试验土霉素摇瓶发酵试验设计型试验.docx
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试验土霉素摇瓶发酵试验设计型试验
实验一土霉素摇瓶发酵实验(设计型实验)
一、实验目的
1、熟悉放线菌的微生物学特性及培养方法
2、了解和掌握种子制备和摇瓶发酵技术和方法
3、了解抗生素发酵的一般规律和代谢调控理论
4、熟悉和掌握常用的比色分析方法的操作技术
二、实验原理
土霉素是四环类抗生素,其在结构上含有四并苯的基本母核,随环上取代基的不同
或位置的不同而构成不同种类的四环素类抗生素。
其结构和命名如图。
1
2
3
4
CH3
R
R
R
R
N
H
H
CH3
OH
NHR5
OH
OHOOHOO
R1
R2
R3
R4
R5
土霉素
H
OH
CH3
OH
H
四环素
H
OH
CH3
H
H
金霉素
Cl
OH
CH3
H
H
去甲基金霉素
Cl
OH
H
H
H
多西环素
H
H
CH3
OH
H
米诺环素
N(CH3)2
H
H
H
H
美他环素
H
=CH2
OH
CH2(NH)CH(COOH)(CH2)4NH2
土霉素具有广谱抗菌性,能抑制多种细菌、较大的病毒及一部分原虫。
土霉素能抑
制细菌的生长,在浓度高的时候也具有杀菌的作用。
它的作用机制是干扰蛋白质的合成。
由于它的毒副作用小,所以其在医疗上用途广泛,主要是应用于呼吸道和肠道感染。
土霉素是由龟裂链丝菌产生的,属于放线菌中的链霉菌属,它们具有发育良好的菌
丝体,菌丝体分支,无隔膜,直径约0.4~1.0米,长短不一,多核。
菌丝体有营养菌丝、
气生菌丝和孢子丝之分,孢子丝再形成分生孢子。
而龟裂链丝菌的菌落灰白色,后期生
1
褶皱,成龟裂状。
菌丝成树枝分支,白色,孢子灰白色,柱形。
龟裂链丝菌的菌落形态显微镜观察的菌丝特征
土霉素是典型的次级代谢产物,其发酵的特点之一就是分批过程分为菌体的生长期、产物期和菌体期三个阶段。
龟裂链丝菌的生长和土霉素的生物合成受到许多发酵条件的影响:
温度、发酵pH值、溶氧、接种量、泡沫等。
同时还受到一些代谢调控机制的控制:
磷酸盐的调节作用、ATP的调节和产生菌生长速率的调节等。
三、仪器与材料
(一)培养基
1、斜面高氏一号培养基
可溶性淀粉2%氯化钠0.05%硝酸钾0.1%三水磷酸氢二钾0.05%
七水硫酸镁0.05%七水硫酸亚铁0.001%琼脂1.5%-2.0%pH:
7.4-7.6
2、母瓶培养基
淀粉3%黄豆饼粉0.3%硫酸铵0.4%碳酸钙0.5%玉米浆0.4%氯化钠0.5%
磷酸二氢钾0.015%pH:
7.0-7.2
3、发酵培养基
淀粉15%黄豆饼粉2%硫酸铵1.4%碳酸钙1.4%氯化钠0.4%玉米浆
0.4%磷酸二氢钾0.01%氯化钴10μg/ml消沫剂0.01%淀粉酶0.1%-0.2%pH:
7.0-7.2
(二)实验菌种:
龟裂链丝菌,微生物实验室保藏。
(三)仪器:
玻璃试管、试管架、吸管(1ml,2ml,10ml)、吸耳球、离心管、容量
瓶、烧杯、三角瓶(250ml,500ml)、量筒(250ml,500ml,1000ml)、玻璃棒、试纸、
塑料漏斗、电炉、接种铲(针)、振荡培养箱、恒温箱、台秤等。
2
四、实验题目
1、溶氧对土霉素发酵的影响。
2、培养基中磷量对土霉素发酵的影响。
3、接种量对土霉素发酵的影响。
4、碳源、氮源浓度对土霉素发酵的影响。
五、实验步骤
1.斜面孢子的制备
无菌条件下,从冷藏的产生菌的斜面孢子中,刮取适量孢子涂在高氏斜面上,然后
置36.5~37℃的恒温箱培养3天,再置30℃的恒温室培养1天。
2.种子的制备
(1)摇瓶种子培养基的配制
按母瓶培养基成分配比,配制培养基,并加淀粉酶液化后,再加入CaCO3,冷却后
调pH值,分装,包装灭菌。
(2)接种
在超净工作台上,将长好的斜面孢子用无菌接种铲挖块约2cm2,接种于灭过菌的摇
瓶种子培养基中。
(3)培养
将接种好的种子摇瓶于30℃恒温室摇床上,转速为230转/分,培养28小时左右。
3.发酵
(1)发酵瓶培养基的配制
培养基配方以发酵培养基配方为基础,依据实验题目不同而设计。
摇瓶装量依据实验题目而设计。
制备方法同种子瓶。
(2)接种
在超净工作台上,将培养28小时的摇瓶种子接种于发酵瓶中,接种量一般为10%
或依据实验题目而设计。
(3)培养
将接种后的发酵瓶于30℃恒温室摇床上摇6~7天,转速为230转/分。
(4)发酵样的测定:
发酵液状态观察:
粘度、颜色、气味、菌丝形态发酵样品预处理:
发酵瓶摇匀,将
少量倒入小烧杯,测pH。
用9mol/L的盐酸溶液酸化pH至1.7-2.0搅拌10分钟。
取5ml酸化液至7ml离心管,6000转离心4分钟,取上清液,备测。
3
发酵样品土霉素效价的测定:
采用分光光度法测定其效价。
土霉素标准曲线的绘制:
用土霉素标准样配成1000u/ml的标准液,用2ml移液管分别取标准液0.4ml、0.8ml、1.0ml、1.2ml、1.4ml、1.6ml、1.8ml于试管中,加0.01mol/L的盐酸共10ml,再加0.05%g/ml的三氯化铁溶液10ml,摇匀,静置20分钟,另取样同上,加0.01mol/L的盐酸使全量
为20ml,摇匀,作为空白,在480nm的波长下测定吸光度值,以土霉素效价为纵坐标,以吸光度值为横坐标绘制作标准曲线。
发酵液效价的测定:
吸取滤液稀释适宜倍数(使稀释后效价在标准曲线范围内),用移液管取1ml稀释液于试管中,准确加入0.01mol/L的盐酸,使全量为10ml,再加入
0.05%g/ml的三氯化铁溶液10ml,使全量为20ml,另取1ml稀释液,加入0.01mol/L的盐酸19ml,使全量为20ml,摇匀,放置20分钟,作为空白,在480nm的波长下测两种液体的吸光度。
六、实验报告
1、写出所选实验题目的实验方案和具体实验方法。
2、自己设计表格记录实验数据。
3、用图、表汇总实验结果。
4、对实验结果作出分析和讨论。
七、思考题
1、写出土霉素发酵工艺流程图。
2、通过查阅资料,试述次级代谢产物的发酵规律和代谢调节机制。
4
实验二土霉素提取实验
一、实验目的
1、了解和掌握发酵产物的分离提取流程。
2、熟悉和掌握等电点法结晶的原理与方法。
3、熟悉和掌握树脂脱色的原理和操作技术。
4、掌握常用的比色分析方法的操作技术。
5、掌握土霉素提取总收率的计算过程。
二、实验原理
土霉素的提炼主要是根据其理化性质进行的。
目前,土霉素的提炼工艺已经相当成熟,可采用沉淀法、溶媒萃取法、离子交换法和吸附法。
目前工业生产上主要采用等电点沉淀法。
其原理是利用土霉素具有两性化合物的性质,在其等电点时溶解度最小,从水溶液中结晶出来,以直接获取土霉素碱产品。
现在,工业上土霉素提炼工艺的具体过程是:
1、酸化
(1)酸化过程采用草酸酸化,使菌丝中的土霉素释放出来并生成溶于水的盐,并且
能析出草酸钙沉淀,从而去除发酵液中的钙离子,同时草酸钙能促进蛋白质的凝结,从
而提高滤液的质量。
另外,草酸属于弱酸,其对设备的腐蚀性要比盐酸、硫酸小。
(2)pH的控制:
加入草酸的目的是释放菌丝中的单位,同时要保证土霉素的稳定性、成品的质量和提炼成本。
目前,工业提炼的pH控制在1.6~2.0范围内,pH值过高对单位的释放不利,pH值过低会影响产品的质量,同时会增加产品的成本。
(3)发酵液的去杂:
发酵中存在着许多有机和无机的物质,加入净化剂黄血盐和硫酸锌除去铁离子和蛋白质。
去杂过程采用的净化剂是黄血盐和硫酸锌,利用二者的协同效应除去蛋白质,同时除去铁离子。
2、稀释:
将发酵液进行适当的稀释,一般稀释2~3倍,有利于过滤脱色过程。
3、过滤:
发酵液经过预处理后可用板框过滤机或真空抽滤瓶进行过滤,实现固液
分离。
工业上采用低单位滤液和草酸水顶洗滤饼以提高收率。
4、脱色:
采用122#树脂对滤液进行脱色,其原理利用122#树脂为阳离子交换树脂,
处理为氢型树脂后,所带的氢离子与色素蛋白质中的氮、氧形成氢键,对过滤液中的色
素有吸附作用,进行脱色。
要求脱色液在500nm下的透光率达85%以上。
(使用721型
分光光度计测定脱色液的透光率)。
5、沉淀结晶:
土霉素脱色液加入碱化剂调pH值到等电点附近,使土霉素从脱色液
5
中直接沉淀出来。
(1)碱化试剂的选择:
碱化试剂一般有氢氧化钠、氨水、碳酸钠、亚硫酸钠。
由于氢氧化钠碱性过强,单独使用会造成局部过碱,从而破坏土霉素,影响产品的质量,碳
酸钠虽然有抗氧化性和脱色的作用,但是它的碱性较弱,调pH所用的量比较大,氨水
的碱性比氢氧化钠弱比碳酸钠强,并且价格比较便宜,使用量适中,所以氨水是最好的
碱化试剂。
碱化过程中所用的氨水应当含有2%~3%的亚硫酸钠,这样既能调pH值,
又能起稳定的作用,同时还能脱色。
(2)pH值的控制:
pH值的不同,对产品的质量和产量会造成不同的影响。
土霉素的等电点是pH=5.4。
在等电点附近沉淀结晶比较完全,并且收率也比较高,但杂质的含
量比较高,会影响产品的色泽和质量。
所以一般控制pH值在4.4~4.8的范围内。
6、离心分离、干燥:
经过沉淀结晶后,结晶液进入到离心机中,进行固液分离,
离心后的晶体再经过正压干燥,即得到了土霉素碱产品。
化学法测定土霉素的效价是利用土霉素能和三氯化铁产生颜色反应,符合比耳定律的性质进行的。
由于土霉素中的酚基和三氯化铁反应呈褐色,在480nm下,用分光光度计,测定吸光度值,可定量土霉素的含量
三、仪器与材料
使用的仪器:
使用的试剂:
JJ200型精密电子天平草酸
酸度计七水合硫酸铜
气浴恒温振荡器六水合三氯化铁
离心机黄血盐
81-2型恒温磁力搅拌器氯化钾
AP-9901s真空泵氨水
BT01-100型蠕动泵亚硫酸钠
722型分光光度计浓盐酸
自动部分收集器硫代硫酸钠
土霉素碱标准品
122#树脂
6
试剂配制如下表:
试剂名称配置方法
称取三氯化铁500g(FeCl3·H2O称830克)用少
量蒸馏水溶解过滤,加浓盐酸30ml,加蒸馏水至4000
10%(g/mL)三氯化铁溶液毫升,根据初算结果用2mol/L的盐酸和蒸馏水调
节酸度至2mol/L和浓度为10%。
0.05%(g/mL)三氯化铁溶液量取10%三氯化铁溶液50ml,2mol/L盐酸
50ml,加蒸馏水至1000mL,摇匀。
9mol/L盐酸溶液量取蒸馏水500ml于2000mL试剂瓶中,加浓盐
酸1500mL,摇匀。
2mol/L盐酸溶液量取浓盐酸16.7mL加蒸馏水至100mL,摇匀。
0.01mol/L盐酸溶液量取2mol/L的盐酸50ml加蒸馏水至1000mL,
摇匀。
在分析天平上称取已知u/mL(生物效价)土霉
1000u/mg土霉素标准液素标准品W克,加1mol/L盐酸4ml,溶解完全后(约
5分钟),加蒸馏水至200mL,放冰箱备用。
四、实验方法
1.发酵液预处理
1.1取少量发酵液,按前述发酵液效价的测定方法测出其效价。
1.2取一定体积发酵液,边搅拌,边加入黄血盐0.35%、硫酸锌0.2%,并加
入草酸酸化发酵液pH至1.6~2.0,搅拌30分钟后,再将酸化液取出少许,按酸化液效价的测定方法测定其效价并计算酸化收率。
2.过滤
将酸化的发酵液稀释1倍,用真空抽滤瓶进行过滤,滤饼再用草酸水冲洗,测出滤液的体积。
按滤液效价的测定方法测定其效价并计算过滤收率。
3.脱色
3.1树脂预处理:
脱色采用122#树脂,使用前,要用1mol/L的盐酸和氢氧化钠交替处理树脂,最后将树脂转化为氢型后,蒸馏水洗至pH不变为止。
用抽滤瓶抽干,一般按每克树脂处理100000u的比例,根据滤液体积计算所用树脂,并称量待用。
3.2树脂柱的装柱方法:
将称量好的树脂搅匀(树脂旋浮于水中)缓缓倒入树脂
柱。
注意装柱时树脂柱中不能有气泡,如有气泡应立即排出。
脱色前后应注意不能
使树脂处于干燥状态,否则树脂会失效。
3.3脱色时要注意前一段时间的脱色液不要收集,待其效价达到2000u/mL
以上时再收集。
测定脱色液体积、效价和500nm下的透光率,并计算脱色收率。
4.结晶
7
取一定量脱色液放入4个锥形瓶中,用氨水调pH值为4.6,恒温30℃用磁力搅拌器搅拌,结晶,搅拌转数为70rpm,结晶一小时。
5.离心干燥
将结晶液离心,取上清液测定其在480nm下的吸光度,测定效价,计算出结晶收率。
湿晶体经过冲洗后,在50℃~70℃下干燥2小时~3小时,测定干粉的质量,然后将0.5g干粉用4mL1mol盐酸溶液溶解,测定其效价,计算干粉的效价及离心干燥收率。
6.检测方法
6.1pH的测定
(1)测样品不宜在室温下放置时间过长,应当在取样2分钟之内测定完,不能直
接测定的样品应收样放入冰箱,如需测定时提前从冰箱中取出放至室温测定。
(2)打开酸度计,调节温度补偿旋钮至室温。
(3)用pH=6.86和pH=4.0的缓冲液校准pH计。
(4)校准后,纯净水冲洗电极,将电极放入被测样中,待读数稳定后读数。
(5)测定样品后应该用纯净水冲洗电极,不用时应将电极放置在饱和氯化钾溶液
中。
6.2分光光度法测定土霉素效价
6.2.1土霉素标准曲线的绘制
用土霉素标准样配成1000u/mL的标准液,用2ml移液管分别取标准液0.4mL、0.8mL、1.0mL、1.2mL、1.4mL、1.6mL、1.8mL于试管中,加0.01mol/L的盐酸共10mL,再加0.05g/mL的三氯化铁溶液10mL,摇匀,静置20分钟,另取样同上,加0.01mol/L的盐酸使全量为20mL,摇匀,作为空白,在480nm的波长下测定吸光
度值,以土霉素效价为纵坐标,以吸光度值为横坐标绘制作标准曲线。
6.2.2土霉素样品效价的测定
(1)发酵液效价的测定:
取样品加9mol/L的盐酸溶液,先酸化至pH1.5~pH1.7,用酸度计测量,放置5分钟,过滤至5mL以上,吸取滤液稀释适宜倍数(使稀释后效价在标准曲线范围内),用移液管取lml稀释液于试管中,准确加入0.01mol/L的盐酸,使全量为10mL,再加入
1.05g/mL的三氯化铁溶液10mL,使全量为20ml,摇匀,放置20分钟,另取lmL稀释液,加入0.01mol/L的盐酸19mL,使全量为20mL,摇匀,放置20分钟,作为空白,在480nm的波长下测液体的吸光度。
(2)提取过程中间样效价的测定:
8
取中间样,稀释至适宜倍数(使稀释后效价在标准曲线范围内),以下操作同发酵液效价的测定方法。
(3)效价计算:
将测定的吸光度值代入标准曲线方程,再乘以稀释倍数即得各步效价。
五、实验报告
1、将实验各步测量的及计算的结果汇总于自己设计的表中。
2、计算总提取收率,并分析讨论收率高低的原因。
六、思考题
1.请写出土霉素提取工艺流程图。
2.写出草酸酸化的作用及酸化的注意事项。
9
实验三蛋白酶的固态发酵及提取实验
一、实验目的与要求
[1]熟悉和掌握蛋白酶固态发酵基本原理和工艺过程。
[2]熟悉和掌握蛋白酶提取的基本原理和工艺过程。
[3]了解影响固态发酵的各种因素以及曲霉产酶特性
[4]掌握蛋白酶的分析方法。
二、实验原理
固体发酵法作为一个古老的生物工艺早在几千年前已在食品和调味品上得到应用。
与液体发酵相比,固态发酵操作简易、工艺简单、能耗低,无废水废渣产生,不造成对环境的二次污染。
因此,固态发酵法目前在生产有机酸、发酵食品、酶制剂以及动植物废弃物、垃圾的处理和利用等方面有着广泛的应用。
本实验利用曲霉属菌种,通过固体发酵法生产蛋白酶并提取制得粗酶制品。
三、实验流程
米曲霉菌种纯化—→制成斜面—→种曲制备—→接种发酵—→麸曲(粗酶)
麸曲(粗酶)—→生理盐水浸提—→过滤—→稀酶液—→活力测定
四、实验材料及仪器设备
菌种:
米曲霉3042
种曲培养基:
麸皮6g,豆粕4g水10mL。
固态发酵培养基:
麸皮5g,豆粕5g,水10mL,121℃灭菌30min后冷却待用。
仪器与设备:
恒温培养箱、灭菌锅、接种铲、超净工作台、紫外可见分光光度
计(配石英比色杯)、离心机(10mL、10000rpm),水浴锅、移液枪、250mL和500mL三角瓶等
试剂:
磷酸盐缓冲溶液(pH=7.5)、5%三氯乙酸溶液、生理盐水、1.5%酪蛋白溶液
五、实验过程
1、种曲制备:
取250mL三角瓶装入20g固体培养基,121℃灭菌30min后冷却待
用。
用接种环接种斜面种子,32℃静置培养48小时,可观察到培养基表面长满菌丝,
制得种曲。
中间每隔一定时间观察培养物的变化情况,记录。
10
2、发酵:
取500mL三角瓶装入40g湿料(麸皮10g,豆粕10g,水20mL),121℃
灭菌30min后冷却待用。
用接种铲取适量种曲接种,振荡摇匀,30℃静置培养。
培养
20小时后,菌丝应布满培养基,第一次摇瓶,使培养基松散;每隔12小时检查一次,
观察培养物的变化情况,记录,摇瓶。
培养时间达到72小时后结束发酵。
3、蛋白酶提取与分析:
发酵结束后,将发酵培养物1g与15mL生理盐水混合,研磨,之后将混合液离心(8000rpm,5min)取上清液,得粗酶液,采用酪蛋白底物法测定蛋白酶活力。
六、蛋白酶活力测定
蛋白酶的活力测定采用酪蛋白水解法。
蛋白酶水解酪蛋白产生氨基酸,其中酪氨酸
和色氨酸在275nm处具有最大光吸收,吸光度的增加值与蛋白酶的活力成正比。
一个
酶活力单位定义为37℃、1min内水解酪蛋白产生275nm的吸光度相当于1ug酪氨酸所需要的酶量。
分别取两只试管加入2mL1.5%的酪蛋白溶液和0.8mL缓冲液,一支作为被测样品,
另一支作为对照。
向对照管中加入2mL5%三氯乙酸,使蛋白质变性出现白色絮状沉淀,
再加入0.4mL适当稀释后的酶液,摇匀。
向样品管中直接加入0.4mL酶液,摇匀。
二者同时放入37℃水浴中反应15min。
向样品管中加入2mL5%三氯乙酸终止反应。
离心分离(9000rpm,10min),分别取上清液,测定二者的吸光度,计算酶活力。
公式如下:
C=2.74165△A
C-酪氨酸浓度(mg/mL)
△A-样品和对照的吸光度差值
CV103N
X
181.9tV1
X-蛋白酶活力(u/mL)
V-反应液总体积(mL)
C-酪氨酸浓度(mg/mL)
N-稀释倍数
t-水解时间(min)
V1-酶液的体积(mL)
181.9-酪氨酸分子量
11
七、实验报告内容和数据处理
1.观察发酵过程中的现象并记录,分析
2.计算酶液的蛋白酶活力,并分析实验结果。
八、思考题
1.固态发酵培养基的含水量的高低变化对发酵和产酶过程有什么影响?
2.为什么在发酵过程中需要每隔一定时间,摇动三角瓶?
该过程工业上称之为“翻
曲”。
12
实验四啤酒酿造实验
一、实验目的
1、通过麦芽汁的制备,了解麦芽中所含的主要物质及酶系以及麦芽汁生产中的酶
的作用条件,物质的变化,掌握麦芽汁生产工艺方法。
2、熟悉啤酒发酵工艺流程,了解啤酒干酵母的使用方法与发酵工艺技术控制,掌
握啤酒发酵流程中产品监控指标及检测方法。
二、实验原理
利用煮出糖化法制备麦芽汁,下面啤酒酵母进行下面啤酒发酵,产生淡色下面啤酒是我国啤酒工业普遍采用的方法。
利用麦芽所含酶类的生化作用和热力的物理作用,通过部分麦芽醪的煮沸和并醪,麦芽汁中的高分子物质分解为可发酵性糖及可溶性浸出物并且溶解于水。
这些物质为啤酒酵母的发酵作用提供了物质基础。
为了避免过多的高分子多肽和水溶性蛋白质存在于成品啤酒中,从而造成啤酒的非生物性混浊,糖化后的成品麦汁需进行煮沸。
煮沸时高分子多肽和水溶性蛋白质会形成热凝固物而沉淀,消除了造成啤酒非生物混浊的隐患。
煮沸时还需添加酒花,它赋予啤酒爽口的苦味并可促进麦汁澄清。
在发酵过程中,啤酒酵母对麦芽汁中某些组分进行一系列代谢过程,产生酒精等各种风味物质,形成具有啤酒独特风味的饮料酒。
三、实验材料及仪器
1、实验仪器与设备
冰箱、高压灭菌锅、电炉(1000W带石棉网和调压器)、恒温水浴锅、酒精蒸馏装置、pH计、酒精表、500g天平、粉碎机、烧杯(1000ml两个、200ml一个)、三角瓶(1000ml)、布氏漏斗(D=20cm)、100ml容量瓶、量筒(100ml、500ml各两个)、温
度计、滤棉和纱布少许、电源、糖度计、点滴板、滴管两只、酵母接种针。
2、实验原料和试剂
麦芽或麦芽粉、大米粉、酒花或酒花粉、啤酒酵母、0.5%碘液、10%HCl。
四、实验步骤
1、本实验原辅料配比为:
麦芽粉90%,大米粉10%。
称取180g麦芽粉放入1000ml烧杯中,加水720ml,用玻璃棒搅拌均匀,置于恒温水浴锅上保温糖化。
2、另称取20g大米粉放入200ml烧杯中,加水100ml,用玻璃棒搅拌均匀,放在
电炉上进行糊化、煮沸。
然后,大米粉糊化醪与麦芽粉糖化醪合并,进行糖化至无碘反
13
应。
3、用布氏漏斗上面铺一层纱布,将糖化好的醪液倒入漏斗中保温过滤。
若开始滤
液不清,可回滤至清,再接受澄清麦汁于煮沸锅或大烧杯中。
滤完时,测定原麦汁浓度。
然后加清水洗糟,洗糟水温度为78℃左右,洗涤两次,洗糟水回收与原麦汁混合,最后
测定麦汁浓度。
控制在10oBx左右。
4、将过滤后的麦汁收集在大三角瓶中进行煮沸,总煮沸时间1~1.5h。
煮沸时添加
酒花:
麦汁煮沸后加入酒花总量的10%,40min
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- 关 键 词:
- 试验 土霉素 发酵 设计