附录溶液各种配制.docx

附录溶液各种配制.docx

《附录溶液各种配制.docx》由会员分享，可在线阅读，更多相关《附录溶液各种配制.docx（29页珍藏版）》请在冰豆网上搜索。

附录溶液各种配制

【关键字】附录

附录：

常用试剂配制及应用

一、常用缓冲液、试剂的配制

碳酸盐缓冲液（Carbonate-BicarbonateBuffer）

由于碳酸盐pH值偏碱，因此，常用于pH>9的缓冲液配制（附表1）。

附表mol/L碳酸盐缓冲液（pH9.2～10.7）

pH

0.2mol/LNa2CO3

（ml）

0.2mol/LNaHCO3（ml）

pH

0.2mol/LNa2CO3

（ml）

0.2mol/LNaHCO3（ml）

9.2

4.0

46.0

10.0

27.5

22.5

9.3

7.5

42.5

10.1

30.0

20.0

9.4

9.5

40.5

10.2

33.0

17.0

9.5

13.0

37.0

10.3

35.5

14.5

9.6

16.0

34.0

10.4

38.5

11.5

9.7

19.5

30.5

10.5

40.5

9.5

9.8

22.0

28.0

10.6

42.5

7.5

9.9

25.0

25.0

10.7

45.0

5.0

磷酸缓冲液（PhosphateBuffers，PB）

磷酸盐是使用最广泛的一种缓冲剂，由于它们是二级解离，有二个pKa值，所以用它们配制的缓冲液，pH范围最宽。

NaH2PO4：

pKa1＝2.12，pKa2＝7.21；Na2HPO4：

pKa1＝7.21，pKa2＝12.32。

另外，磷酸盐还有钾盐分子形式，一般来说，低温时钠盐难溶，钾盐易溶，因此，配制细胞培养用试剂时常常添加钾盐试剂，但若配制十二烷基硫酸钠（SDS）-聚丙烯酰胺凝胶电泳的缓冲液时，只能用钠盐而不能用钾盐，因为SDS会与磷酸钾生成难溶的十二烷基硫酸钾。

磷酸缓冲液的优点为：

①可配制成不同离子强度的缓冲液；②适用pH缓冲范围较宽；③受温度影响缓冲液pH值变化较小；④离子强度对缓冲液pH影响较小，如0.1mol/L缓冲液稀释10倍其pH变化小于0.1。

磷酸缓冲液的缺点是：

①磷酸盐易与钙离子（Ca2+）、镁离子（Mg2+）及重金属离子结合生成不溶的沉淀物；②可能干扰某些化学反应过程，如对某些酶的催化活性具有一定程度的抑制作用。

NaH2PO4的pH值偏酸性，可用作pH<4的缓冲液。

Na2HPO4的pH值偏碱性，可用作pH>10的缓冲液。

而pH＝6～8的中性缓冲液是更常用的缓冲液，需要NaH2PO4与Na2HPO4两种磷酸盐混合配制（附表2）。

附表mol/L磷酸盐缓冲液（pH5.7～8.2）

pH

0.2mol/LNaH2PO4

（ml）

0.2mol/LNa2HPO4（ml）

pH

0.2mol/LNaH2PO4

（ml）

0.2mol/LNa2HPO4（ml）

5.7

93.5

6.5

7.0

39.0

61.0

5.8

92.0

8.0

7.1

33.0

67.0

5.9

90.0

10.0

7.2

28.0

72.0

6.0

87.7

12.3

7.3

23.0

77.0

6.1

85.0

15.0

7.4

19.0

81.0

6.2

81.5

18.5

7.5

16.0

84.0

6.3

77.5

22.5

7.6

13.0

87.0

6.4

73.5

26.5

7.7

10.5

89.5

6.5

68.5

31.5

7.8

8.5

91.5

6.6

62.5

37.5

7.9

7.0

93.0

6.7

56.5

43.5

8.0

5.3

94.7

6.8

51.0

49.0

8.1

4.2

95.8

6.9

45.0

55.0

8.2

3.0

97.0

磷酸盐缓冲溶液（Phosphate-bufferedsaline,PBS）

磷酸盐缓冲液是在磷酸缓冲液基础上添加NaCl以维持溶液的渗透压，因此，PBS适用于做细胞缓冲液，常用PBS配制如下。

NaCl

KCl

Na2HPO4

KH2PO4

在800ml蒸馏水中溶解，用HCl调节溶液的pH值至7.2～7.4加水定容至，15psi（/cm2）高压灭菌20min，室温保存备用。

Tris缓冲液（Tris-HClBuffer,TB）

Tris的pH值偏于碱性，因此，通过添加HCl调节pH至所需值，Tris-HCl缓冲液的离子强度（mol/L）是专指Tris的浓度，如某一特定pH的0.05mol/LTris缓冲液的配制是将50ml0.1mol/LTris碱溶液与附表3所示相应体积（ml）的0.1mol/LHCl混合，加水至将体积100ml，即为0.05mol/LTris缓冲液。

另外，按附表3制备的缓冲液，由于试剂来源的不同，缓冲液pH可能与所需略有差异，此时可通过稍许减少或增加HCl用量，精细调节pH至所需值。

附表mol/LTris缓冲液

pH

需0.1mol/LHCl（ml）

pH

需0.1mol/LHCl（ml）

7.1

45.7

8.1

26.2

7.2

44.7

8.2

22.9

7.3

43.4

8.3

19.1

7.4

42.0

8.4

17.2

7.5

40.3

8.5

14.7

7.6

38.5

8.6

12.4

7.7

36.6

8.7

10.3

7.8

34.5

8.8

8.5

7.9

32.0

8.9

7.0

8.0

29.2

Tris盐缓冲液（TBS）：

Tris盐缓冲液是在Tris缓冲液基础上添加NaCl以维持溶液的渗透压，因此，TBS也适用于做细胞缓冲液，常用TBS配制如下。

NaCl、KCl以及Tris溶解于800ml蒸馏水中，加入酚红并用HCl调pH至7.4用蒸馏水定容至，分装后在15psi（/cm2）高压灭菌20min，室温保存。

现在常用Tris盐缓冲液通常不加pH指示剂，而且该溶液如果不用于细胞培养，通常不加KCl及酚红。

Hank’s液（Hank’sBalancedSaltSolution）

Hank’s液是一种平衡盐溶液，主要用于细胞培养取材时组织块的漂洗、细胞的漂洗等。

贮存液A液：

（I）NaCl

KCl

MgSO4·7H2O

MgCl2·6H2O

用双蒸馏水定容至450ml。

（II）CaCl2（或CaCl2·2H2O）

用双蒸馏水定容至50ml。

将I和II液混合，即成A液。

贮存液B液：

Na2HPO4·12H2O，

KH2PO4,

酚红,

葡萄糖10.0g,

酚红应先置研钵内磨细，然后按配方顺序一一溶解，用双蒸馏水定容至500ml。

（3）应用液：

A、B储存液分别经湿热灭菌20min，取A和B液各25ml，加无菌双蒸馏水至450ml，使用前用无菌的3.5%或5.6%NaHCO3调至所需pH。

注意：

药品必须全部用A.R试剂，并按配方顺序加入，用适量双蒸水溶解，待前一种药品完全溶解后再加入后一种药品，最后补足水到总量。

无Ca2+、Mg2+Hank’s液（Hank’sSolutionwithoutcalcium,magnesiumsulfate）

NaCl,

KCl,

Na2HPO4·12H2O，

KH2PO40.6g,

葡萄糖10g,

用双蒸馏水溶解后，加入0.4％酚红溶液50ml，再加入双蒸水至1000ml，112.6℃湿热灭菌20min，4℃冰箱保存。

临用前将原液用无菌双蒸水作1：

10倍稀释，用无菌的3.5%或5.6%NaHCO3调至所需pH。

pH7.2柠檬酸盐缓冲液（CitrateBuffer）

柠檬酸0.327g

柠檬酸钠2.63g

磷酸氢钠0.222

葡萄糖0.00255mg

蒸馏水加至100ml。

pH3.3枸橼酸-磷酸盐缓冲液（Citricacid-PhosphateBuffer）

0.131mol/Lcitrateacid，0.066mol/LNa2HPO4，等量混合，调节pH至3.3。

0.5mol/LEDTA,pH8.0

EDTA·2H2O186.1g

NaOH～20g

将EDTA·2H2O加入800ml水中，在磁力搅拌器上剧烈搅拌。

用NaOH调节pH至8.0，EDTA直到接近pH8.0才完全溶解，定容至1L。

分装后高压蒸汽灭菌。

0.4%酚红溶液

取酚红0.4g置于研钵中逐滴加入1mol/LNaOH溶液11.28ml，边研磨边使酚红转变为钠盐溶于水中，加双蒸水至100ml，过滤后，4℃冰箱保存。

醋酸钾（PotassiumAcetate）

在60ml5mol/L醋酸钾溶液中，加入11.5ml冰醋酸和28.5ml水。

该溶液用于碱性裂解。

3mol/L醋酸钠（SodiumAcetate），pH5.2和pH7.0

在800ml水中溶解408.1g三水醋酸钠，用冰乙酸调pH至5.2或用稀释乙酸调pH至7.0，加双蒸水至1L。

分装后高压灭菌。

柠檬酸钠缓冲液（SodiumCitrateBuffer）

柠檬酸钠1.8g

HCl（1mol）4ml

无水乙醇95ml

先用100ml去离子水溶解柠檬酸钠，然后加入HCl和无水乙醇，再补充去离子水至总量200ml。

饱合硫酸铵溶液（SaturatedAmmoniumSulfateSolution）

取500ml双蒸馏水，加入约400克硫酸铵，水浴加热至70℃，磁力搅拌器充分搅拌，直到加入的硫酸铵不再溶解，以氨水（也可用NaOH）调pH7.2，室温保存。

二、酶免疫检测常用试剂配制

包被液（CoatingBuffer）（pH9.5碳酸盐缓冲液）

Na2CO3·10H2O8.58g

NaHCO35.8g

溶于双蒸水至1000ml。

封闭液（Confiningliquid）（5%脱脂乳-PBS溶液，pH7.4）

脱脂乳50g

加0.02mol/LpH7.4磷酸盐缓冲液（PBS）至1000ml溶解。

洗液（washingliquid）

氯化钠8.0g

磷酸二氢钾0.2g

磷酸氢二钠（12H2O）2.9g

吐温-200.5ml

加去离子水至1000ml溶解即可。

终止液（stopbuffer）（2mol/LH2SO4）：

21.7mlH2SO4加去离子水至200ml。

缓冲甘油（glycerinebuffer）

甘油9份

PB（pH8.0）1份

将9份甘油与1份PB合并，充分混匀。

0.5%H2O2-甲醇液（HydrogenPeroxide-MethanolSolution）（总体积120ml）

3%H2O220ml

甲醇100ml

DAB-H2O2底物缓冲液（DAB-H2O2SubstrateBuffer）

取6mg二氨基联苯胺（3,3’-DiaminobenzidineTetrahydrochlorideDAB）溶解于10ml0.05molTris-HClpH7.6。

使用前取0.3%H2O20.1ml加入到DAB溶液中（H2O2的终浓度为0.003%）。

如有沉淀生成，则用滤纸过滤。

5-溴-4-氯-3吲哚磷酸/四唑氮蓝底物显色液（BCIP/NBTSubstrateSolution）

贮存液配制：

NBT：

在10ml70%的乙醇中溶解0.5gNBT。

BCIP：

在10ml100%二甲基甲酰胺中溶解0.5gBCIP。

贮存液4℃保存，可稳定一年。

底物显色液：

取66μlNBT贮液与33μlBCIP加入到10ml碱性磷酸酶缓冲液中，充分混匀，底物显色液应在用前1小时内配制。

三、细胞相关试剂配制

L-谷氨酰胺（L-G）溶液（L-glutaminSolution）（0.2mol/L）

称2.9gL-谷氨酰胺（分子量为146.15）用去离子水溶解至100ml，过滤除菌，分装小瓶，4～5ml/瓶，-20℃冻存。

100x青-链霉素（双抗）溶液（P/SPenicillin/StreptomycinSolution）

取青霉素G（钠盐）100万单位和链霉素（硫酸盐）1g，溶于100ml去离子水中，分装小瓶，4～5ml/瓶，-20℃冻存。

7.5%NaHCO3溶液（NaHCO3Solution）

称分析纯NaHCO37.5g，用去离子水溶解至l00ml，过滤除菌，分装小瓶，4～5m1/瓶，盖紧瓶塞，4℃保存。

HEPES溶液（HEPESSolution）（1mol/L）

称23.83gHEPES（N-2-Hydroxyethylpiperazine-N'-2-ethanesulfonicacid，N-2-羟乙基呱嗪-N'-2-乙基磺酸，分子量为238.3），用去离子水溶解至100ml，过滤除菌，分装小瓶，4～5m1/瓶，4℃保存。

氨基喋呤（A）贮存液（AminopterinStockingSolution）（100×,4×10-5mol/L）

称1.76mg氨基喋呤（Aminopterin,分子量440.4），溶于90m1去离子水中，滴加lmol/LNaOH0.5m1，并不断搅动，待氨基喋呤完全溶解后，加1mol/L的HCl0.5m1中和，再补加去离子水至100m1。

过滤除菌，分装小瓶，2ml/瓶，-20℃冻存。

次黄嘌呤和胸腺嘧啶核苷贮存液（HTStockingSolution）（100×,H:

10-2mol/L;T:

1.6×10-3mol/L）

称取136.lmg次黄嘌呤（Hypoxanthine，分子量136.1）和38.8mg胸腺嘧啶核苷（Thymidine，分子量242.2），加去离子水至l00ml，置45～50℃水浴中使完全溶解，过滤除菌，分装小瓶，2m1/瓶，-20℃冻存。

用前可置37℃加温助溶。

HAT培养液

培养液98ml，A贮存液1m1，HT贮存液lml。

秋水仙素溶液（colchicineSolution）

称取10mg秋水仙素，溶于100m1生理盐水中（即为100μg/ml），过滤除菌后，分装小瓶，－20℃冻存备用。

Alsever’s血细胞保存液（Alsever’sSolution）

葡萄糖2.05g,

柠橡酸钠0.8g,

NaCl0.42g，

蒸馏水l00ml。

以上成分混匀后，微加温使其溶解后，用柠檬酸调节pH6.1，分装于三角瓶中（30～50ml/瓶）,113℃湿热灭菌15min，4℃保存备用。

细胞冻存液（FreezingMedium）

50%小牛血清；40%不完全培养液；10%DMSO（二甲基亚砜）。

0.025%胰蛋白酶－0.2%EDTA细胞消化液（Trypsin-EDTASolution）

A:

2.5%胰蛋白酶:

胰蛋白酶2.5g

磷酸缓冲盐溶液100ml

过滤除菌保存。

B:

0.2%二乙胺四乙酸二钠（EDTA）

EDTA0.2g

双蒸馏水100ml

高压灭菌保存。

取A液1份，加B液99份，混匀，分装-20℃保存。

0.83%NH4CI溶液（AmmoniumChlorideSolution）

NH4CI0.83g

KHCO30.1g

EDTA·2Na0.0037g

蒸馏水加至100ml。

Tris-NH4Cl溶液（Tris-AmmoniumChlorideSolution）

NH4Cl3.735g/450ml双蒸水+Tris1.3g/50ml双蒸水（pH7.65）。

细胞裂解液（CellLysisSolution）

20mmol/LHEPES（pH7.5）

150mmol/LNaCl

1mmol/LEDTA

10μg/mlleupeptin

1mmol/LPMSF

1%TritonX-100

0.5%deoxicholate（sodiumsalt）

0.1%SDS

组织匀浆缓冲液（HistolysisBuffer）

50mmol/LTris-HCl（pH7.5）

150mmol/LNaCl

1%NP40

1mmol/Lphenylmethylsulfonylfluoride

4μg/mlleupeptin

1μg/mlaprotinin

细胞核裂解液（NuclearLysisBuffer）

10mmol/LTris-HCl（pH8.0）

150mmol/LNaCl

10mmol/LEDTA

蛋白酶K100µg/ml

0.4%SDS（最后加）

10mmol/L苯甲基磺酰氟（PMSF）

在异丙醇中溶解PMSF至1.74mg/ml，即10mmol/L，分装后保存于-20℃，如果需要的话，可将储存液制备至17.4mg/ml，即100mmol/L的高浓度。

闪烁液（ScintillationSolution）

PPO（2,5-二苯基）5.0g、POPOP（1,4-双－5－苯基）0.5g溶于1000ml二甲苯中。

也可将POPOP加入二甲苯，在37℃水浴上溶解后，再加PPO，然后补足二甲苯。

3H-TdR工作液（wokingSolution）

按1:

20的比例将浓度为1mCi/ml的3H－TdR用无血清的RPMI培养液稀释，终浓度为50µCi/ml。

肝素溶液的配制：

含有肝素的培养液可以使内皮细胞纯度提高，肝素加入全培养液中最终浓度为50ug/ml。

因为现在市售的多为肝素钠，包装为约为0.56克/瓶，配制时，可将其溶于100ml三蒸水中，定容，过夜，然后过滤除菌，分装小瓶，保存温度为4℃。

使用时，向100ml培养液中加入1ml（精确可加入0.9ml）即可。

Ⅰ型胶原酶：

0.1％Ⅰ型胶原酶溶液同胰蛋白酶一样配制和消毒灭菌。

注意：

因为Ⅰ型胶原酶分子颗粒比胰酶大，不容易过滤，因此可以用蔡式滤器过滤除菌。

分装入10ml小瓶-20℃保存。

用时提前一小时37℃复温即可.0.1%的I型胶原酶的配置，100mg的粉末状的I型胶原酶可以溶于100ml的DMEM/F12，0.22微米滤器过滤0.1%的I型胶原酶的配置，100mg的粉末状的I型胶原酶可以溶于100ml的DMEM/F12，0.22微米滤器过滤.

四、染色液配制（PreprationofStainingSolution）

苏木素液（HematoxylinSolution）：

苏木素2.5g，乙醇25.0ml，钾明矾2.5g，氧化汞1.25g，冰乙酸20.0ml，蒸馏水500.0ml。

配制方法是先将苏木素溶于乙醇中（稍加热）。

将预先已溶解明矾的蒸馏水加入苏木素乙醇液中，使溶液尽快沸腾后，将火焰熄灭，慢慢加入氧化汞，防止溶液油溅出，再煮沸2min。

将烧瓶立即浸入冷水中，当染液冷却后，加入醋酸，室温保存，用前过滤。

伊红Y染色液（EosinYSolution）

伊红Y0.5～1.0g，蒸馏水75ml，95%乙醇25ml，冰乙酸1～2滴。

先取少许蒸馏水加入伊红，用玻棒将伊红研碎，再加入全部蒸馏水，溶解后加入乙醇。

甲基绿染色液（MethylGreeenSolution）

新购买的甲基绿需用氯仿处理去除甲基紫。

方法是将2%甲基绿水溶液20ml倾入洁净分液漏斗，移去慢慢下沉带紫红色的氯仿，再加入新的氯仿10ml，如此反复更换氯仿，到无紫红色为止。

该液作为贮存液，4℃保存。

染色液：

甲基绿贮存液5ml，5%派诺宁水溶液1ml，蒸馏水12ml，0.2mol/L乙酸钠（pH4.8）18ml（临用前配制，滤纸过滤）。

吖啶橙贮存液（AcridineOrangeStockingSolution）

10mg吖啶橙溶解于100mlPBS中，pH4.8～6.0滤过，4℃避光保存。

吉姆萨贮存液（GiemsaSolution）

吉姆萨染色粉1g先溶于少量甘油，在研钵内研磨30min以上，至看不见颗粒为止，再将全部（66ml）剩余甘油倒入，于56℃温箱内保温2h。

然后再加入甲醇（66ml），搅匀后保存于棕色瓶中。

母液配制后放入冰箱可长期保存，一般刚配制的母液染色效果欠佳，保存时间越长越好。

临用时用pH7.4磷酸缓冲液稀释10倍，随配随用。

瑞氏染色液（Wright’sSolution）

瑞氏染色粉0.3g

甘油3ml

甲醇97ml

将瑞氏染色粉放干燥研钵内磨细，加入甘油继续研磨，不断滴加甲醇并继续研磨，将上层溶解的染料倒入棕色瓶中，直至染料全溶后加甲醇至所需量。

混匀后置棕色瓶中保存，用前过滤。

一般配制后置室温一周便可使用，保存时间愈入，则染色效果愈佳。

吉姆萨-瑞氏染色液（Giemsa-Wright’sStainingSolution）

瑞氏染色粉0.3g

吉姆萨染色粉0.03g

甲醇100ml

将二种粉末置于研钵中磨细，再逐滴加入甲醇混匀后倒入棕色瓶中，塞紧瓶口并充分振荡。

置室温溶解后使用。

噻唑兰（MTT）

称取250mgMTT，加50mlPBS（0.01mol/L，pH7.4）在磁力搅拌器上搅拌30min，用0.22μm的微孔滤膜过滤除菌，分装，4℃保存。

两周内有效。

台酚蓝染色液（TrypanBlueSolution）

A：

台酚蓝染料1g

蒸馏水100ml

将染料置于研钵中边研磨边加入蒸馏水溶解。

B：

NaCl1.7g

蒸馏水100ml

临用前A、B液1：

1混合，离心沉淀，取上清供染色用。

混合后的染液存放过久，易形成沉淀，故应新鲜配制。

染色时，取细胞悬液0.1ml加入新鲜配制的染色液一滴，室温下染5～10分钟，取一滴悬液于载波片上，加盖玻片，高倍镜下检查。

死亡细胞膨大并染成浅蓝色，活细胞不着色，大小正常。

五、固定剂（Fixatives）

大多数神经激素、肽类物质为水溶性，在用于免疫细胞化学研究之前，常需固定。

但肽类和蛋白质的物理、化学性质不同，因而对不同的固定方法或固定剂的反应也不同。

某些固定剂甚至可同时破坏和/或保护同一抗原的不同抗原决定簇。

因此，在进行免疫细胞化学研究之前，很有必要了解所要研究的物质（蛋白质或肽类）的化学性质，并根据需要来选择适宜的固定剂（或固定方法）以及改进固定条件。

目前，免疫细胞化学研究中常用的固定剂仍为醛类固定剂，其中以甲醛类和戊二醛最为常用。

4%多聚甲醛-0.1mol/L磷酸缓冲液,pH7.3（formaldehyde-PhasphateBuffer）

　多聚甲醛　　　　　　　　40g

　　0.1mol/L磷酸缓冲液　　　　　　至1000ml

　　配制方法：

称取40g多聚甲醛，置于三角烧瓶中，加入500～800ml0.1mol/L磷酸缓冲液（PhosphateBuffer以下简称PB），加热至60℃左右，持续搅拌（或磁力搅拌）至完全溶解，通常需滴加少许1NNaOH才能使溶液清亮，最后补足0.1mol/L的PB于1000ml，充分混匀。

　　该固定剂较适于光镜免疫细胞化学研究，最好是动物经灌注固定取材后，继续浸