磷脂酶D发酵菌株的自然筛选及条件优化.docx

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磷脂酶D发酵菌株的自然筛选及条件优化

成绩

本科毕业论文（设计）

题目：

磷脂酶D发酵菌株的自然筛选及条件优化

学生姓名_____

学号___

指导教师____

院系化工学院_____

专业____

年级级______

教务处制

诚信声明

本人郑重声明：

本人所呈交的毕业论文（设计），是在导师的指导下独立进行研究所取得的成果。

毕业论文（设计）中凡引用他人已经发表或未发表的成果、数据、观点等，均已明确注明出处。

除文中已经注明引用的内容外，不包含任何其他个人或集体已经发表或在网上发表的论文。

特此声明。

论文作者签名：

日期：

年月日

摘要

磷脂酶D（PLD）能催化水解卵磷脂（PLs）释放出磷脂酸和胆碱,在乙醇等物质存在的条件下,PLD能进行碱基交换反应,将具有羟基的乙醇等物质与胆碱的极性头部进行酯交换反应,连接到磷脂受体上。

因此,具有碱基交换功能的PLD通过对磷脂极性头部特异性基团的改变,可以生成许多稀有或半合成磷脂,满足保健品、医药等方面的需要。

PLD广泛存在于细菌、真菌、植物、脊椎动物中,特别是来源于链霉菌的PLD,表现出较好的水解及转酯活性。

本文以实验室初步筛选的产PLD菌株为出发菌株,首先根据PLD反应的特点,采用薄板层析（TLC）法,实现酶活力的快速测定。

然后在此基础上对菌种进行自然选育,摇瓶复筛,建立了一套PLD生产菌株的筛选方法。

通过摇瓶培养,对发酵培养基组分进行优化,确定了碳源、氮源和无机盐的最佳用量和对实验的影响。

关键词：

磷脂;磷脂酶D;链霉菌;筛选;发酵

Abstract

PhospholipaseD（PLD）isanenzymethatcatalyzesPLshydrolysistoreleaseaphosphatidicacid（PA）andacholine.Whileinthepresenceofanadditionalalcohol,PLDpreferentiallycatalyzesthetransphosphatidylationreaction,inwhichapolar-headmodifiedphosphatidylalcoholissynthesizedbythesubstratePLsthatactasthephosphatidyl-moietydonors.ThetransphosphatidylationreactioncarriedoutbythePLDenzymeshouldbe,therefore,apowerfultoolforachievingPLmodificationseconomically.Asafairlyabiquitousenzyme,PLDiswidelydistributedinbacteria,fungi,plantandvertebratespecies.Particularly,thePLDenzymesproducedbyStreptomycesspeciesappeartomuchhighactivity.

However,thewildstrainofStreptomycesproduceslowerunitPLD,limitingitsindustrialproductiongreatly.Inthispaper,arapiddeterminationofPLDenzymebasedonthemechanismofthePLDreactionwasfirstlybuiltwiththeThinLayerChromatography（TLC）method.Thenonthisbasistonaturalselectionofspecies,shakeflaskafterscreen,establishedasetofPLDproductionstrainscreeningmethod.Throughshakeflaskculture,optimizethefermentationmediumcomponents,determinetheamountofcarbonsource,nitrogensourceandinorganicsaltshasagreatinfluenceonexperiment.

Keywords:

phospholipids;phospholipaseD;Streptomyces;strainscreening;fermentation

第一章文献综述

1.1磷脂

1.1.1磷脂概述

磷脂由Uauqueelin于1812年首次发现，法国人Globly在1844年从蛋黄中首次分离出磷脂，俗称卵磷脂（Lecithin）[1]。

从广义上说，磷脂酰胆碱（Phosphatidylcholine，简称PC）、卵磷脂含脑磷脂（磷脂酰乙醇胺，Phosphatidylethanolamin，简称PE）、磷脂酰丝氨酸（Phospstidylserine，简称PS）、磷脂酰肌醇（Phosphatidylinositol，简称PI）以及神经鞘磷脂（Springmyelin，简称SM）的复合磷脂；从狭义上讲的卵磷脂即磷脂酰胆碱PC，它是胆碱、甘油、磷酸、饱和及不饱和脂肪酸组成的含磷脂类物质[2]。

1.1.2磷脂的理化性质

卵磷脂的纯净品为白色蜡状固体，在低温下可结晶。

磷脂分子中含有大量的不饱和脂肪酸，在空气中卵磷脂易被氧化形成过氧化物聚合物，此时磷脂由白色转成黄褐色，然后会变为棕黑色。

卵磷脂不耐高温,在100℃以上就会氧化分解。

因此，卵磷脂需在低温干燥的条件下保存，勿放置在有阳光直射或者潮湿、高温的地方，以防止其吸潮、氧化以及分解变质等[3]。

磷脂分子含有疏水性脂肪酸基和亲水性磷酸脂基,人们通常把磷脂归为一种具有两性（amphoteric）特征的表面活性剂。

磷脂不溶于水但与油脂完全混溶,且其易吸水膨胀成为胶体。

磷脂均不溶于或难溶于丙酮,故称其为丙酮不溶物。

磷脂可以被酸、碱、酶等水解，由于不同的磷脂在如乙醚、氯仿、乙醇等的有机溶剂中的溶解度不同,用这些有机溶剂可以实现卵磷脂的提取分离[4]。

磷脂是构成神经组织、尤其是脑脊髓的主要成分,也是生命细胞和所有活细胞的重要组成部分。

磷脂既是血球及其它细胞膜的主要构成材料,也组成40%的

人的骨髓、大脑中的干物质。

在正常的血液中磷脂占总脂量的25%，在人体正常活动的新陈代谢中,磷脂是不可缺少的。

1.1.3磷脂的应用

作为一种既含疏水基团又含有亲水基团的良性的表面活性剂，磷脂具有良好的乳化性能，在巧克力、糖果、焙烤食品、乳品等领域中已有很广泛的应用。

在食品工业中，把其它乳化剂与磷脂结合使用以对食品起到乳化作用；通过将其与淀粉、蛋白质结合来改良食品的物理性质,从而提高产品营养价值和质量并改良口味；磷脂和维生素E结合可以调制成不同品种、不同形式、不同功效的功能性食品[3]。

由于磷脂能够分解过高血脂及胆固醇并起到清扫血管、促进血液循环而减低脂肪肝的发病率的功能和作用等，在一定程度上磷脂起到延缓衰老、维持机体健康年轻,强化脑部功能、增强记忆力的作用。

此外，磷脂可以保护胃的黏膜。

并对生物膜中的许多酶的活性有影响。

医药工业方面，磷脂在人体细胞膜中不可缺少,人体脑部神经信息的传递中发挥了作用，对人的记忆力有很大影响；磷脂可以降低胆固醇等,从而缓解存在高血脂、血压的糖尿病等；此外，在一些酶的作用下,在油-水界面中磷脂反应可以合成新的药品。

在化妆品工业中，卵磷脂对人体皮肤良好的渗透性及适应性从而具有的促使皮肤柔软有弹性的性能；卵磷脂可化解人体肠内的废物，避免后者成为肠毒进入血液循环造成肌肤问题，磷脂也得到了广泛的应用。

除上述应用外，在农作物的防除剂、液体饲料制备过程的润滑剂及纺织工业的加工等其它工业中，磷脂也有广泛的应用前景。

1.2磷脂酶D

1.2.1磷脂酶D的简介

磷脂酶是一种微生物酶,具有较高的催化活性和高度的专一性。

磷脂酶可以分为磷脂酶A1、磷脂酶A2、磷脂酶C、磷脂酶D等。

磷脂酶D（phospholipaseD），简称PLD，可以对磷脂进行体外酶法改性，能催化水解羟基化合物P-O键和磷脂分子中的磷酸，生成磷脂酸（PA）和亲水性的胆碱，是特殊的一类酯键水解酶。

另外,在特定的条件下，有含羟基化合物（如甘油、丝氨酸、醇类物质等）时，可催化其结合到磷脂的碱基上形成新的磷脂,这就是PLD的转磷脂化反应（Transphosphatidylationreaction），也称作碱基交换反应（Baseexchange）[5]。

继1947年研究人员提取胡萝卜根首次发现了有活性的PLD，人们逐渐发现磷脂酶D主要存在植物体的根、叶中和动物体的脑髓、肝脏等细胞中。

传统工业大多以植物组织作为主要原料制备PLD。

由于动植物体中的PLD含量低,无法实现大规模生产。

而微生物中存在大量的PLD的发现解决了这一问题。

PLD主要存在于链霉菌及大肠杆菌中,可以对菌株大规模发酵培养来产酶。

微生物PLD与植物来源的PLD相比较，具有高度的专一性、较强的底物耐受性和碱基交换催化活性。

产PLD的微生物种类主要有棒状杆菌、链霉菌、大肠杆菌、假单胞菌、沙门氏杆菌以及嗜血副流感菌等，其中链霉菌酶活较高[6]。

1.2.2磷脂酶D的应用

磷脂酶D具有磷脂转移性和高度专一性两个特点,所以对来源广泛的粗品磷脂进行转化,就可以得到一些稀有磷脂,既开发出了新品种,又提高磷脂的营养价值。

在磷脂酶D的作用下,对磷脂进行改性,可以合成其他的稀有磷脂,从而使其的营养价值、各种性能等方面大大改进和提高,这就使磷脂在食品、医药、化妆品、纺织、皮革技术工业中的应用范围更加广泛,使用价值更高。

如食品工业中，磷脂酶D在丝氨酸存在下催化大豆磷脂合成磷脂酰丝氨酸（PS）,还可以制备磷脂酰甘油、磷脂酰肌醇等;此外,还可用纯度低的卵磷脂制备出高纯度的卵磷脂。

脂酶D在农业上也大有作为,它存在于植物体中,它的减少标志着果实的衰败,从而影响了产量及收成,可见如果增加磷脂酶D的含量,不仅可以延长果实的寿命,而且在经济效益上也大有收获。

在医药工业中,利用磷脂酶D制备的高品质磷脂及其衍生物的应用潜力和价值极为突出。

首先,脂质体技术为药剂的输送与传递提供了一种有效工具。

各类高品质磷脂及其衍生物是脂质体药剂最为重要的辅料,一定程度上决定了脂质体技术的发展水平。

同时,也可以利用磷脂酶D的碱基转移活性将一些多肽、核苷和多糖类药物通过配位键连接在磷脂载体上,制成具有特殊疗效作用的脂质体。

其次,利用磷脂酶D还可合成一些抗肿瘤试剂。

1.2.3磷脂酶D的催化活性

PLD由于其催化反应的特殊性，受到人们的高度关注，除了水解磷脂的作用之外，PLD在合适的条件下还能催化各种含羟基的底物结合到磷脂的碱基上，形成新的磷脂。

PLD的催化反应机理如图1.1所示：

图1-1PLD催化磷脂碱基交换反应和水解反应

可见PLD的催化作用取决于反应体系中水的含量。

大量的水存在会使反应朝着水解的方向进行，生成副产物磷脂酸（PA,Phosphatidicacid）。

为了抑制水解反应的发生，后来对PLD磷脂转移特性的研究多采用微水或无水介质作为反应体系。

多数关于PLD催化磷脂反应的研究都是在有机相-水微乳体系中进行。

其中底物和产物能够很好的溶解在有机溶剂里，酶和羟基化合物溶于水中，反应在两相间的界面上进行[7]。

1.2.4磷脂酶D反应的影响因素

影响磷脂酶D反应的因素很多,如温度、pH、盐类、有机溶剂以及反应所处的相。

不同来源的磷脂酶对温度、pH所产生的影响不同。

一般来说,大多数磷脂酶D最适反应温度在25~40℃之间,但也有部分来源的PLD最适温度在55~65℃之间。

不同来源的磷脂酶D的最适pH也不相同,植物来源的PLD在酸性范围,一般在5~6之间,微生物来源的PLD范围较宽,在4~8之间。

除温度、pH外,另一影响磷脂酶D活力的因素是盐类。

大量研究,在各种盐中,Ca+是最主要的影响因素[8]。

1.3薄层色谱

1.3.1薄层色谱的简介

薄层色谱法（TLC）或称薄层层析（thin-layerchromatography），就是将载体（即固定相）均匀地铺在薄层板上,选择适当的溶液作为展开剂（即流动相）,根据在流动相中样品各组分和薄层板上的载体之间的作用力的不同,从而样品的不同成分会在薄层板上中移动一定的距离,其与流动相前沿的距离之比,称为RF值,根据RF值得不同进而可对混合样品不同组分进行分离、定量以及定性分析的一种层析技术。

利用TLC法对样品进行定量分析时,主要有光密度计法和薄层扫描仪法,薄层扫描仪法为本文实验中薄层色谱定量的主要方法[9]。

1.3.2基本原理

薄层色谱，与其他色谱技术的原理一样，是一种利用样品中各组成成分的不同物理特性把它们分离开来的技术。

这些物理特性包括分子的大小、形状、所带电荷、挥发性、溶解性以及吸附性等。

薄层色谱分离一般是由几种分离机理综合的结果，最多的吸附和分配，也有离子交换和凝胶渗透。

薄层层析可根据作为固定相的支持物不同，分为薄层吸附层析（吸附剂）、薄层分配层析（纤维素）、薄层离子交换层析（离子交换剂）、薄层凝胶层析（分子筛凝胶）等。

一般实验中应用较多的是以吸附剂为固定相的薄层吸附层析。

薄层层析有许多优点：

它保持了操作方便、设备简单、显色容易等特点，同时展开速率快，一般仅需15~20分钟；混合物易分离，分辨力一般比以往的纸层析高10~100倍，它既适用于只有0.01μg的样品分离，又能分离大于500mg的样品作制备用，而且还可以使用如浓硫酸、浓盐酸之类的腐蚀性显色剂。

薄层层析的缺点是对生物高分子的分离效果不甚理想[10]。

1.3.3展开剂的选择

薄层色谱法中展开剂的选择直接关系到能否获得满意的分离效果，是薄层色谱法的关键所在。

通常先用单一溶剂展开，根据被分离的物质在薄层上的分离效果，进一步考虑改变展开剂的极性。

Rf值在0.3~0.5为最佳范围。

如果Rf值较大，则应加入适量极性小的溶剂，以降低展开剂极性，如Rf值较小，则可加入一定量极性大的溶剂。

1.3.4薄层色谱法的一般操作程序

薄层色谱法技术虽然经历了50多年的不断修改和更新，但无论是经典的薄层色谱还是现代化的仪器化的薄层色谱，其操作程序和操作步骤都几乎是相同的。

都是将适当粒度的吸附剂（载体）均匀涂布在玻璃板上（或其他支持物上）成一薄层，然后用毛细管或适当的点样器将样品液滴加在薄层的起始线上，待样点上的溶剂挥散后，置于密闭的色谱缸中，用一定的溶剂展开，当溶剂前沿到达离另一端2-3cm处，取出，干燥，显色。

样品中的混合物被分离形成各自独立的斑点，测量起始线至各斑点中心的距离，计算各斑点的比移值。

总结起来，薄层色谱的操作程序一般应是：

薄层板的选择和制备方法（吸附剂的选择）

供试品的制备（样品的前处理和制备）

展开剂的选择和配置

点样

展开

显色或定位

检测（定性和定量）

记录

第二章磷脂酶D发酵菌株的自然筛选

前期工作筛选的产磷脂酶D菌株,其产酶性能得到确认,但发酵水平低,不稳定,菌种的纯度不高,因而,需要经过自然选育纯化菌种,筛选较高产酶水平的菌株,建立高效的高产菌株筛选方法。

本文首先对菌种进行单孢子分离,对菌种进行分离纯化,对链霉菌进行富集培养,淘汰掉不能利用卵磷脂的菌株,减轻了筛选的工作量。

然后采用摇瓶培养,测定发酵液中磷脂酶D活力,采用两者相结合的方法,从而确立高效的筛选方法[11]。

2.1材料与仪器

2.1.1菌种

菌种为链霉菌LD0606,本实验室早期筛选并保藏。

2.1.2主要仪器及药品

实验所用主要仪器如表2-1:

表2-1链霉菌自然选育中所用主要器材

仪器

型号

厂家

薄层色谱展开缸

玻璃点样毛细管

碘蒸气染色缸

薄层涂敷器

电子天平

恒温烘箱

双波长薄层扫描器

赛多利斯酸度计

显微镜

加热磁力搅拌器

摇床

PQ

0.5mm×100mm

200cm×400cm

YOK-TF

T-114

PG6003

CS-930

PB-10

XSZ-G

SH-3

KYC100B

上海信仪仪器厂

华西医科大学仪器厂

上海信仪仪器厂

武汉药科新技术开发公司

美国丹佛（DENVER）

上海环宇仪器厂

日本岛津公司

常州锐品精密仪器有限公司

上海精密仪器有限公司

广州沪瑞明仪器有限公司

上海福玛实验设备有限公司

主要试剂及药品:

牛肉膏,蛋白胨,酵母粉,葡萄糖,琼脂粉,NaCl,MgSO4·7H2O,（NH4）2SO4,K2HPO4,CaCO4,FeSO4·7H2O,MnCl2·4H2O,ZnSO4·7H2O,HCl,NaOH,马铃薯等。

2.1.3培养基

PDA培养基:

马铃薯200.00g/l,葡萄糖20.00g/l,琼脂20.00g/l。

制备:

将马铃薯削去皮,切成块煮沸20~30min,然后用纱布过滤,再按比例加入葡萄糖及琼脂,pH自然,加热融化后,分装在18×180的试管中,用高压锅在121℃灭菌30min,等灭菌结束后,取出摆斜面。

种子培养基:

葡萄糖10.00g/l,酵母浸膏20.00g/l,蛋白胨5.00g/l,K2HPO42.00g/l,MgSO4·7H2O0.50g/l。

制备:

将葡萄糖、酵母浸膏、蛋白胨、K2HPO4、MgSO4·7H2O按比例配成溶液后,调pH至6.8~7.2,装入三角摇瓶,用高压锅在121℃灭菌20min,等灭菌结束后,取出待用。

发酵培养基:

葡萄糖10.00g/l,牛肉膏7.50g/l,蛋白胨7.50g/l,NaCl3.00g/l,MgSO4·7H2O1.00g/l。

制备:

将葡萄糖、牛肉膏、蛋白胨、NaCl、MgSO4.7H2O按比例配成溶液后,调pH至6.8~7.2,装入三角摇瓶,用高压锅在121℃灭菌20min,等灭菌结束后,取出待用。

2.2实验方法

2.2.1培养条件

斜面菌种培养条件:

培养温度28℃,培养时间7d。

种子培养基培养条件:

培养温度28℃,摇床转速200rpm,100ml三角摇瓶装液量20mo1（20%）,培养时间24hr。

发酵培养基培养条件:

培养温度28℃,摇床转速200rpm,500ml三角摇瓶装液量50mol（10%）,培养时间7d。

2.2.2纯化与自然选育

（l）始发菌株的纯化

单孢子悬液制备:

将出发菌株接种在斜面培养基上,28℃恒温培养6~7d,待抱子成熟后,加入少量0.9%的无菌生理盐水,将孢子用接种环轻轻刮下,倒入盛有玻璃珠的无菌试管,振荡,在无菌条件下用滤纸过滤。

稀释孢子悬液至每毫升含孢子107（血小板计数法）。

在无菌条件下,将己制备好的单孢子悬液调整成10-1、10-2、10-3、10-4、10-5不同的稀释度,混合均匀。

分别移取菌悬液0.1ml滴在PDA平板培养中心处,拿已灭菌的涂布器在其表面来回推动,然后改变方向沿其他方向继续推动。

随后,在生物培养箱中28°C条件下,培养7d。

从培养好的平板中随机挑选十几个长势较好且没有和其他菌落相粘连的单个菌落,分别接种于斜面培养基上,在生物培养箱中恒温28。

C培养7d。

观察生长情况,挑取生长饱满的菌落24株,每个菌落接种一支斜面,28℃条件下恒温培养。

（2）摇瓶复筛

将上述经初筛后的斜面,28℃恒温培养7d,待孢子成熟后,用接种环蘸取斜面的孢子,接种于100ml发酵培养基,28℃、摇床转速200rpm条件下发酵7d,滤纸过滤后,对发酵液进行酶活力测定。

2.2.3酶液的制备

将出发菌接种在在斜面培养基上，在恒温28℃、摇床转速200rpm的条件下，培养7d，待孢子生长成熟后，在干净工作台上操作，利用接种针将孢子轻轻刮下，接入PLD种子培养基里，放入摇床，在28℃,转速200rpm条件下，培养1d。

随后，再接入发酵培养基中，在上述相同条件下7天后取出离心，取上清液，进行酶活力测定，选出酶活力较好的酶液，在4℃下储存备用。

2.2.4酶活力测定的方法

磷脂酶D的活力单位定义为：

一个酶单位定义为每分钟引起1μmol底物消失或1μmol产物生成的酶的量。

本实验通过利用卵磷脂（PC）和乙醇胺在游离磷脂酶D（PLD0606）催化作用下合成磷脂酰乙醇胺（PE）的反应，对游离酶的活力进行测定，其反应方程如下：

C40H82NO9P（PC）+NH2CH2CH2OH→C9H18NO8P（PE）

将0.1gPC完全溶解于16mL乙醚中，加入0.5mLpH=5.5的乙醇胺，再向其中加入7mLpH=5.5醋酸缓冲溶液以及2ml酶液。

放入摇床反应30min后取样，利用薄层色谱法进行测定。

展开剂为（氯仿：

甲醇：

水：

浓氨水=13:

5:

0.8：

0.1）。

2.3结果与分析

2.3.1LDO606菌株的纯化

前期工作筛选的产磷脂酶D菌株,其产酶性能得到确认,但发酵水平低,不稳定,菌种的纯度不高,因而,需要经过自然选育纯化菌种。

2.3.2LD0606出发菌株的平板初筛

初筛从大量分离PLD生产菌株中随机挑选出菌株,采用平板筛选和摇瓶发酵筛选相结合的方法。

由于菌株数量多,工作量大,只能根据单菌落生长情况和菌落形态在平板上初步筛选有限数目的菌株,然后经过摇瓶发酵进行确认。

图2-1所示为数量级不同的菌悬液生长情况

2.3.3摇瓶复筛

复筛是对初筛得到的优良菌株的进一步验证,对长势好的菌株菌落进行接种斜面,28℃恒温培养7d,成熟后的孢子先接种于摇瓶种子培养基,ld后接种于摇瓶发酵培养基,发酵培养7d后,测定酶活力。

结果见图2-2所示:

图2-2摇瓶复筛结果

浓度梯度的平板,在28°C的条件下培养7d,结果显示各个平板随着浓度的降低,菌落个数也相对减少。

其中,NO.8菌株产酶活力较高,产酶水平较稳定,证明其纯度满足要求,命名为LD0606-8#,可作为下一步PLD发酵产酶条件优化的出发菌株。

2.4本章小结

（l）建立有效的平板筛选方法,提高筛选效率。

（2）通过摇瓶发酵并检测,筛选得到一株活力较高的菌株LD0606-8#。

第三章磷脂酶D发酵产酶条件优化

为了使经过产酶菌株得到更高的产量,转磷脂酰基的活力更高,还所以应该对磷脂酶D的发酵条件进行优化,因为在微生物中,影响其活力的条件还有碳源、氮源、无机盐、产酶促进剂、溶氧量等,使其的发酵水平达到最佳状态。

本文主要通过氮源、碳源、无机盐三方面对磷脂酶D发酵条件进行研究[12]。

3.1材料与仪器

3.1.1菌株

通过紫外诱变得到的链霉菌株LD0606-8#菌株。

3.1.2仪器及设备

实验所用主要仪器如表3-1所示:

表3-1发酵产酶条件优化中所用主要仪器

仪器

型号

厂家

薄层色谱展开缸

PQ

上海信仪仪器厂

玻璃点样毛细管

0.5mm×100mm

华西医科大学仪器厂

碘蒸气染色缸

200cm×400cm

上海信仪仪器厂

高压灭菌器

YX-280

江阴医疗设备厂

电子天平

T-114

美国丹佛（DENVER）

恒温烘箱

PG6003

上海环宇仪器厂

双波长薄层扫描器

CS-930

日本岛津公司

赛多利斯酸度计

显微镜

加热磁力搅拌器

恒温培养摇床

PB-