叶绿素的光敏性质探究.docx

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叶绿素的光敏性质探究

叶绿素的光敏性质探究（与二氢卟吩e4对比）研究背景

光敏剂的光漂白（photobleaching是指在光的照射下，光敏剂所激发出来的荧光强度随着时间推移逐步减弱乃至消失的现象，这是光动力诊断临床应用中考虑光剂量和检测需用时间的一个重要因素。

长波红光在组织中具有较大的穿透深度，从而能保证足够的治疗深度：

大的吸光度能保证充分利用光能量和尽可能减少药物剂量；光敏剂吸光度的大小是决定药物剂量的理论依据。

过多的光敏剂分布于癌组织中势必会影响光的穿透深度，然而使用过少的光敏剂又不能产生应有的疗效。

因此，光敏剂的使用剂量要依据其吸光度的大小和肿瘤组织的大小来权衡。

对于同一种光敏剂，它的漂白时间将随入射光的光能流率的增大而减小。

再次，除了与光敏剂的类型有关外，还与初始浓度和入射光源的波长有关。

初始浓度越大，光漂白时间越长。

实验意义：

探究不同浓度的叶绿素在不同光源、不同时间的照射下，其吸光度随时间的变化，探测其光漂白特性，为更好地在临床应用上要保持光敏剂的有效杀伤浓度，且控制好光敏剂的激发时间，这样才能保证治疗的效果。

初步设想：

探究叶绿素在不同浓度，不同光源，不同光照时间对光的敏感性：

（1）用紫外检测得到叶绿素的紫外可见吸收光谱，与二氢卟吩e4的光谱图

比较。

（最好能同时测定荧光光谱）

（2）在叶绿素的最大吸收波长处检测浓度为0.05mg/ml，0.1mg/ml，0.2mg/ml，0.3mg/ml，0.4mg/ml的叶绿素的吸光度，并制作曲线图，验证其是否符合朗伯-比尔定律。

（3）实验设置了不同的六组光源：

白光、红外光、黄光、绿光、蓝光、紫外光，分别对0.4mg/ml的叶绿素待测样品进行垂直照射10min、20min、30min、40min、50min、60min、80min、100min,取照射后的各样品进行紫外-可见吸收光谱的检测，通过光谱的变化，探究光敏剂叶绿素明显的光漂白特性。

（4）另外，关于温度的影响关系实验，在恒温水浴锅里设置叶绿素溶液

（0.4mg/ml）的温度分别为7°C,17C,27C,37C,47C,57C，然后检测其吸光度，探究温度对吸光度的影响。

（5）量取1ml0.8mg/ml的叶绿素溶液分别加入1.0ml0.05mol/L的HCl溶液,1.0ml0.01mol/L的HCI溶液，1.0ml水，1.0ml0.01mol/L的NaOH溶液，1.0ml0.05mol/L的NaOH溶液,用pH计测定其pH值,再测定其在最大吸收波长下的吸光度,探究pH值对吸光度的影响。

仪器药品：

SHIMADZI生产的UV1700spectrophotometer（UV1700岛津分光光度计）、紫外灯、红光灯、黄光灯、绿光灯、蓝光灯、白光灯、罩灯的纸箱、插座、移液枪、石英比色皿、蒸馏水、擦镜纸、烧杯、4ml一次性试管（8支）、标签纸、容量瓶、黑色塑料袋、计时器、叶绿素（1mg/ml,0.4mg/ml,0.3mg/ml,0.2mg/ml,0.1mg/ml,0.05mg/ml）,0.5mol/LNaOH溶液，0.5mol/LHCl溶液

实验所需的药品预先配制好，配好的药品盛装在棕色细颈玻璃瓶中,避光低温保存在冰箱冷藏室。

实验步骤：

叶绿素的光敏性质实验

1.待测叶绿素溶液的配制

（1）1.0mg/ml叶绿素溶液

称取25mg叶绿素，用去离子水完全溶解，再定容至25ml；

（2）0.8mg/ml叶绿素溶液

移取8ml

（1）号溶液，用去离子水定容至10ml；

（3）0.4mg/ml叶绿素溶液

移取10ml

（1）号溶液,用去离子水定容至25ml；

（4）0.3mg/ml叶绿素溶液：

移取3ml

（1）号溶液，用去离子水定容至10ml;

（5）0.2mg/ml叶绿素溶液

移取2ml

（1）号溶液，用去离子水定容至10ml；

（6）0.1mg/ml叶绿素溶液

移取1.0ml

（1）号溶液，用去离子水定容至10ml；

（7）0.05mg/ml叶绿素溶液

移取0.5ml

（1）号溶液，用去离子水定容至10ml；

2.光照实验

（1）选取0.4mg/ml，0.3mg/ml，0.2mg/ml，0.1mg/ml，0.05mg/ml叶绿素溶液，在测量溶液0分钟光照时的紫外吸收光谱，先找出最高吸收峰值对应的吸收波长，根据光敏剂的光源选择原理，选取了符合波长的光源作为激发光源。

在激发光源一致的条件下，再进行不同光敏物质的分组照射及紫外吸收光谱检测。

在不同浓度的叶绿素溶液进行紫外检测（450~700nm）,得出扫描图谱。

附注：

样品在502nm（S带）和656nm（Q带）处有两个特征吸收峰，在656nm处叶绿素有一个强吸收峰，在502nm处有一个弱吸收峰，目前的分析工作仍在Q带进行检测。

选择Q带波长是因为在Q带检测有较高的灵敏性，物质在Q带的吸收强度比S带强。

因此选定656nm为叶绿素的检测波长。

随着溶液浓度的增大，叶绿素在可见光区的吸收也增大，但是吸收带的形状没有发生变化。

不管是在高浓度还是在低浓度下，除了吸收强度有所变化外，吸收峰的相对大小和位置没有变化，也没有出现新的吸收带。

说明在不同浓度溶液中叶绿素均以单体形式存在。

（2）在相同最大吸收波长656nm下，对刚配制好的各浓度叶绿素溶液进行紫外检测测定吸光度，分析叶绿素的吸光度对浓度的关系是否符合朗伯-比尔定

律。

浓度

（mg/ml）

0.05

0.1

0.2

0.3

0.4

吸光度

0.18311

0.44409

0.92383

1.42749

1.93115

叶绿素吸光度与浓度的关系

2.5

1

A度光吸

y=4.9757X-0.063

0.1

0.2

0.30.40.5

浓度/（mg/mL）

叶绿素浓度与吸光度的关系曲线满足：

y=4.9757-0.063（R2=0.9999）,可见叶绿素在浓度值为0.05~0.4mg/mL范围内，其与吸光度呈现一定的线性关系，符合朗伯-比尔定律。

故在以下不同光照时间中，只选取了0.4mg/mL浓度的叶绿素溶液作为实验检测。

（2.1）采用紫光的光源在暗室中对待测样品（叶绿素，0.4mg/ml）进行10min、

20min、30min、40min、50min、60min、80min、100min、时间的垂直照射，每次照射后取适量溶液进行紫外-可见吸收光谱的检测，分析叶绿素的光漂白特性。

叶绿素在波长为紫光的光源下的光照时间与吸光度的关系:

光照时间

（min）

10

20

30

40

50

60

80

100

吸光度

（656nm）

1.89026

1.86389

1.84863

1.81653

1.83228

1.80298

1.73779

1.69226

・紫光I

a.85

A度光吸

1.80

1.75-

1.70

光照时间对吸光度的影响

0

20

4060

80

100

时间/min

（2.2）用红光作为光源,分别把叶绿素的0.4mg/ml进行10min、20min、30min、40min、50min、60min、80min、100min时间的垂直照射，取照射后的各样品进行紫外-可见吸收光谱的检测，在同种物质、时间间隔一样（10min）的条件下进行了对比实验。

叶绿素在红光光源下的光照时间与吸光度的关系：

光照时

间（min）

10

20

30

40

50

60

80

100

吸光度

1.90027

1.86389

1.81470

1.81653

1.74658

1.73699

1.63574

1.56970

1.85_

1.80_

红光

A度光吸

75

70

60

20

4060

80

100

时间/min

4.5

4.0-

3.5-

3.0-

2.5-

-

2.0-

1.5-

1.0-

0.5-

0.0-

红光光照时间对叶绿素的影响

10min

20min

30min

40min

50min

500

550600650

700

-0.5-4

450

波长/nm

（2.3）用黄光光源分别把叶绿素的0.4mg/ml进行10min、20min、30min、40min、50min、60min、80min、100min时间的垂直照射，取照射后的各样品进行紫外-可见吸收光谱的检测，在同种物质、时间间隔一样（10min）的条件下进行了对比实验。

光照时间

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

（min）

吸光度

1.80

1.76

1.70

1.65

1.61

1.58

1.54

1.50

1.47

1.44

656nm

969

477

300

942

987

057

114

61

766

556

1.85

1.80-

1.75-

1.70-

黄光对叶绿素的光照图谱

■黄光

50505

££-5-54

1.^1.^1.^1.^1

A度光吸

20

4060

80100

叶绿素在波长为黄光光源下的光照时间与吸光度的关系:

时间/min

（2.4）用绿光灯光分别把叶绿素的0.4mg/ml进行10min、20min、30min、40min、

50min、60min、80min、100min时间的垂直照射，取照射后的各样品进行紫外-

可见吸收光谱的检测，在同种物质、时间间隔一样（10min）的条件下进行了对比实验。

叶绿素在波长为绿光灯光源下的光照时间与吸光度的关系：

光照时间

（min）

10

20

30

40

50

60

80

100

吸光度

（656nm）

1.85242

1.83398

1.81824

1.80298

1.78821

1.77393

1.74658

1.72351

绿光光照时间对吸光度的影响

A度光吸

1.80

1.75-

■绿光

20

4060

80100

1.70

时间/min

3.0

2.5

2.0

1.5

1.0

0.5

0.0

450

500

550

600

650

700

波长/nm

0min

10min

20min

30min

40min

50min

60min

80min

100min

（2.5）用蓝光灯分别把叶绿素的0.4mg/ml进行10min、20min、30min、40min、50min、60min、80min、100min时间的垂直照射，取照射后的各样品进行紫外-可见吸收光谱的检测，在同种物质、时间间隔一样（10min）的条件下进行了对比实验。

叶绿素在波长为蓝光灯光源下的光照时间与吸光度的关系:

光照时间

（min）

10

20

30

40

50

60

80

100

吸光度

（656nm）

1.89158

1.87561

1.84131

1.79468

1.76624

1.74072

1.66296

1.60339

1.90

1.85

A度光吸

1.80

1.75

1.70

1.65

60

蓝光对叶绿素的影响

020406080100

时间/min

・蓝光

（2.6）用白光分别把叶绿素的0.4mg/ml进行10min、20min、30min、40min、50min、60min、80min、100min时间的垂直照射，取照射后的各样品进行紫外-可见吸收光谱的检测，在同种物质、时间间隔一样（10min）的条件下进行了对比实验。

光照时间

10

20

30

40

50

60

80

100

（min）

吸光度

（656nm）

1.85437

1.82166

1.80615

1.79138

1.76477

1.73926

1.69226

1.66052

1.85_

白光对叶绿素的影响

■白光

1.80

A度光吸

75

70

叶绿素在波长为白光灯光源下的光照时间与吸光度的关系:

3.0

2.5

2.0

1.5-

1.0

0.5

0.0

450

500

550

600

650

700

波长/nm

0min

10min

20min

30min

40min

50min

60min

80min

100min

0

■

20

1■1■

4060

1

80

1

100

时间/min

（3）在最大吸收波长656nm下（严格控制光照时间），2C、17C、27C、37C、47C、57T的0.4mg/ml叶绿素溶液测定吸光度，探究温度对叶绿素光谱特性的影响。

温度

2C

17C

27r

37r

47r

57r

吸光度

（656nm）

1.56580

1.56580

1.57458

1.58459

1.61646

1.60339

在温度为2C和17C时，叶绿素的最大吸收波长为654bn,波长发生了蓝移，而在27、37、

47、57C时，最大吸收波长都在656nm，没有发生改变。

（4）在最大吸收波长下656nm（严格控制光照时间），在0.8mg/ml叶绿素溶液

的中，分别加入1.0ml水，1.0ml0.01mol/L的HCI溶液，1.0ml0.01mol/L的NaOH溶液，1.0ml0.005mol/L的HCI溶液，1.0ml0.005mol/L的NaOH溶液，用pH计测定其pH值，再测定紫外吸收值，观测pH值对溶液吸光度的影响。

（即叶绿素

的检测浓度均为0.4mg/mL）

探究pH对叶绿素光谱特性的影响。

加

1.0ml0.05

1.0ml0.01m

1.0ml

1.0ml0.01ol/LN

1.0ml0.05mol/L

入

mol/LHCl

ol/LHCl

水

aOH

NaOH

pH

1.12

2.00

6.6.

11.93

12.77

波长/nm

0.4mg/mL的叶绿素溶液在pH=1.12时，最大吸收波长为662nm，发生了红移，而在pH=2.00时，最大吸收波长为654nm，发生了蓝移。

而在pH=6.60、11.93、12.77时，最大吸收波长都在656nm没有发生改变。