知或序列未全知带来的障碍。
在未知序列未端添加同聚物尾序,将互补的引物连接于一段带限制性内切酶位点的锚上,在锚引物和基因另一侧特异性引物的作用下,将未知序列扩增出来
(2)简并引物PCR(degenerateprimerPCR,DP-PCR)所谓简并引物是指碱基序列不同,但有相同碱基数的一组针对某一基因相同区段的寡核苷酸混合物。
值得指出的是,由于次黄嘌呤可与任何碱基配对,因此在碱基高度简并位置可使用次黄嘌呤替代。
简并引物PCR主要用于仅知蛋白质部分序列而求知其编码基因序列的研究、寻找已知基因家族中新成员的研究等(4)单一特异引物PCR(singlespecificprimerPCR,SSP-PCR)用合适的限制性内切核酸酶酶切基因组DNA,将酶切片段与合适载体连接重组。
利用特异引物(与特异酶切片段一端互补)和通用引物(与载体特异互补)来扩增特异酶切片段。
(5)臆断引物PCR(arbitraryprimerPCR,AP-PCR)在温度等不严格的反应条件下,将臆断选择的一个非特异引物与待分析的模板DNA通过错配而复性。
如果该非特异引物能作为两个反向引物与模板DNA双链相距一定距离复性,那么经过PCR,两两反向引物所限定的DNA片段就会得到高效扩增。
通过对扩增产物的凝胶电泳分离,最后可以获得反映待分析基因组特征的指纹图。
7、其他常用的PCR技术
(1)逆转录PCR(reversetranscribedPCR,RT-PCR)以总RNA或mRNA为模板进行逆转录,然后再进行PCR扩增。
该法主要用于基因表达等研究。
(3)多重PCR(multiplexPCR)在同一试管中加入多对引物,扩增同一模板DNA的几个区段。
该法主要用于检测大基因上可能发生的多处缺失等突变。
(4)巢式PCR(nestedPCR)首先以第一对引物对模板进行扩增,即扩增靶基因中较大区域片段DNA,然后再以较大区域内的序列设计合成第二对引物。
再对模板进行PCR扩增,即扩增靶基因中较小区域片段DNA。
该法两次连续扩增模板靶基因,可进一步提高PCR检测的灵敏度和特异性。
该法特别适于微量模板的扩增。
8.PCR扩增中的常见问题、可能原因及解决办法
(1)没有扩增产物的可能原因及解决办法;
(2)酶失活或未加酶:
换新酶或加入酶;(3)模板样品含有杂质:
再行纯化;(4)模板变性不彻底,解链不完全:
提高校准变性温度或延长变性时间;(5)反应体系中有蛋白酶或核酸酶污染:
在加TaqDNA聚合酶之前,将反应体系于95℃加热10min;(6)引物存在问题:
重新设计引物,纯化引物;(7)试剂没有混匀:
严格操作规范,充分混匀反应体系。
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