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气相色谱法讲义
气相色谱法
第一节 色谱法原理及分类
一、色谱法简介
1.色谱法首先是一种分离技术。
实际工作中要分析的样品往往是多组分的混合物。
对含有未知组分的样品,首先必须将其分离,然后才能对有关组分进行进一步的分析。
最早是由俄国植物学家茨维特(Tswett)在1906年研究用碳酸钙分离植物色素时采用的实验方法。
–他将植物色素的石油醚提取液倒入装有碳酸钙的直立玻璃管,再加入石油醚使其自由流下,结果色素中各组份互相分离形成各种不同颜色的谱带(Tswett)用希腊语chroma(色)和graphos(谱)描述他的实验方法,即现在的Chromatography(色谱法),色谱法(Chromatography)因之得名。
当然,现代的发展,不再局限于有色物质,而且大量用于分离无色物质。
2.色谱法发展的历史:
1906年俄国植物学家Tswett命名自己发明的分离植物色素的新方法为色谱法。
因为他并不是一个著名的学者,因此他发表出来的文章并没有得到重视。
1931年,德国的Kuhn和Lederer重复了Tswett的实验,得到很好的结果,色谱法因此得到很大的推广。
1940年,Martin和Synge提出了液液分配色谱法,又把塔板的概念引入色谱法中,初步建立了塔板理论。
1941年,他们提出了用气体代替流体做流动相的可能性,在他们发展了完整的气液色谱法之后,他们得了1952年的诺贝尔化学奖。
随后,1957年Golay开展了开管柱气相色谱。
上个世纪六十年代末把高压泵和键合相固定相结合,出现了高效液相色谱。
接着,出现了色谱法和其他检测技术的联用,例如GC-MS、GC-IR等。
上个世纪八十年代,毛细管电泳出现,此后得到长足的发展,并不断出现新的模式,一直成为研究的热点。
气相色谱主要是利用物质的沸点、极性和吸附性质的差异来实现混合物的分离。
适于分析气体、易挥发的液体及固体(约占有机物20%),不适合分析不易气化或不稳定性物质。
而样品的衍生化使应用范围进一步扩大。
3.如何理解色谱法(GasChromatography)
主要有2点:
一是要有两相,二是要有差异。
•两相:
固定相和流动相
具体到气相色谱:
固定相就是色谱柱(column),流动相就是气体或者称为载气(carriergas)。
•差异就是指分配系数的差异
举一个形象的例子,如人们参观海底世界:
海底世界的通道就如同色谱柱一样,只对兴趣的人有保留作用,这样达到选择性质保留溶质的效果,而保留差别的大小决定了分离的基础。
换作另外一个通道,比如是植物类的,例如花,那么又对另外一类人又吸引力,那么在海底通道上没有差别的人群也许在这个花的通道上能够看出差别,总之,只要他们之间有差别,总能够找到这个差别把他们区分开
二、气相色谱法分类 按不同的条件有多种分离方法
◎根据固定相不同可分为气固色谱法(GSC)和气液色谱法(GLC),前者采用固体固定相,其分离主要是基于吸附机理。
后者则为液体固定相,分离主要基于分配机理,在实际GC分析中,90%以上的应用为气液色谱。
◎按色谱柱不同可分为填充柱和开管柱。
填充柱内要填充上一定的填料,它是“实心”的,而开管柱则是“空心”的,其固定相是附着在柱管内壁上的。
GC初期使用的都是填充柱,1958年才出现了毛细管柱。
而毛细管柱的普遍使用则是1979年出现了弹性石英柱后才开始的。
开管柱又常被称为毛细管柱,但毛细管柱并不总是开管柱。
事实上,毛细管柱也有填充型和开管型之分,只是人们习惯上将开管柱叫做毛细管柱而已。
毛细管柱比填充柱有更高的分离效率。
这是因为毛细管柱内没有固体填料,气阻比填充柱小得多,故可采用较长的柱管和较小的柱内径,以及较高的载气流速。
再加上采用较薄的固定液膜又在一定程度上抵消了由于载气流速增大而引起的传质阻力增大、一般来说,一根30m长的毛细管柱很容易达到100000的总理论塔板数.而—根3m长的填充柱却最多只有4500的总柱效。
◎按进样方式分:
按进样方式分可分为常规色谱、顶空色谱和裂解色谱等。
三、气相色谱分离过程及有关术语
⒈气相色谱分离过程
不同组分组成的混合物,在随载气向柱出口方向不断移动时,由于不同组分在固定相和流动相之间的保留性能(保留性能可以是溶解度、挥发性、极性、特殊的化学相互作用或其他任何存在于样品组分间的性质差异)的不同,产生差速迁移而逐渐分离的过程。
⒉气相色谱常用术语
⑴色谱峰:
组分从色谱柱流出,检测器对该组分的响应信号随时间变化所形成的峰形曲线。
⑵基线:
仅有载气通过色谱柱时,检测响应信号随时间变化的曲线。
稳定的基线应该是一条平行于时间坐标的直线。
⑶色谱峰高h:
色谱峰顶点与基线之间的垂直距离
⑷色谱峰区域宽度
标准偏差δ:
它是正态分布色谱曲线两拐点距离的一半即0.607倍峰高处色谱峰宽度的一半。
σ↓小,峰↓窄,柱效↑高
半高峰宽W1/2:
峰高一半处对应的色谱峰宽 W1/2=2.355δ
色谱峰底宽Wb:
基线上峰的起点至终点的距离。
(注意与峰宽的区别)
峰宽(切线峰宽)(peakwidth,W)正态分布色谱峰两侧拐点所作切线与基线两交点间距离
Wb=4δ或Wb=1.699W1/2除了可用于衡量柱效,还可以计算峰面积
⑸保留值
保留时间tR:
组分通过色谱柱所需的时间
死时间t0:
不被保留的组分从进样到色谱峰最大值出现的时间(即组分在流动相中的所消耗的时间),或流动相充满柱内空隙体积占据的空间所需要的时间,又称流动相保留时间
调整保留时间tRˊ:
扣除死时间后的保留时间,(即组分在固定相中滞留的时间) tRˊ=tR-t0
保留体积VR:
从进样开始到组分出现浓度极大点时所消耗的流动相的体积 VR=tR×F0 F0—色谱柱出口载气流量
死体积V0:
不被保留的组分通过色谱柱所消耗的流动相的体积,又指色谱柱中未被固定相所占据的空隙体积,即色谱柱的流动相体积(包括色谱仪中的
管路、连接头的空间、以及进样器和检测器的空间)死体积增加,峰展宽,峰形变差。
V0=t0F0
调整保留体积VRˊ:
保留体积与死体积之差,即组分停留在固定相时所消耗流动相的体积VRˊ=VR-V0
相对保留值r2.1
⑹峰面积(peakarea,A)——峰与峰底所包围的面积。
第二节 气相色谱基本理论
一、相平衡参数
⒈分配平衡:
用分配系数、分配比来描述组分在给定两相间的分配行为。
分配系数K:
在一定的温度、压力下,组分在液相和气相之间分配达到平衡时的浓度比
容量因子(容量比,分配比)k:
在一定的温度、压力下,组分在液相和气相之间分配达到平衡时的质量比
k值大小取决于组分本身和固定相的热力学性质,它不仅随柱温、柱压变化,也与流动相及固定相的体积有关。
k值是衡量色谱柱对被分离组分保留能力的重要参数,k值越大,组分在固定相中的量越多,柱的容量越大,保留时间越长;k为零时,则表示该组份在固定液中不溶解。
色谱保留方程:
VR=
分配系数K及分配比k与相对保留值α的关系
两组分的相对保留值α决定于分配系数K或分配比k,三者之间的关系如下:
表明:
如果两组分的K或k值相等,则α=1,两个组分的色谱峰重合;两组分的K或k值相差越大,则分离得越好。
二、等温线:
指一定温度下,某组分在两相中分配达平衡时,在两相中的浓度关系曲线
1.线性等温线(理想)→对称峰固定相表面活性吸附中心未达饱和,K一定,与溶质浓度无关
2.非线性等温线
(1)凸形→拖尾峰固定相表面吸附中心活性不均,先占据强吸附中心,再占据弱吸附中心,K随着溶质浓度的增加而减小
(2)凹形→前沿峰溶质与固定相作用,改变其表面性质,K随着溶质浓度的增加而增加
三、塔板理论
⒉塔板理论的四个基本假设
①在柱内一小段高度内组分分配瞬间达平衡(H→理论塔板高度)
②载气非连续而是间歇式(脉动式)进入色谱柱,每次进气一个塔板体积
③样品和载气均加在第0号塔板上,且忽略样品沿柱方向的纵向扩散
④分配系数在各塔板上是常数
将色谱柱假想为一个精馏塔,塔内有一系列连续的、相等体积的塔板,每一块塔板的高度称理论塔板高度H。
并假设在每一块塔板上被分离组分在气液两相间瞬时达到一次分配平衡,若色谱柱长为L 则:
n=5.54(tR/Wh/2)2 n理论塔板数
根据色谱图可计算出实际塔板数neff
小结:
塔板理论的贡献:
从热力学角度解释了色谱流出曲线的形状和浓度极大点的位置,阐明了保留值与K的关系,提出了评价柱效高低的n和H的计算式,在比较相似柱的柱效时有用
存在问题:
1)须在给定条件,指定组分测定时才有意义,做出了四个与实际不相符的假设,忽略了组分在两相中传质和扩散的动力学过程
2)只定性给出塔板高度的概念,却无法解释板高的影响因素
3)排除了一个重要参数——流动相的线速度u,因而无法解释柱效与流速关系,更无法提出降低板高的途径
四、速率理论吸收了塔板理论的有效成果——H,并从动力学角度较好地解释了影响柱效的因素,这是荷兰学者范第姆特于1956年提出的色谱过程动力学理论。
H=A+B/u+Cu
A、B、C为常数,分别代表涡流扩散项、分子扩散项和传质阻力项系数
⒈涡流扩散项(eddydiffusion)A。
由于色谱柱内填充剂的几何结构不同,组分在气相中形成紊乱的类似“涡流”的流动而引起色谱峰变宽。
或说样品分子在色谱柱中的流速不同而引起的峰展宽。
涡流扩散项A=2λdp,dp为填料直径,λ为填充不规则因子,填充越不均匀λ越大。
GC常用填料粒度一般为60~100目,大而均匀(球形或近球形)的颗粒容易填充规则均匀,λ越小。
总的说来,应采用细而均匀的载体,这样有助于提高柱效。
毛细管无填料,A=0n理较高。
固体颗粒越小,填充越实,A项越小
⒉分子扩散项(moleculardiffusion)
。
又称纵向扩散。
由于进样后溶质分子在柱内存在浓度梯度,导致轴向扩散而引起的峰展宽。
分子扩散项B/u=2γDm/u。
u为流动相线速度,分子在柱内的滞留时间越长(u小),展宽越严重。
在低流速时,它对峰形的影响较大。
Dm为分子在流动相中的扩散系数,由于液相的Dm很小,通常仅为气相的10-4~10-5,因此在HPLC中,只要流速不太低的话,这一项可以忽略不计,而在气相则成为重要影响因素。
γ是考虑到填料的存在使溶质分子不能自由地轴向扩散,而引入的柱参数,用以对Dm进行校正。
γ一般在0.6~0.7左右,毛细管柱的γ=1。
:
✓为降低纵向扩散,宜选用分子量较大的载气、控制较高线速度和较低的柱温
✓选择载气原则:
兼顾分析时间和减小纵向扩散
u较小时,选M较大的N2气(粘度大)
u较大时,选M较小的H2气,He气(粘度小)
⒊传质阻力项Cμ:
样品在气液两相分配,样品未及溶解就被带走,从而造成峰扩张。
包括气相传质和液相传质,气相中气相传质小可忽略不计。
液相传质:
✓注:
固定液应完全覆盖载体表面,不可以太薄,否则柱子寿命短,k太小;
T不可以超过固定液最佳使用温度
k=2~10可用k=3~5最佳(k:
容量因子)
范氏方程说明了在色谱分离条件的选择中,填充均匀程度、填充物的粒度、流动相的种类及流速、固定相的液膜厚度等对柱效和峰展宽的影响
⒋载气流速u对H影响
H=A+B/u+Cu
u一定,ABC下降,H下降,塔板数上升
当uu最佳时,B相可忽略
五、色谱基本分离方程
⒈分离度R 相邻两组分色谱峰保留值之差与两组分色谱峰底宽度平均值之比计算表
明,R小于0.8时,两组分不能完全分离;R=1时,两峰重叠约2%;R=1.5时可达完全分离。
因此,R值越大,分离越好。
通常可降低柱温,增加柱长,使(
)值增大,R提高。
但降低柱温、增加柱长又会使峰加宽,因此需进行最优化选择。
⒉色谱基本分离方程式
设相邻两色谱峰峰底宽度相等 即
3.不对称因子
正常峰(对称)T在0.95~1.05之间
色谱峰
非正常峰前沿峰T小于0.95
拖尾峰T大于1.05
第三节 气相色谱实验技术
一、气相色谱法特点
1分析速度快分析一个农药样品通常仅需数分钟,即使复杂的样品也只要几十分钟,并且分析所需样品量很少,通常只需12μL甚至更少;
2分离效率高高效色谱柱(特别是毛细管柱)可以分离非常复杂的多组份样品,为农药多残留分析提供了有效的途径;
3灵敏度高高灵敏的检测器可以检出1×10-10~1×10-12g的组分,适合于农药残留的微量和痕量分析;
4选择性高气相色谱固定相对性质相似的组分具有较强的分辨能力。
通过选用高选择性的固定液,使各组分间的分配系数有较大的差异而实现分离。
此外,不同类型的检测器对某类农药有较高的响应,如电子捕获检测器适合对有机氯农药的分析、火焰光度检测器适合对有机磷和含硫农药的分析、碱焰离子化检测器适合对氨基甲酸酯类农药的分析;
5适用范围广大多数农药的分子量在400以内,其沸点在气相色谱工作温度范围内,大多数农药可用气相色谱法测定。
二、气相色谱仪
主要包括五大系统:
气路、进样、分离、温度控制、检测记录系统。
⒈气路系统:
是一个载气连续运行、管路密闭的系统,对气路系统的要求是密封性好流速稳定。
GC常用的气体有:
氮气、氦气、氢气、压缩空气等,都要求使用高纯度(99.999%),这是因为气体中杂质会使检测器的噪声增大,还可能对色谱柱的性能有影响,严重的会污染检测器。
通常这些气体都要经过净化、稳压和控制、测量流量。
一般用皂膜流量计测得柱后载气流量F。
气路系统关键的问题就是要保证气路系统中各个接头部位不要漏气。
同时在
安装和使用中要注意:
◎须使用GC专用铜管或不锈钢管。
塑料管会渗透,还可能会释放其它可被检测到的干扰物。
◎管子使用前先用溶剂冲洗,载气吹干。
◎根据工厂的推荐,每用完3瓶气,应更换过滤器,以防止发生气体的污染。
◎每隔一定时间,应对所有外加接头进检漏(大约每隔4-6个月。
◎载气必须通过控制,形成恒定的压力和恒定的流量。
上下游控制器压差保持1公斤以上
填充柱内的流速通常是用质量流量控制器来控制的。
毛细管柱由于它的流速很低,常常是用压力来控制流速的。
有些GC提供电子气路控制,这样的仪器允许从键盘上设定流速并从显示器上读出。
压力换算表
压力
PSI
atm
Kg/cm2
torr
Kpa
bar
inchsHg
PSI
1
0.068
0.0703
51.713
6.8948
0.06895
2.0359
atm
14.696
1
1.0332
760
101.32
1.0133
29.921
Kg/cm2
14.223
0.967
1
735.5
98.06
0.9806
28.958
torr
0.0193
0.00132
0.00136
1
0.1330
0.00133
0.0394
Kpa
0.1450
0.00987
0.0102
7.52
1
0.0100
0.2962
bar
14.5038
0.9869
1.0197
751.88
100
1
29.5300
inchsHg
0.49612
0.0334
0.0345
25.400
3.376
0.03376
1
⒉进样系统:
进样就是有效地将分析样品定量的加到色谱柱进行分离。
进样量的大小,进样时间的长短,试样气化速度,试样浓度等都会影响色谱分离效率,以及定量结果的准确度和重现性。
v气化室温度。
v气化室的作用,是将所进样品在此气化室温度下让其瞬间气化为蒸气而不分解。
气化室温度一般比柱温高10-50℃即可。
进样口隔垫和衬管
▲进样口隔垫:
使用时间长了有老化漏气的问题,所以,要注意选择适当耐高温的隔垫,并定期检查是否漏气,需要时要及时更换,以保证分析的正常进行。
市售隔垫一般有三种类型,普通型(可耐温200℃)、优质型(可耐温300℃)和高温型(可耐温400℃)。
耐高温或抗老化性能越好、寿命越长,价格就越高。
常规分析实验室(汽化温度不超过300℃)选择优质型隔垫就可以了,做高温GC分析时最好用高温型隔垫。
▲进样口衬管:
多为玻璃或石英材料制成。
这里强调几个普遍性的问题:
①衬管能起到保护色谱柱的作用。
在分流/不分流进样时,不挥发的样品组分会滞留在衬管中而不进入色谱柱。
如果这些污染物在衬管内积存一定量后,就会对分析产生直接影响。
比如,它会吸附极性样品组分而造成峰拖尾,甚至峰分裂,还会出现鬼峰。
因此,一定要保持衬管干净,注意及时清洗和更换。
②衬管中是否应填充填料,要依具体情况而定。
一般填少量经硅烷化处理的石英玻璃毛可防止注射器针尖的歧视作用,加速样品汽化;还可避免颗粒物质堵塞色谱柱。
两种进样方式
1.手动进样应注意的问题:
(1)注射速度快:
注射速度慢时会使样品的汽化过程变长,导致样品进入色谱柱的初始谱带变宽。
正确注射方法是:
取样后,一手持注射器(防止汽化室的高气压将针芯吹出),另一只手保护针尖(防止插入隔垫时弯曲),先小心地将注射针头穿过隔垫,随即以最快的速度将注射器插到底,与此同时迅速将样品注入汽化室(注意不要使针芯弯曲),然后快速拔出注射器。
注射样品所用时间及注射器在汽化室中停留的时间越短越好,且每次注射的过程越重现越好。
(2)取样准确而重现:
即取样量要准确,抽取样品的速度要重现,以保证进样的重现性。
特别是黏度大的样品,要避免在注射器中形成气泡。
这跟护士打针时避免将空气注射进体内的道理是一样的。
也是这样倒置注射器,使视线与针管中的液面处于同一水平上,然后推压针芯到所需刻度。
至于针尖外面粘附的一部分样品,可用一片滤纸快速檫拭而除去(注意不能让滤纸吸去针管内的样品)。
(3)避免样品之间的相互干扰:
如果进样时注射器内有上一个样品的残留组分,就会干扰下一个样品的分析,带来定量误差。
在色谱中这叫做记忆效应,是必须消除的。
具体办法是洗针。
取样前先用样品溶剂洗针至少3次(抽满针管的三分之二,再排出)。
再用要分析的样品洗针至少3次,然后取样(多次上下抽动),这样基本上可消除记忆效应。
2、自动进样器
自动进样器实现了进样量的重现,避免了很多人为误差。
但它的缺点就是价格比较贵。
重要的是,速度的任何迟疑都将导致样品区域峰宽增大,一个熟练的操作者其RSD可达到2到3%。
应避免使用在两个“气泡”间捕集样品的注射技术,这样您必须做两次估算而使进样量的误差增倍
GC进样口
填充柱和大口径毛细管柱使用填充柱进样口,小口径的毛细管柱使用分流/不分流进样口,此外还有PTV、冷柱头进样口
⑴填充柱进样口
填充柱进样口是为填充柱设计的,可更换的衬管使进样口适用于特定内径的色谱柱柱,内径一般为1/8或1/4英寸典型的设计,当用大口径毛细管柱时专用的衬管使得它们可以用于填充柱进样口,这种色谱柱的柱容量与填充柱的类似,样品用注射器穿过隔垫注入到载气流中,加热的进样口使液体样品气化而后,载气将气化的样品带入色谱柱。
填充柱进样口操作和条件设定
参数
选择/设置
原理
进样口温度
比溶剂的沸点高+50℃
主要溶质的沸点
保证瞬间蒸发
用于无溶剂的样品
衬管
玻璃
降低活性(可更换)
柱温
程序升温
使色谱峰变窄,分析时间缩短
柱类型
1/8英寸不锈钢填充柱
1/4英寸玻璃填充柱
耐用
更适用于极性或有活性的化合物
载气流速
20-40ml/min
30-60ml/min
载气使用N2或He2
故障排除
填充柱进样口最常见的故障包括样品分解、反冲或泄露。
分解由于填充柱进样口是有活性的,特别当不使用玻璃衬管时,极性样品组分常常会拖尾或在进样口降解。
当怀疑进样口引起分解时,尝试柱内直接进样、采用脱活的玻璃衬管、或降低进样口温度,并取出处于进样口区域的柱填料。
一般情况下,由于进样口的容积较小,样品在进样口滞留的时间短,且填充柱分析载气流速相对较高,因此,进样口的活性引起的分解是不严重的。
反冲较小的进样口容积会造成过大的进样量很容易超过衬管的容量,使反冲至隔垫,从而可能造成跪峰、样品损失、峰面积不重现和分解。
泄露填充柱进样往往是流速控制,隔垫或柱的泄露将对保留时间和峰面积产生直接影响,另外空气还有可能进入而造成柱降解。
因此应定期更换隔垫,检查柱连接,以防止固定相降解。
⑵分流/不分流进样口
分流/不分流进样用毛细管柱有两种操作模式
A分流模式
毛细管柱有较小的样品容量,进样量必须非常少,通常远少于1微升以防止色谱柱超载,如此小的样品量操作起来是很困难的。
分流模式提供了一种方法来解决此问题,采用通常的进样量气化,然后只把其中一部分引入到色谱柱内进行分析,其余大部分经分流出口放空,分流阀开启并一直维持此状态。
样品被注射进衬管同时被气化,气化的样品在色谱柱(气流阻力大)和分流放空口(气流阻力可调)之间分配。
分流进样是将少量样品引入色谱柱而不造成柱超载的有效方法。
它适合不能稀释、在溶剂峰之前有很重要的小峰直接流出或比较“脏”的样品的分析。
分流结果一般是产生窄的峰,所以,分流进样如出现峰展宽或拖尾一般都是由于色谱柱安装不正确、分流比低或进样口温度低。
如怀疑进样口温度低,可以50度间隔升高温度并与升温前比较,改善了就继续升高温度,直到效果不在改善为止。
分流进样的性能还受针头歧视和进样口歧视现象的影响。
分析准确度和重现性都会随歧视和分解的增加而降低。
分流进样操作和条件设定
参数
设置关键点
考虑因素
进样口温度
高于最后流出物沸点至少20℃
保证瞬间蒸发、减少进样口歧视
进样口填充物
硅烷化玻璃纤维
不加
保留高沸点不挥发物、截留液滴
活性最低
进样口衬管
大体积、脱活处理
减少反冲及分解
进样量
0.5-3μl
易调节分流比
分流比
50:
1到500:
1
取决于样品和进样体积
进样技术
快速进样
减少针头歧视现象,提高重复性
隔膜吹扫
2-3ml/min
减少鬼峰
初始柱温
依据样品设置
尽量使初流出的峰型窄
柱温箱(程序升温)
柱温箱的温度应该高于溶剂的沸点,进样后应快速升温。
B不分流进样模式
采用普通的分流进样口,流路和分流模式是相同的。
通过在进样过程中关闭分流阀而实现不分流进样。
进样后样品在衬管中瞬间蒸发,并被载气带入色谱柱,并在低于溶剂沸点的温度下在柱头实现再浓缩,当大部分样品进入色谱柱后,分流出口打开,残留的样品及溶剂蒸汽被吹出,并在整个分析运行过程中分馏出口一直开着。
此模式特别适用于低浓度的样品,同时样品沸点比溶剂高的组分的分离,比分流进样有更高的灵敏度。
从以上原理可知不分流进样的要求之一是初始柱温要比样品溶剂的沸点起码低10℃,使样品溶剂在柱头冷凝以形成窄的谱带。
不分流进样操作和条件设定
参数
设置关键点
考虑因素
进样口温度
刚好高于分离化合物的
最高沸点(约20℃)
保证瞬间
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