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体外肝代谢系统的研究与应用
体外肝代谢系统的研究与应用
【摘要】肝药酶在药物代谢中具有十分重要的作用。
对肝药酶的研究方式中,以动物肝脏或肝细胞为基础,构建体外肝代谢系统是体外代谢研究中最重要的环节之一。
对体外肝代谢的研究,主如果利用肝微粒体、基因重组CYP450酶系、肝细胞培育、肝组织切片及离体肝灌流系统等方式。
本文综述最近几年国内外所应用的不同体外肝代谢系统,并对各体外代谢研究方式进行比较,指出按照各系统的特性、不同的实验要求和目的,选择适当的研究方式的重要性。
【关键词】细胞色素P450酶;肝微粒体;肝细胞培育;肝组织切片;离体肝灌流
药物代谢(drugmetabolism)一般是指药物的生物转化(drugbiotransformation)。
药物经生物转化后,可引发药物的药理活性或∕和毒理活性的改变。
因此,研究药物的生物转化,明确其代谢进程,对新药开发、新剂型设计及制定合理的临床用药方案等方面都具有重要的指导意义。
肝脏是药物生物转化的重要器官,含有参与药物代谢重要的酶系(细胞色素P450酶,cytochromeP450,CYP450),该酶系参与药物及各类内源性和外源性化合物在体内的代谢进程。
CYP450酶系由三十多种同工酶(亚型)组成,主要有CYP一、CYP二、CYP3三大家族[1]。
本文所介绍的各类体外代谢系统均含有一种或多种CYP450酶的同工酶,为研究药物体外代谢提供了研究的对象和基础。
动物肝体外代谢研究能够较好地排除体内因素干扰,直接观察酶对底物代谢的选择性,为整体实验提供靠得住的科学依据。
以肝脏为基础的体外代谢系统主要包括肝微粒体、基因重组CYP450酶系、肝细胞、肝组织切片及离体肝灌流。
1肝微粒体
肝微粒体的制备
多数采用差速离心法[2],通太高速离心使微粒体与其他成份分离,操作简单,无需其他试剂辅助。
但较耗时,设备要求高,使该法的普及和深切研究受到必然的限制。
针对这些情形,可采用试剂辅助分离的方式[3],在离心前额外加入必然比例的PEG6000或CaCl2,增进微粒体沉降。
此法对设备要求降低,并缩短了实验周期。
肝微粒体的制备进程均应在4℃下进行。
正确、合理地选择缓冲液,能起到良好介质的作用,按比例加入后进行肝组织的破碎和匀浆,才可有效分离肝微粒体和避免细胞器受损。
肝微粒体的主要应用
测定CYP450酶活性
测定原理是在特定酶催化下,底物在辅助因子和适合的温度、时刻作用下反映,借助仪器测定生成的特定产物量。
由于反映可控和周期短,目前大多数P450酶以肝微粒体作为反映体系进行酶活性的测定[2]。
各类酶活性测定的步骤大体相同,不同主要在于酶对应的底物和检测仪器的选择。
一般以底物及代谢途经来命名各类酶,如7乙氧基试卤灵O脱乙基酶(CYP1A1)[4]、氯唑沙宗羟化酶(CYP2E1)[5]等。
按照底物特性选择检测仪器,常常利用的有紫外∕荧光分光光度计,或联用HPLC系统。
考察药物对肝药酶活性的影响
某些药物在体内不同程度地诱导或抑制肝药酶活性,这将影响到同时服用的其他药物的代谢,如抑制CYP3A活性的药物(如红霉素等),若与其他经这一家族酶代谢的药物(如西尼地平等)同时服用,则可能减慢其代谢,从而增强药效或毒副作用[6]。
最近几年来,关于考察中药成份对肝药酶活性影响的报导增多,从体外分子水平来评价它们对肝代谢的影响,可为中药配伍提供依据。
如代方国等[7]考察给以甘草、甘遂、甘遂甘草配伍药液的大鼠的肝微粒体中CYP2E1的活性,发觉甘草组和配伍组对CYP2E1活性的诱导作用显著高于甘遂组;甘遂可能通过诱导肝脏CYP2E1的表达与活性上升;甘遂甘草配伍使历时,甘草对CYP2E1活性的诱导能力更强,故二者配伍时,可增进甘遂所含前致癌物质和前毒物转化成为致癌物和毒物的进程,并致使对机体毒性作用的增强。
进行药物体外代谢途径研究
将药物加入肝微粒体中进行孵育后,利用质谱检测离子碎片来鉴定代谢物的结构,包括药物不同位点上的羟化物或去烷基产物,从而肯定代谢途径。
有报导指出[8],新型抗焦虑药AF5加入人肝微粒体中进行孵育,经GCMS分析,鉴定出两种主要代谢产物:
4羟基AF5(Ⅰ)及4羰基AF5(Ⅱ)。
AF5在肝微粒体中代谢的主要产物为Ⅰ,Ⅰ在人肝微粒体中,可进一步转化为Ⅱ,后者再也不被代谢。
考察手性药物的代谢立体选择性
周权等[9]把手性药物与大鼠肝微粒体相结合,对其立体选择性代谢作了详细的考察。
作者把R/S普罗帕酮(propafenone,PPF)加入经地塞米松或β萘黄酮诱导的大鼠肝微粒体中孵育,经提取及手性拆分后,进入HPLC系统分析。
结果显示,与对照组相较,在经诱导的肝微粒体中,PPF的Ⅰ相代谢呈显著的立体选择性。
总之,改良后的体外肝微粒体法耗时少,重现性好,易大量操作。
适用于酶活性及体外代谢清除等方面的研究,在实际工作中应用较广。
但同其他体外肝代谢方式相较,需要的原材料较多,且与体内情形的一致性方面存在不足,因此其结果是不是有利预测体内情形仍需进一步研究。
2基因重组人肝微粒体CYP450酶系
利用基因工程及细胞工程,将调控CYP450酶系表达的基因整合到大肠杆菌或昆虫细胞,再经培育可表达高水平的CYP450酶系,纯化后还可取得较单一的CYP450同工酶。
在明确某些药物经特定酶代谢后,即以此酶进行单一代谢,更准确地观察代谢结果,避免受其他酶一路参与此代谢途径的干扰。
Ching等[10]通过在酵母中克隆方式,取得高表达的人CYP1A1和CYP1A2,用于测定普萘洛尔对映体的去烃基化和环羟化反映的立体选择性和酶动力学参数,明确了CYP1A2均参与了2种途径,但CYP1A1只参与了去烃化反映。
有学者进一步运用重组人肝微粒体,应用酶抑制剂对普萘洛尔对映体的代谢途径进行对如实验[11-13]。
其中Yoshimoto等[12]应用基因重组的及人肝微粒体中的CYP酶系同工酶进行研究,发觉α萘黄酮对普萘洛尔R/S对映体的N脱异丙基化(desisopropylation)抑制作用别离为20%和40%;奎尼丁对其2种对映体的4环羟化代谢的抑制作用较完全;而其他酶抑制剂对其对映体的影响较小。
基因重组CYP450酶系与前述的肝微粒体在研究药物代谢方面具有必然的相关性。
但前者在药酶诱导特异性和选择性研究上优于其他的体外方式,并可在分子水平上,为药物与酶在结合位点的彼此作用研究提供更多的信息。
虽然该方式先进性较为突出,但由于受到设备条件和技术的限制,通过基因工程取得的酶量与种类仍较有限,纯化程度有待进一步提高,故其作为研究代谢的体外系统的地位仍有待进一步提高。
3肝细胞培育
体外培育技术与细胞活性的维持
体外培育包括肝细胞株的培育和原代肝细胞的分离与培育。
按照细胞来源于不同,经重复挑选可制备出不同型号的肝细胞株,知足各类实验需要。
肝细胞株容易贴壁存活,在相对稳固的培育条件下,传20~30代不会出现明显衰老现象。
原代细胞需通过从器官中分离的进程,存在分离难度大、体外培育要求条件高、存活时刻短、增殖及传代困难等问题。
多数研究者采用改良的Seglen两步胶原酶灌注法。
但此法操作繁琐,设备及实验技术要求高,影响因素较多[14],包括灌注液的种类和速度、肝脏灌洗是不是充分、分离消化的酶、培育液的组成和肝细胞悬液的离心清洗等。
鉴于上述原因,刘友平[15]等采用肝组织块贴壁法原代培育,即只把组织块剪碎,不用胶原酶消化,直接按肝细胞的培育方式进行贴壁培育,在传代时加胰酶消化,只取上层细胞悬液继续培育。
该法简单快捷,无需灌注、离心,所得肝细胞活力高。
为了解决肝细胞活性体外维持时刻短的问题,Hengstler[16]等研究优化肝细胞冷冻技术。
同新鲜肝细胞相较,通过该技术冷冻储藏的肝细胞活性为新鲜肝细胞的80%以上,而其Ⅰ相、Ⅱ相代谢酶的活性>60%,可用于反映时刻不超过8h的代谢研究,亦可用于药酶的诱导研究,但该技术仍需进一步优化。
肝细胞培育的主要应用
进行药物体外代谢途径与体内相关性研究
Nakagawa等[17]将BPA[2,2bis(4hydroxyphenyl)propane,2,2双(4羟苯基)丙烷]加于大鼠肝细胞中,经质谱检测,BPA专门快代谢为单葡萄糖醛酸结合物及2个次要代谢物(单硫酸结合物和3OHBPA)。
在BPA体内代谢研究中发觉,约20%~30%的BPA从尿中排泄,主要为首过效应中生成的葡萄糖醛酸结合物,其中硫酸结合物占尿液中总代谢物的2%~3%[18]。
因此BPA肝细胞体外温孵与体内进程很相似,具有必然的代表性。
进行药物体外代谢清除研究
Shibata[19]等人运用冷藏保留的人肝细胞混悬于100%的人血浆中,将预测的肝利费用及清除率与14种临床常常利用的药物的生物利费用和血浆清除率进行比较时,发觉不同的细胞来源,内在清除率存在极大的个体不同性。
同时在基础的生物定标系数(×109个/kg)下,用外推法将体外实验结果应用于体内实验的预测,往往会出现明显的偏低现象,因此计算的定标系数应比基础生物大3~5倍。
为取得更靠得住的定量预测结果,通过预实验来肯定校正的定标系数是相当重要的环节。
由于在新鲜分离的肝细胞中,介导药物代谢的CYP450酶系存在时刻依赖性衰减的现象,所以一般的肝细胞培育都要求在肝细胞生存时刻跨度内进行。
Griffin和Houston[20]对体外单层肝细胞培育的内在清除能力(CLint)与新鲜游离肝细胞悬液的清除能力进行比较,发觉其内在的清除能力与代谢速度有关,单层肝细胞体外实验更适合于代谢速度慢的药物。
总之,用肝细胞培育方式作为评价药物代谢的体外系统,存在必然的误差。
其结果与体内的情形相近程度,专门大程度上取决于研究者的经验。
参与新型多器官共培育的研究
在很长一段时刻内,研究者都只是单纯考察药物代谢在某一种器官(如肝脏)中的作用情形。
而实际上,药物在体内的进程是多因素综合作用的。
按照最新报导[21],肝细胞参与整体非持续性多器官共培育体系(IdMOC),即把肝细胞和来自于其他多个器官的非肝原代细胞一路培育,为在药物代谢和毒副效应方面评价多器官之间的彼此作用提供可能性。
肝细胞同肝微粒体相较,在代谢物生成、体外代谢清除等研究方面有许多相似性,但针对代谢物种类、主要代谢物及所反映的代谢特性上存在着质或量的不同。
随着肝细胞冷冻技术的进展,因其体外活性维持时刻短而造成的应用限制会不断取得改善。
4肝组织切片
在各类器官组织切片中以肝切片的应用最多,可在较长的孵育时刻内维持代谢活性。
据报导,小鼠肝切片可培育3~5d[22]。
组织切片的实验与培育条件使得其重现性比灌注器官的重现性容易患多。
切片制备相对快捷而简便。
但其缺点为切片机的大量利用受限,而且价钱昂贵。
DeKanter[23]等利用利多卡因、睾酮及7乙氧基香豆素为探针药物,进行了器官切片实验,结果表明,该系统具有多相代谢途径,且易于比较不同器官组织的代谢不同。
研究发觉不同种属及不同器官间代谢类型及速度不同。
Vickers[24]用肝組织切片研究环孢素A(CSA)的代谢,CSA本身是CYP3A4的底物,但在人肝切片中加入1~10mol/LCSA培育24h,使CYP3A4活性降低了25%,说明在CSA高浓度时可减少本身的清除率而提高血药浓度。
若用某些疾病的标记物加入肝组织切片中培育,也可研究药物的不良反映如对肝的损害(以GSP或核基质蛋白Numa为标记物)或对脂质代谢的影响(以Lp(a)为标记物)等。
组织切片完整地保留了所有的肝药酶及细胞器的活性,而且保留了必然的细胞间质。
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