重组质粒的构建.docx
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重组质粒的构建
目录
实验流程2
实验操作3
1.LB液体培养基的配置3
2.质粒的提取4
3.琼脂糖凝胶电泳5
4.PCR6
5.DNA片段的回收纯化...................................................................7
6.目的片段与载体连接及转化...........................................................8
7.菌种保藏…………………………………………………………...9
8.双酶切反应..10
实验流程——质粒构建
基因提取——1、2、3
PCR反应扩增目的基因——4、3
DNA片段回收——5、3
目的片段与载体连接及转化——6
菌种保藏——7
重组质粒提取——2、3
重组质粒检测:
(1)PCR
(2)双酶切——8、5
测序
实验操作
1.LB液体培养基的配置
【器材】
锥形瓶,烧杯,量筒,分析天平,药匙,高压蒸汽灭菌锅,棉花,报纸,记号笔,麻绳,纱布等。
【试剂】
酵母提取物(YeastExtract),胰蛋白胨(Tryptone),NaCl
【实验步骤】
1.LB液体培养基配方(配置1L培养基):
胰蛋白胨(Tryptone)10g
酵母提取物(YeastExtract)5g
NaCl10g
若配置50ml培养基,按培养基配方比例依次准确地称取酵母提取物:
0.25g、胰蛋白胨:
0.5g、NaCl:
0.5g放入烧杯中。
蛋白胨很易吸潮,在称取时动作要迅速。
另外,称药品时严防药品混杂,一把药匙用于一种药品,或称取一种药品后,洗净、擦干,再称取另一药品,瓶盖也不要盖错。
2.溶化
在上述烧杯中可先加入少于所需要的单蒸水,用药匙搅匀。
待药品完全溶解后,倒入50ml量筒中,补充水分到50ml,倒入锥形瓶中。
3.包扎
用棉塞或纱布封住瓶口,再在棉塞外包一层报纸,用绳子以活结形式捆扎好。
用记号笔注明培养基名称、组别、日期。
4.灭菌
将上述培养基以1.05kg/cm2(15磅/英寸2),121.3℃,20分钟高压蒸汽灭菌。
如因特殊情况不能及时灭菌,则应放入4°冰箱内暂存。
灭菌后,将锥形瓶放入烘箱烘干。
烘干后,4°保存。
【注】1.烧杯、量筒、锥形瓶应先用洗涤精洗干净,再用单蒸水润洗。
2.灭菌后应立即放入烘箱烘干。
3.培养基存放时间不宜过长。
2.质粒的提取
【器材】
加样枪、灭菌的Tip头、灭菌的Ep管、离心机
【试剂】
灭菌水、TaKaRaMiniBESTPlasmidPurificationKitVer.2.0
【实验步骤】
第一次使用本试剂盒时,请将RNaseA1混浊液全部加入到SolutionⅠ中,均匀混合后4℃保存。
实验操作前请将SolutionⅢ置于4℃(或冰上)预冷后使用。
1.大肠杆菌的培养。
从平板培养基上挑选单菌落接种至1~4ml的含有抗生素的液体培养基中,37℃过夜培养。
注)培养液不宜过量,培养液过量时,会因菌量太大而溶菌不充分,纯化时会影响质粒的纯度。
2.取菌液,12,000rpm离心2分钟,弃上清。
3.用250μl的SolutionⅠ(含RNaseA1)充分悬浮细菌沉淀。
注)注意不要残留细小菌块,可以使用振荡器(Vortex)等剧烈振荡使菌体充分悬浮。
4.加入250μl的SolutionⅡ轻轻地上下翻转混合5~6次,使菌体充分裂解,形成透明溶液。
注)此步骤不宜超过5分钟。
5.加入400μl的4℃预冷的SolutionⅢ,轻轻上下翻转混合5~6次,直至形成紧实凝集块,然后室温静置5分钟。
6.室温12,000rpm离心10分钟,取上清。
注)此时4℃离心不利于沉淀沉降。
7.将试剂盒中的SpinColumn安置于CollectionTube上。
8.将上述操作6的上清液转移至SpinColumn中,12,000rpm离心1分钟,弃滤液。
9.将500μl的RinseA加入SpinColumn中,12,000rpm离心30秒钟,弃滤液。
10.将700μl的RinseB加入SpinColumn中,12,000rpm离心30秒钟,弃滤液。
注)请确认RinseB中已经加入了指定体积的100%乙醇。
11.重复操作步骤10。
12.将SpinColumn安置于CollectionTube上,12,000rpm离心1分钟。
13.将SpinColumn安置于新的1.5ml的离心管上,在SpinColumn膜的中央处加入60μl的灭菌蒸馏水或ElutionBuffer,室温静置1分钟。
注)把灭菌蒸馏水或ElutionBuffer加热至60℃使用时有利于提高洗脱效率。
14.12,000rpm离心1分钟洗脱DNA。
15.DNA经1%琼脂糖凝胶电泳进行检测。
【注】提好的质粒需标明时间、名称等。
-20℃保存。
3.琼脂糖凝胶电泳
【器材】
分析天平,锥形瓶,量筒,微波炉,凝胶板,梳子,加样枪,Tip头,电泳槽,电泳仪,紫外投射仪
【试剂】
琼脂糖(Agarose),TAE电泳缓冲液,EB,Marker
【实验步骤】
1.称取1g琼脂糖(Agarose)粉末于锥形瓶中,加入100mlTAE。
保鲜膜封口,扎孔。
2.在微波炉中加热,沸腾两次,直到看不出油滴,形成均一的溶液。
3.倒入污染区的锥形瓶中,待冷却至60℃时加2ulEB,混匀。
4.插入梳子,倒入制胶槽中。
5.室温静置20min.
6.待凝胶全部凝结后,拔出梳子,将凝胶放入电泳槽中,加缓冲液直到没过凝胶为止。
7.按下表加样:
适用于检测DNA(小孔):
Marker(DL2000)样品1样品2
3ul1ul(6×buffer)+3ul1ul+3ul
适用于回收DNA(大孔):
Marker(DL2000)样品1
5ul17ul(6×buffer)+100ul(质粒)
6.电泳15分钟左右。
【注】
1.当加入的样品量小于5ul时,6×buffer均加1ul。
2.电泳时的加样孔宽度小于6mm时,每次取5μl制品电泳便可得到清晰条带。
如果加样孔增宽,须适当增加Marker制品的加样量。
3.对DNA电泳而言,Agarose的纯度对DNA条带的清晰度影响很大。
4.进行Agarose电泳时,Agarose的浓度与DNA片段的分离性能关系密切。
Agarose浓度越大,对短片段DNA分离性能越好;反之,Agarose浓度越小,越有利于长片段DNA的分离。
5.当电泳后片段需回收时,选用大孔胶,当电泳只起检测作用时,选用小孔胶。
6.若电泳产物需要回收,则需换新的缓冲液。
7.本实验室有两种常用Marker,分别为DL2,000DNAMarker和λ-EcoT14ⅠdigestDNAMarker。
Agarose电泳图像示意图如下:
4.PCR
【器材】
加样枪、灭菌PCR管、灭菌Tip头、PCR扩增仪、冰袋
【试剂】
DNA模板、引物、灭菌水、buffer、dNTP(mix)、Taq酶
【操作步骤】
加样前应先打开PCR仪,预热。
1.在0.5mlPCR管中加入下列试剂:
50ul体系:
灭菌水:
38ul
10×buffer(LA):
5ul
dNTP:
4ul
质粒:
0.5ul
F:
1ul
R:
1ul
LA(冰上):
0.5ul
总体积50.0ul
20ul体系:
灭菌水:
13.35ul
10×buffer(EX):
2ul
dNTP(Mix):
2ul
质粒:
0.5ul
P1:
1ul
P2:
1ul
EX(冰上):
0.15ul
总体积20.0ul
2.将上述PCR反应混合物混匀放入PCR仪中。
3.设定程序进行扩增:
94℃----------5min
94℃----------30s
55℃(退火温度不固定,根据引物进行调整)-----------1min
72℃----------30s(延伸时间根据目的片段的长度进行调整)
72℃----------7min
共30个循环
4.PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳进行检测。
【注】
1.当PCR反应后的产物目的片段还需进行后续操作时,选用LATaq酶;当PCR反应用于检测时选用EXTaq酶.
2.buffer的选择应与酶的选择相对应。
例如:
LATaq酶对应的buffer为10×LAPCRBuffer.
3.在PCR小管中加样时,应先将各试剂加到管壁上,最后混匀。
这样既节省时间,又节省枪头。
5.DNA片段的回收纯化
【器材】
加样枪、灭菌的Tip头、灭菌的Ep管、水浴锅、离心机
【试剂】
TaKaRaAgaroseGelDNAPurificationKitVer.2.0、灭菌水
【操作步骤】
1.实验前将水浴锅调到75度;将灭菌水放入烘箱中加热;空管去皮。
2.使用TAE缓冲液制作琼脂糖凝胶,然后对目的DNA进行琼脂糖凝胶电泳。
3.在紫外灯下切出含有目的DNA的琼脂糖凝胶,用纸巾吸尽凝胶表面的液体。
此时应注意尽量切除不含目的DNA部分的凝胶,尽量减小凝胶体积,提高DNA回收率。
注)切胶时请注意不要将DNA长时间暴露于紫外灯下,以防止DNA损伤。
先切后验证。
4.切碎胶块。
胶块切碎后可以加快操作步骤6的胶块融化时间,提高DNA的回收率。
5.称量胶块重量,计算胶块体积。
计算胶块体积时,以1mg=1μl进行计算。
6.向胶块中加入胶块融化液DR-IBuffer,DR-IBuffer的加量如下表:
凝胶浓度DR-IBuffer使用量
1.0%3个凝胶体积量
7.均匀混合后75℃加热融化胶块(低熔点琼脂糖凝胶只需在45℃加热)。
此时应间断振荡混合,使胶块充分融化(约6~10分钟)。
注)胶块一定要充分融化,否则将会严重影响DNA的回收率。
8.向上述胶块融化液中加入DR-IBuffer量的1/2体积量的DR-IIBuffer,均匀混合。
当分离小于400bp的DNA片段时,应在此溶液中再加入终浓度为20%的异丙醇。
9.将试剂盒中的SpinColumn安置于CollectionTube上。
10.将上述操作7的溶液转移至SpinColumn中,12,000rpm离心1分钟,弃滤液。
注)如将滤液再加入SpinColumn中离心一次,可以提高DNA的回收率。
11.将500μl的RinseA加入SpinColumn中,12,000rpm离心30秒钟,弃滤液。
12.将700μl的RinseB加入SpinColumn中,12,000rpm离心30秒钟,弃滤液。
注)请确认RinseB中已经加入了指定体积的100%乙醇。
13.重复操作步骤11。
14.将SpinColumn安置于CollectionTube上,12,000rpm离心1分钟。
15.将SpinColumn安置于新的1.5ml的离心管上,在SpinColumn膜的中央处加入12.5μl的灭菌蒸馏水或ElutionBuffer,室温静置1分钟。
16.重复操作步骤15。
注)把灭菌蒸馏水或ElutionBuffer加热至60℃使用时有利于提高洗脱效率。
17.12,000rpm离心1分钟洗脱DNA。
6.目的片段与载体连接及转化
【器材】
超净台:
酒精灯、打火机、加样枪、灭菌PCR管、灭菌Tip头、摇床、冰袋、水浴锅
【试剂】
PMD-18载体、目的片段、SolutionⅠ、感受态细胞、LB培养基(加Amp)、含AMP的琼脂培养基
【实验步骤】
1.实验前水浴准备。
2.在PCR管中加入:
PMD-18载体:
1ul
目的片段:
4ul
总体积5ul
3.再加入5ulSolutionⅠ
4.16℃,连接90min
5.全量10ul加入至感受态细胞中,冰上放置30min.
6.42℃,热激45s.
7.冰上,1min.
8.加890ulLB培养基(不加Amp),37℃摇床培养60min。
9.涂布在含AMP的琼脂培养基上,过夜培养。
(3ml培养基中加入3ulAMP)
10.第二天晚上五点挑菌,在3mlLB培养基(加Amp)中培养,37℃过夜。
7.菌种保藏
【器材】
超净台:
酒精灯、打火机、1ml加样枪、灭菌Tip头
【试剂】50%的甘油
【实验步骤】
1.实验前超净台灭菌。
2.将500ul50%的甘油与500ul菌液混合,-80℃保存。
8.双酶切反应
【器材】
水浴锅、灭菌Tip头、0.5mlPCR管、加样枪
【试剂】
Buffer、限制酶1、限制酶2、重组质粒、灭菌水
【实验步骤】、
1.实验前水浴准备。
2.在0.5mlPCR管中加入下列试剂:
体系:
灭菌水:
5ul
Buffer:
1ul
质粒:
3ul
限制酶10.5
限制酶20.5
总体积10.0ul
3.37℃水浴,1.5小时以上。
4.琼脂糖凝胶电泳检测双酶切产物。
【注】
1.酶的选择:
载体上有酶切位点,但目的片段上没有该酶的酶切位点,且所选择的酶为常用酶。
2.Buffer的选择:
需要参考所选择的酶,必须同时适用于两种酶。
相关资料请查询双酶切通用缓冲液使用表。
例:
若选用BamHI、HindIII,则buffer选用10×K。
3.反应温度的选择:
需要参考所选择的酶,必须同时适用于两种酶。
相关资料请查询TaKaRa中文目录。
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