抗低温基因在蝴蝶兰中诱导表达.docx
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抗低温基因在蝴蝶兰中诱导表达
生命科学与技术学院
实验设计
乙
组
设计者:
陈国栋学号:
2009041102
张雪学号:
2009041147
分子生物学设计性试验
设计者:
陈国栋张雪
一、实验目的
将植物中普遍存在的能够赋予植物抗低温环境条件的基因从拟南芥中扩增出来,构建基因载体并导入到蝴蝶兰中
二、实验原理
低温适应过程的实质是细胞内基因表达发生变化的结果,低温条件特异性地诱导了细胞内一系列与细胞抗冻有关的基因表达。
根据查阅已有文献可知,利用分子生物学技术,已从拟南芥中分离出许多在低温适应过程中特异表达的基因,其中cor15a基因最为典型。
用PCR方法从拟南芥全基因组中扩增并克隆cor15a基因,并构建成表达载体后在转入蝴蝶兰,进而鉴定该基因在蝴蝶兰中的低温诱导表达功能。
三、实验材料、药品和仪器
1.材料
拟南芥蝴蝶兰大肠杆菌二元载体系统抗性标记为Y和N
2.药品
限制性核酸内切酶、T4连接酶、Marker和高保真DNA聚合酶、PCR引物、卡那霉素、各种培养基等。
3、仪器
PCR仪、制冰机、电子天平、微量移液器、高压灭菌锅、制冰机、烧杯、离心机、离心管、培养箱、三角瓶、超低温冰箱
四、实验流程设计:
抗低温基因的选取基因的提取
形成重组DNA分子导入大肠杆菌
载体的构建
推广栽培低温筛选导入蝴蝶兰阳性筛选
五、实验方法与步骤:
(1)抗低温基因的选取
根据查阅已有文献可知,利用分子生物学技术,已从拟南芥中分离出许多在低温适应过程中特异表达的基因,其中cor15a基因最为典型。
所以本实验选取的抗低温基因为cor15a。
(2)目的基因的提取
1、实验原理:
拟南芥基因组DNA的提取利用基因组DNA较长的特性,可以将其与细胞器或质粒等小分子DNA分离。
加入一定量的异丙醇或乙醇,基因组的大分子DNA即沉淀形成纤维状絮团飘浮其中,可用玻棒将其取出,而小分子DNA则只形成颗粒状沉淀附于壁上及底部,从而达到提取的目的。
分离基因组DNA时应尽量在温和的条件下操作,如尽量减少酚/氯仿抽提、混匀过程要轻缓,以保证得到较长的DNA。
根据Thomashow等报道的拟南芥低温诱导基因cor15a序列,合成1对引物,引物两端分别Hind
和BamH
的酶切位点。
以拟南芥基因组DNA为模板进行PCR扩增,纯化后即可得到cor15a基因。
2、实验试剂:
提取缓冲液Ⅰ:
100mmol/LTris·Cl,pH8.0,20mmol/LEDTA,500mmol/LNaCl,1.5%SDS。
提取缓冲液Ⅱ:
18.6g葡萄糖,6.9g二乙基二硫代碳酸钠,6.0gPVP,240ul巯基乙醇,加水至300ml。
80:
4:
16/氯仿:
戊醇:
乙醇
RnaseA母液
其它试剂:
液氮、异丙醇、TE缓冲液,无水乙醇、70%乙醇、3mol/LNaAc。
(1)拟南芥基因组DNA
(2)引物
(3)10×PCRBuffer
(4)2mMdNTPmix:
含dATP、dCTP、dGTP、dTTP各2mM
(5)Taq酶
3、实验过程:
、拟南芥基因组提取
(1)在50ml离心管中加入20ml提取缓冲液Ⅰ,60℃水浴预热。
(2)拟南芥幼苗或叶子5-10g,剪碎,在研钵中加液氮磨成粉状后立即倒入预热的离心管中,剧烈摇动混匀,60℃水浴保温30-60分钟(时间长,DNA产量高),不时摇动。
加入20ml氯仿/戊醇/乙醇溶液,颠倒混匀(需带手套,防止损伤皮肤),室温下静置5-10分钟,使水相和有机相分层(必要时可重新混匀)。
(4)室温下5000rpm离心5分钟。
(5)仔细移取上清液至另一50ml离心管,加入1倍体积异丙醇,混匀,室温下放置片刻即出现絮状DNA沉淀。
(6)在1.5mleppendorf中加入1mlTE。
用钩状玻璃棒捞出DNA絮团,在干净吸水纸上吸干,转入含TE的离心管中,DNA很快溶解于TE。
(7)如DNA不形成絮状沉淀,则可用5000rpm离心5分钟,再将沉淀移入TE管中。
这样收集的沉淀,往往难溶解于TE,可在60℃水浴放置15分钟以上,以帮助溶解。
(8)将DNA溶液3000rpm离心5分钟,上清液倒入干净的5ml离心管。
(9)加入5μlRNaseA(10μg/μl),37℃10分钟,除去RNA(RNA对DNA的操作、分析一般无影响,可省略该步骤)。
(10)加入1/10体积的3mol/LNaAc及2×体积的冰乙醇,混匀,-20℃放置20分钟左右,DNA形成絮状沉淀。
(11)用玻棒捞出DNA沉淀,70%乙醇漂洗,再在干净吸水纸上吸干。
(12)将DNA重溶解于1mlTE,-20贮存。
、PCR选取
(1)在冰浴中,按以下次序将各成分加入一无菌0.5ml离心管中。
10×PCRbuffer5μl
dNTPmix(2mM)4μl
引物1(10pM)2μl
引物2(10pM)2μl
Taq酶(2U/μl)1μl
DNA模板(50ng-1μg/μl)1μl
加ddH2O至50μl
(2)调整好反应程序。
将上述混合液稍加离心,立即置PCR仪上,执行扩增。
一般:
在93℃预变性3-5min,进入循环扩增阶段:
93℃40s→58℃30s→72
℃60s,循环30-35次,最后在72℃保温7min。
(3)结束反应,PCR产物放置于4℃待电泳检测或-20℃长期保存。
(3)载体的构建(二元载体系统)该载体从生物公司购买。
(4)重组DNA分子的构建
1、实验原理:
分子克隆中,连接反应通常发生在插入片段与载体之间,通过调整插入片段与载体之间的比例可以达到最大效率的重组连接.最佳比例是由构造及末端的类型所决定的.参与反应的末端不相容时,最佳比例为1:
1;参与反应的两个末端相容时,重组连接都需要较高的插入片段与载体的比例,如2:
1或/甚至4:
1。
2、实验用品:
主要仪器与材料
恒温摇床、隔水式恒温培养箱、涡旋振荡器、台式离心机、二元载体、无菌双蒸水、限制性核酸内切酶BamHⅠ酶(5单位-10单位),HindⅢ酶
(5单位-10单位),T4噬菌体DNA连接酶.
试剂酶解缓冲液(10×)TE缓冲液:
10mmol/LTris•HCl(pH8.0),1mmol/LEDTAT4噬菌体DNA连接酶缓冲液(10×):
660mmol/LTris•HCl(pH7.0),5mmol/L
50mmol/LDTT,10mmol/LATP.
溴化乙啶染色液:
将溴化乙啶溶于蒸馏水或电泳缓冲液使浓度达到10mg/mL,
避光保存,临用前用电泳缓冲液稀释10000倍-20000倍.
3、操作步骤:
(1)在灭菌的Eppendorf管中加入购买的载体2μg(20μL体积),4μL10×酶切缓冲液,14μL无菌双蒸水,1μLBamHI酶(5单位~10单位),1μLHindⅢ酶(5单位~10单位),与37℃保温1h~3h.
(2)在另一管中加入前面已制备好的cor15a片段2μg(20μL),4μL10×酶切缓冲液,14μL无菌双蒸水,1μLBamHI酶(5单位~10单位),1μLHindⅢ酶(5单位~10单位),同样与37℃保温3h。
(3)保温完毕后各取2μL酶解液做电泳分析.
(4)将余下的酶解液(38μL)用TE缓冲液稀释至300μL,加入1/10体积的醋酸钾溶液,再加入2倍体积的乙醇,置--20℃冰箱30min以上.12000r/min离心5min,弃上清液,70%乙醇洗涤沉淀物,去上清液,室温干燥后加入16μLTE缓冲液.
(5)互补粘端连接:
2个DNA片段溶解液各取4μL混合于一试管中,加入T4噬菌体DNA连接酶缓冲液4μL(10单位),无菌双蒸水28μL,于14℃保温14h~16h.
(6)取2μL作电泳检查,鉴定反应连接产物符合预想结构,可迅速做转化实验。
(5)感受态细胞的制备
1、实验原理:
受体细胞经过一些特殊方法(如电击法、CaCl
,RuCl等化学试剂法)的处理后,细胞膜的通透性发生变化,成为能允许许多有外源DNA的载体分子通过的感受态细胞。
2、实验用品:
(1)仪器和材料
恒温摇床电热恒温培养箱超净台分光光度计台式离心机离心管大肠杆菌DH5a
(2)试剂
基本培养基:
在三角瓶中,将15克琼脂与725mL水混合并高压灭菌。
待冷
却至55℃在到培养皿之前向琼脂溶液中加入:
250mL灭过菌的4倍盐溶液,2mL
灭过菌的1moL/L的MgSO
,2mL灭过菌的50mmoL/LCaCl
,20mL灭过菌的10%
葡萄糖以及2mL灭过菌的10mg/mL维生素B1(过滤除菌)。
4倍盐溶液:
6gNaH
PO
,3gKH
PO
,0.5gNaCl,1gNH
Cl,加水至250mL并调pH至7.4)。
LB培养基(1L)将10g胰蛋白胨,5g酵母提取物及5gNaCl溶于1L水中并
高压灭菌,若要配置含卡那霉素的LB培养基,则将15克琼脂加1LLB培养液中高压灭菌,待冷却至55℃,向其中加入1.5mL100mg/ml的卡那霉素。
0.1mol/LMgCl
和0.1mol/LCaCl
(含20%甘油)两者均调pH值至7.2并高压灭菌备用。
3、实验过程:
(1)氯化钙法
用划线培养法将大肠杆菌接种于基本培养基平皿上,于37℃倒置培养1d-2d.
将单个菌落接种于10mLLB培养液的试管中,37℃振荡(250r/min)培养过
夜。
向两个装有200mLLB培养液的500mL三角瓶中各加入4mL过夜培养细胞,
37℃振荡培养至光密度(OD600)值在0.5-0.6之间。
(约需1h-2h).
将每份细菌培养物分别倒入一个预先冰浴的无菌250mL离心瓶并置于冰上
保持20min.于4℃下离心10min,(8000r/min),弃去上清夜。
将每份沉淀轻缓的悬于100mL冰冷的0.1mol/LMgCl
(Ph7.2)溶液中,按上述方法再次离心。
去上清夜,并将每一份沉淀轻缓的悬浮于20mL冰冷的含20%甘油的0.1
mol/LCaCl
(Ph7.2)溶液中。
分装于微量离心管中,(每支1mL),-80℃储存备用。
注意:
1、为了获得高感受态细胞,应选用处于生长对数期的细胞,OD600值不应
高于0.6,并且在整个试验过程中均需将细胞置于冰上。
2、细胞在冰冻后即获得了感受性,在-80℃几小时后感受性达到最高值,
几个月内均能维持高水平的感受态。
(六)大肠杆菌感受态细胞转化宿主细胞和阳性克隆的筛选
1、实验原理:
大肠杆菌的转化过程是将质粒分子溶液或连接反应的混合物与感受态细胞的悬浮液混合放置一定的时间,以使得DNA能被细胞吸收,DNA进入细菌的确
切机制仍不清楚.将混合溶液于42℃热处理1min-2min,会诱导质粒DNA分子进入细胞,结果提高了转化效率.然后加适量生长培养基液于转化细胞,并在室温下培养,最终涂布于琼脂平板表面,培养至形成细菌单菌落.同一克隆中的所有细胞均起源于某一单独个体的分裂繁殖,因此所有细胞具相同的基因型。
通常是利用质粒载体携有某一抗生素基因来实现对琼脂平板上的菌落进行筛选的。
本实验以E.coliDH5a菌株为受体细胞,用
处理受使其处于感受态,然后pUC19质粒共保温实现转化.pUC19质粒带有抗氨苄青霉素的特性.将经过转化的全部受体细胞进行适当修饰,在含卡那霉素的平板培养基上培养,只有转化体才能存活,而未受转化的受体细胞则因无抵抗卡那霉素的能力而死亡,转化体经扩增后,可将转入的质粒DNA分离提取出来,用于电泳分析,限制型内切酶图谱的制作以及DNA测序等实验.
2、仪器、材料和试剂
(1)仪器和材料
恒温摇床电热恒温培养箱超净台分光光度计台式离心机离心管
大肠杆菌DH5aPuc19质粒DNAEppendorf管移液器液氮
(2)试剂
基本培养基:
在三角瓶中,将15克琼脂与725mL水混合并高压灭菌。
待冷
却至55℃在到培养皿之前向琼脂溶液中加入:
250mL灭过菌的4倍盐溶液,2mL
灭过菌的1moL/L的MgSO
,2mL灭过菌的50mmoL/LCaCl
,20mL灭过菌的10%
葡萄糖以及2mL灭过菌的10mg/mL维生素B
(过滤除菌)。
(4倍盐溶液:
6g
NaH
PO
,3gKH
PO
,0.5gNaCl,1gNH
Cl,加水至250mL并调pH至7.4)。
LB培养基(1L)将10g胰蛋白胨,5g酵母提取物及5gNaCl溶于1L水中并
高压灭菌,若要配置含卡那霉素的LB培养基,则将15克琼脂加1LLB培养
液中高压灭菌,待冷却至55℃,向其中加入1.5mL100mg/ml的卡那霉素。
0.1mol/LMgCl
和0.1mol/LCaCl
(含20%甘油)两者均调pH值至7.2并高压灭菌,备用。
TSS溶液:
10%PEG8000,5%DMSO,20mmol/LMgSO
以上各成分溶于100mLLB培养液中,过滤除菌(由于高压灭菌会使TSS液转化效果下降,PEG可以单独进行高压灭菌)。
3、实验过程:
氯化钙法制备的感受态细胞的转化
(1)将1ng-10ng(5Μl-10μL)质粒DNA加于1.5mL无菌离心管中,再用缓冲液
(Tris10mmol/L,pH7.7,0.1mmol/LEDTA)将体积调至100mL置于冰上.
(2)待感受态细胞在冰上融化后,向含有质粒DNA的离心管中加入200μL,混匀并
在冰上静置30min.
(3)将离心管放入42℃水浴中2min对细胞进行热处理.
(4)向上述试管中加入1mL预热(37℃)的LB培养液,于37℃下振荡培养
(250r/min)1h.
(5)将50μL-100μL上述培养液平铺于含有合适抗生素的LB固体培养基上,37℃培养过夜。
(7)导入蝴蝶兰
1、实验原理:
碱裂解法:
碱变性法又称碱抽提法或碱裂解法,是一种用的最广泛的制备质粒DNA的方法,此法是基于染色体DNA与质粒DNA的变性与复性的差异而达到分离目的。
在pH高达12.6的碱性条件下,染色体DNA的氢键断裂,双螺旋结构解开而变性,质粒DNA的大部分氢键也断裂,但超螺旋共价闭合环状的两条互补链不会分离。
当以pH4.8的NaAc高盐缓冲液调节起pH至中性时,变性的质粒DNA又恢复原来的构型,保存在溶液中,而染色体DNA不能复性而形成缠连的网状结构。
通过离心,染色体DNA与不稳定的大分子RNA、蛋白质-SDS复合物等一起沉淀下来而被除去。
基因枪法或称微弹轰击法是指利用高压气体,将表面附有外源DNA的金属微粒告诉射进植物的细胞或组织,可直接将外源基因导入幼苗,此法简便、有效。
2、实验用品:
(1)重组DNA的提取
仪器
微量移液器、微量离心管(又称Eppendorf管)、常用玻璃器皿、台式高速离心机、分光光度计
材料阳性筛选后的大肠杆菌DH5a
试剂及溶液LB培养基、葡萄糖
溶液1(GET)缓冲液:
50mmol/L葡萄糖,10mmol/LEDTA,25mmol/L
Tris-HClpH8.0,用前加溶菌酶4mg/Ml。
溶液2(变性液):
0.2mol/LNaOH,1%SDS
溶液3(醋酸钾溶液):
60mL的5mol/LKAc,11.5mL冰醋酸,28.5mL
PH4.8
缓冲液:
TBE缓冲液(10Χ):
称取Tris108g,硼酸55g,0.5mol/LEDTA(Ph8.0)40ML,用HO定容到1000mL高压灭菌作为10Χ贮藏,稀释10倍后作为工作液使用。
TE缓冲液:
10mmol/LTris-HCl,1mmol/LEDTApH8.0,其中含有RNase20μg/Ml
其他试剂:
异丙醇,70%乙醇等
(2)基因枪法
基因枪、钨粉或金粉蝴蝶兰幼苗等。
3、实验步骤:
重组DNA的提取
(1)培养细菌:
将阳性筛选后的大肠杆菌DH5a菌落,接种到LB液体培养基中,37C震荡培养8h—16h
(2)取液体培养液1.5mL于Eppendorf管中,转速10000r/min离心1min,去掉上清液,加入100μLGET溶液,充分混匀后在室温下放置5min。
(3)加入200μL新配置的变性液,颠倒2次-3次使之混匀,冰上放置5min。
(4)加入150μL冰冷的醋酸钾溶液(Ph4.8),颠倒数次混匀后,冰上放置5min。
(5)用台式高速离心机,转速为10000r/min,将上清液移入另一干净离心管,并
加等体积异丙醇混匀,室温放置5min后,12000r/min离心5min,弃去上清液。
(6)沉淀用70%乙醇清洗一次,离心管倒置于吸水纸上,除尽乙醇,室温自然干
燥。
(7)加入20μL含有RNase20μg/mL的TE缓冲液或灭菌蒸馏水溶解提取物,室温放置30min以上,使DNA充分溶解。
(8)—20℃保存备用。
基因枪法
(1)将直径为4μm的钨粉或金粉在供体DNA中浸泡适当时间。
(2)用基因枪将这些粒子打入蝴蝶兰细胞、组织或器官中。
(3)蝴蝶兰培养。
(8)蝴蝶兰低温筛选
1、实验原理:
利用导入抗低温基因后的蝴蝶兰和正常基因的蝴蝶兰在人工设置的低温环境下对导入抗低温基因的蝴蝶兰进行筛选。
2、实验用品:
前一步中导入了抗低温基因的蝴蝶兰正常生长的正常蝴蝶兰(具有和转基因蝴蝶兰基本相同的长势与相同数量)蝴蝶兰实验室培养液
低温光照培养箱
3、实验步骤:
(1)取相同数量的实验用品与分别在5℃、4℃、3℃中进行培养一定时间(具体时间视具体生长情况而定)
(2)统计实验数据,并进行分析。
从而筛选出具有抗低温性的蝴蝶兰植株。
(9)条件允许的情况下可以进行推广栽培。
六、实验周期预计:
本实验共涉及8个小实验,由于需要进行植物幼苗的栽培,实验过程中还会出现一些状况需要处理,故预计实验周期为20天。
七、可能出现的问题预测及解决方案:
(1)cor15a基因提取时,可能出现提取的基因两端序列虽然是Hind
和BamH
的酶切位点,但是基因不是cor15a基因。
解决方案:
对于这种问问题,应该采用大量提取后进行PCR以增加目的基因的提取量来解决。
(2)对导入目的基因的大肠杆菌进行筛选时可能出现假阳性。
解决方案:
可以再利用抗性基因进行筛选后再进行一下PCR检测和PCR-Southern鉴定(具体方法可查阅相关文献)。
(3)基因枪法进行外源基因向蝴蝶兰中导入时虽然简便、快捷、有效,但是,此法容易出现假阳性。
解决方案:
大量导入。
具体做法是外源基因要求要量大,蝴蝶兰幼苗也要求要量大!
并且要认真做好最后的筛选。
(4)对蝴蝶兰进行低温筛选时可能温度与时间不合理而导致筛选失败。
解决方案:
对筛选温度设定一定的梯度,这样不但可以筛选出成功导入的蝴蝶兰而且可以对抗低温基因的表达情况进行检测。
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