免疫组化原理及概述.docx
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免疫组化原理及概述
免疫组化原理及概述
2008-05-2816:
42:
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一、免疫细胞化学技术的概述
*免疫细胞化学(immunocytochemistry,ICC)
-是利用抗原与抗体特异性结合的原理,通过化学反应使标记抗体的显色剂(荧光素、酶、金属离子、同位素)显色来确定细胞内抗原的成分(主要是多肽和蛋白质),对其进行定位、定性及定量的研究,称为免疫细胞化学。
(一)对抗原和抗体的要求
*具有特异性高和亲和力强的抗体是实验成功的首要条件。
-对抗体的要求:
纯度高、比活性强;
*高度特异性抗体的获得,取决于抗原的纯度。
-对抗原的要求:
纯度高,免疫原性强,稳定无变化。
(二)抗原(antigen,Ag)
*抗原的概念:
凡是在机体内引起体液免疫和(或)细胞免疫反应的物质,称为抗原。
抗原具有两个方面的特性:
-免疫原性:
引起机体产生抗体和(或)致敏淋细胞的特性;
-免疫反应性:
抗原能与相应的抗体及致敏淋巴细胞发生特异的结合或反应的特性。
*根据抗原是否显示免疫原性分为:
-完全抗原:
分子量较大,一般在10kDa以上,并具有较复杂的化学组成。
*免疫原性最强的是蛋白质抗原,多糖次之;脂类和核酸必需和蛋白质及多糖形成复合物才具有良好的免疫原性。
-半抗原:
又称为不完全抗原,分子量较小。
例如:
某些短肽、多糖、类脂和药物等。
*半抗原必需与载体结合,才能获得免疫原性。
载体
*通常是具有高度免疫原性的大分子物质,具有将免疫原性传递给耦联的半抗原能力。
-常用的载体有钥孔血蓝蛋白(keyholelimpethemocyanin,KLH)、牛血清白蛋白(bovineserumalbumin,BSA)、卵白蛋白(Ovalbumin,OVA)等。
-用戊二醛或碳化二亚胺作为交联剂通过功能基团-NH2、-COOH等将半抗原结合到载体上。
结合比例为5kDa结合5~25个分子的小肽。
(三)抗体(antibody,Ab)
1、抗体的概念:
*机体受到抗原刺激后,由浆细胞合成并分泌出一类具有与抗原发生特异性结合的球蛋白,被称为抗体。
-抗体主要存在于血清内;
-抗体都是免疫球蛋白,但免疫球蛋白并不一定都是抗体。
-免疫球蛋白根据重链的结构及抗原特异性不同分为五种,既IgG、IgD、IgE、IgA、IgM。
2、免疫组化实验中常用的抗体:
单克隆抗体和多克隆抗体。
*单克隆抗体:
是一个B淋巴细胞克隆分泌的抗体,是应用细胞融合杂交瘤技术免疫动物制备的。
-特异性强、抗体产量高。
*多克隆抗体:
是将纯化后的抗原直接免疫动物后,从动物血中所获得的免疫血清,是多个B淋巴细胞克隆所产生的抗体混合物。
-特异性低,会产生抗体的交叉反应。
-多克隆抗体广泛应用于石蜡包埋组织切片,可减少假阴性染色机会。
-抗原与抗体的结合,要求量保持一定比例,当抗原或抗体过量时,是不能聚合成大颗粒。
3、抗体的制备——多克隆抗体的制备
*动物的选择
*佐剂(adjuvant)
*免疫方法
*免疫剂量
*抗体效价的测定
*放血或定期抽血
(1)动物的选择
选择什么动物来免疫取决于:
*所需抗血清的量
-小鼠只能提供1.0~1.5ml的血液,而山羊能提供几升。
*能供免疫用的抗原量
-小鼠50&61549;g足够,而山羊需要几毫克。
(1)动物的选择(续)
*动物的品系:
免疫动物与提供抗原的动物之间的种系差异越大越好。
-例如哺乳动物的抗原可选择非哺乳动物来制备抗体。
-常用的动物有兔、羊、马、猪等,以兔(新西兰兔,年轻,健壮,体重在2.5kg左右,雄性)为最常用。
(2)佐剂(adjuvant)
*一般可溶性抗原注射后,迅速从注射部位扩散、吸收代谢。
佐剂可延长潴留时间,且延长免疫刺激作用。
因此在制备抗体的过程中,常将抗原和佐剂一起注射。
*最常用的佐剂是弗氏佐剂,又分为:
-弗氏不完全佐剂(Freund'sincompleteadjuvant)
-弗氏完全佐剂(Freund'scompleteadjuvant)
弗氏不完全佐剂
(Freund'sincompleteadjuvant,FIA)
*是由油剂(石蜡油或植物油)与乳化剂(羊毛脂或Tween80)混合而成,比例为1:
1、2:
1、3:
1或5:
1,可根据需要而定,通常2:
1。
*使用时与水溶性抗原按1:
1比例充分混合,使抗原分散在佐剂中形成油包水乳剂。
弗氏完全佐剂(Freund'scompleteadjuvant,FCA)
*在弗氏不完全佐剂中加入活卡介苗或死的结核分枝杆菌(终浓度为2~20mg/ml),即成为FCA。
*免疫动物时,将弗氏佐剂与抗原按体积1:
1混合乳化后(油包水)注入动物。
-一般首次注射时用完全佐剂乳化,第二次或第三次注射时用不完全佐剂或不用佐剂。
佐剂与抗原乳化的方法
*研磨法:
适于制备大量的佐剂抗原
-先将不完全佐剂加热,取1.73ml放人无菌玻璃研钵内;缓缓滴入0.23ml活卡介苗,边滴边按同一方向研磨,使菌体完全分散。
-按同样方法滴人抗原,每加一滴应研磨至小滴消失。
滴加抗原的速度要慢,待抗原全部加人后,应成为乳白色粘稠的油包水乳剂。
*缺点:
研钵壁上粘附大量乳剂,抗原损失较大,对微量或难得抗原不宜采用。
佐剂与抗原乳化的方法(续)
*注射器混合法
-将等量的完全佐剂和抗原分别吸人两个5ml注射器内,然后插入三通管内,交替推动针管混匀,往复操作直至形成粘稠的乳剂为止。
*优点:
无菌操作,节省抗原或佐剂。
*缺点:
不易乳化,时间长。
佐剂与抗原乳化的方法(续)
*快速乳化法:
利用超声波粉碎器可快速乳化抗原和佐剂混合物。
-将抗原和佐剂按所需量加入一离心管中,置于超声波粉碎器上,粉碎头浸入液面下0.5cm,离瓶底0.5cm左右,以免打碎离心管。
-每次乳化10~15s,然后置冰箱lmin左右。
反复乳化3~4次即可完全乳化。
管内残余量800r/min离心5~10min收集。
*优点:
简单、快速、节省材料。
乳化剂的鉴定
*判断乳化是否充分,可将一滴乳化好的液体滴在水面上(冷水中),如能长时间保持圆珠形而不散开,表示乳化达到要求。
(3)免疫方法——免疫途径
*常有静脉、腹腔、肌肉、皮下、皮内、淋巴结、脚掌等注射。
*一般采用多点注射方法
-常在足、掌、腋窝淋巴结周围、背部两侧、颌下、耳后等处的皮内或皮下。
-皮内易引起细胞免疫反应,有利于提高抗体的效价。
(3)免疫方法——免疫途径(续)
*几点说明:
-大动物一般不用腹腔注射
-颗粒抗原和使用佐剂时不能静脉注射
-抗原宝贵可采用淋巴结内微量注射法,只需10~100&61549;g抗原即可获得较好的免疫效果。
-皮内注射较困难,特别是天冷时更难注入。
(3)免疫方法——次数及间隔时间
*次数一般为2~3次(初次免疫和加强免疫)
-首次注射后,10~15天再加强注射;
-剂量同首次或为首次的一半,用不全佐剂或不用佐剂。
*间隔时间,一般而言,动物越大,间隔越长
-豚鼠、大鼠为7~8天,兔子为10~15天,羊为14~28天;
-第三次注射的间隔时间更长些,效果更好。
举例1:
家兔的免疫
*初次免疫
-用50~200&61549;gAg加入FCA,在背部皮下注射6~8点,每点0.1~0.2ml,也可肌肉内或皮内注射;
*两周后,加强免疫
-将50~200&61549;gAg于PBS或FIA中,在肌肉、皮下、静脉或腹腔内注射;
*抗体效价的检测:
加强免疫一周后,耳缘静脉采血
-抗体效价测定可用环状沉淀试验、琼脂双向扩散法等方法。
前者抗体效价在1:
4000以上,后者在1:
16以上,即可采血,取血清进一步提纯。
举例2:
微量抗原淋巴结内注射免疫家兔
*一般选择2.5~3.0kg的新西兰种公兔
-先在其两脚垫注射完全福氏佐剂0.2ml(卡介苗每兔合5mg);
-10天后,见胭窝淋巴结肿大,然后将抗原注射至肿大的淋巴结内,第一次注射抗原用完全福氏佐剂混合乳化;
-以后每隔20天用不完全福氏佐剂乳化抗原,以同样方法加强2次,各次注射的抗原均为25~50&61549;g;
-末次注射两周后兔耳放血测价(可达1:
128)。
举例3:
豚鼠和大鼠的免疫
*初次免疫
-用10~100&61549;gAg加入FCA,在背部皮内注射4~6点,每点0.lml,也可肌肉内或皮下注射;
*加强免疫
-每隔7~8天,将10~50&61549;gAg于PBS或FIA中。
在肌肉、皮下或静脉注射;
*抗体效价的检测
(4)免疫剂量
*抗原性强的抗原量应小,过大反会引起免疫抑制;
*免疫周期长的动物可少量多次注射,短的可大量少次。
(4)免疫剂量(续)
*各种动物首次免疫抗原剂量和加强免疫的剂量
(5)抗体效价的检测
多采免疫双向扩散法
【基本原理】
*指抗原和抗体在同一凝胶内都扩散,彼此相遇后形成特异性的沉淀线。
-将抗原与抗体分别加入同一凝胶板中两个相隔一定间距的小孔内,使两者进行相互扩散,当抗原抗体浓度之比相适宜时,彼此相遇形成一白色弧状沉淀线。
*优缺点:
简便,但敏感性较低,易出现假阴性结果。
免疫双向扩散法的操作步骤
*将玻璃板用水洗净后用75%乙醇冲洗,晾干后放在水平台上备用。
*将1%agar融化后,置56℃水浴。
*在玻璃板上铺胶,约1.5mm厚,凝固后打孔(直径3rnm),孔间距10mm。
*中心孔加5&61549;l抗原样品,周围孔内每孔加5&61549;l抗血清(抗体预先作系列倍比稀释即1:
2、1:
4、1:
8、1:
16、1:
32等比例)。
*凝胶板置湿盒内,室温扩散24h。
*观察结果。
抗体效价检测的其它方法
*环状沉淀试验,需较多的抗血清,现已很少用;
*对流免疫电泳,比琼脂免疫双扩散法敏感,较简便、实用;
*酶联免疫吸附试验(ELISA)。
#放血或定期抽血
常用以下3种方法
*颈动脉放血法:
放血量较多,动物不易中途死亡。
例如:
2.5kg白兔可放血约80ml。
家兔、山羊、绵羊等动物采血常用此法。
*心脏采血法:
常用于家兔、豚鼠、大白鼠、鸡等小动物,但操作不当易引起动物死亡。
*静脉采血:
家兔可用耳缘静脉采血;山羊、绵羊、马和驴可用颈静脉采血,这种放血法可隔日1次,有时可采集多量血液。
#放血或定期抽血(续)
*采血过程中,动作要轻柔,尽量避免溶血
*血液凝固后,及时离心收集血清,否则细胞溶解释放的杂蛋白(例如蛋白水解酶)将污染抗体并将抗体水解,降低效价;
*加叠氮化钠,分装,低温保存,也可加一定的保护剂如BSA、甘油等。
二、组织和细胞标本的制备
*标本制备恰当,是免疫组化成功的首要条件
*免疫组化对组织和细胞标本的要求
-保持所检标本原有的结构、形态;
-在原位最大程度地保持待测抗原(或抗体)的免疫活性,既不淬灭、流失或弥散,也不被隐蔽。
*免疫组化的组织和细胞标本,制作流程与常规处理方法基本相同,但对组织、细胞的处理又有其特殊要求及注意事项。
-各种抗原由于其含量及特性的差异对标本处理方式常有不同要求,因此要选择适用于本实验的最佳方法。
免疫组化中常用的组织和细胞标本
*组织标本
-石蜡切片
-冰冻切片
*细胞标本
-组织印片
-细胞培养片(细胞爬片)
-细胞涂片
(一)石蜡切片
*石蜡切片是制作组织标本最常用、最基本的方法
-最大优点是组织形态保存好,且能作连续切片,有利于各种染色对照观察;
-石蜡块还能长期存档,供回顾研究。
*石蜡切片制作过程对组织内抗原显现有一定的影响,但可通过某些措施予以改善,因而它是大多数免疫组化中首选的组织标本制作方法。
1、取材的特殊要求及注意事项
*标本新鲜:
一般在2h以内进行,超过2h,组织将有不同程度的自溶,其抗原或变性消失,或严重弥散。
*取材部位:
除取病灶或含待检抗原部位外,还应取病灶与正常交界处,即所取组织切片中同时应有抗原阳性和阴性区,以形成自身对照。
-细胞坏死后,不仅抗原弥散或消失,而且常引起非特异着色,干扰观察,因此取材时应尽可能避开坏死区。
1、取材的特殊要求及注意事项(续)
*避免挤压:
取材时组织受挤压可使边缘部细胞形态改变并加深非特异着色,因而取材时应使用锋利的刀刃;
-镊取组织动作要轻;
-经窥镜直接钳取的组织往往有过度挤压,观察结果时应有所考虑。
2、固定及常用的固定液
*取材后的组织需立刻投于固定剂中
-固定使组织和细胞的蛋白质凝固,终止内源性或外源性酶反应,防止组织自溶或异溶,以保持原有结构和形态;
-对免疫组化而言更有原位保存抗原的作用,避免抗原失活或弥散。
*常用固定液:
固定剂品种很多,但大多属于醛类和醇类。
其固定原理不同,各有优缺点。
-醛类(常用甲醛、戊二醛和多聚甲醛)
-醇类(常用乙醇)
-其它(丙酮)
(1)醛类
*甲醛(福尔马林)应用最广
-原理:
形成分子间的交联,影响蛋白构型而使之固定。
-优点:
形态结构保存好,且穿透性强,组织收缩少。
-缺点:
*甲醛放置过久可氧化为甲酸,使溶液pH降低,影响染色;
*醛基与抗原蛋白的氨基交联形成羧甲基,使抗原决定簇的三维构象出现空间障碍;
*分子间交联形成的网格结构可能部分或完全掩盖某些抗原决定簇,使之不能充分暴露。
可造成假阴性的染色结果。
-注意事项:
*缩短固定时间,降低固定温度(4&61616;C),为此组织块不宜过厚。
*改用中性缓冲福尔马林,以pH值7.2~7.40.01mol/L的磷酸盐缓冲液配制成10%甲醛固定液,减少固定液pH的变化。
*固定后充分水洗以减少分子间交联。
*切片在作免疫组化染色前,先经预处理使抗原再现(抗原修复)。
*戊二醛:
-穿透性强,微细结构保存好,但对抗原有一定影响,常与其他固定剂联合用作免疫电镜固定液。
*多聚甲醛(常用4%):
-可用于免疫电镜;也可用于免疫荧光染色。
*主要检测组织内一些性能娇弱的抗原特别是细胞表面抗原,例如各类淋巴细胸分化决定簇(CD)、主要组织相容性抗原等。
(2)醇类
*最常用的醇类固定剂是乙醇。
-其固定作用:
使细胞内蛋白、糖类发生沉淀。
-优点:
穿透性强、抗原性保存好。
-缺点:
*脱水性强,易引起组织收缩、变硬,影响切片质量,因而乙醇固定时间不宜过长(2h内)。
*乙醇使蛋白变性的作用轻,固定后可再溶解;染色过程中,温育时间长,抗原可流失而减弱反应强度。
(3)其它固定剂
*丙酮:
-对抗原性的保存好,但脱水性更强,较少用于组织标本,但细胞爬片常用丙酮固定。
3、抗原修复——原因
*常规的石蜡切片标本均用甲醛固定,结果使得:
-抗原性物质形成醛键、羧甲键而被封闭了部分抗原决定簇;
-蛋白之间发生交联而使抗原决定簇隐蔽。
*要求:
在染色时,需要先进行抗原修复或暴露,即将固定时分子之间所形成的交联破坏,而恢复抗原的原有空间形态。
3、抗原修复——方法
*化学方法
*加热方法
-水浴加热法
-微波照射法
-高压加热法
-酸水解法
(1)化学方法
*主要是通过一些酶的作用,使抗原决定簇暴露。
常用的酶有:
胰蛋白酶、胃蛋白酶等。
-胰蛋白酶:
一般使用浓度为0.05%~0.1%,消化时间为37℃,10~40min,主要用于细胞内抗原的显示;
-胃蛋白酶:
一般使用浓度为0.1%~0.4%,消化时间为37℃、30~180min,主要用于细胞间质抗原的显示。
*例如:
Laminin、CollagenIV
(2)水浴加热法
*将玻片放入装有抗原修复液的容器中,加热至沸腾,持续10~15分钟。
-优点:
操作简单、经济,适用于所有的实验室,
-缺点:
对封闭牢固的抗原决定簇暴露不理想。
(3)微波照射法
*将玻片放入装有抗原修复液的容器中,置微波炉加热至95℃以上,持续l0~15分钟,冷却后,按免疫组化染色步骤进行。
*此方法由于微波场内极性分子、离子高速运动,撞击交联的网链,使抗原异常的构想恢复正常,且因分子运动产热、效率高、时间短,对抗原再现效果好。
(4)高压加热法暴露抗原
*将玻片浸入抗原修复液内,置高压锅中高压2~3min,可取得极好的效果。
*由于高压下受热均匀,特别使用于大批量标本的染色。
(1)酸水解法
*酸水解可使交联断裂、暴露抗原。
*将玻片浸入1mol/LHCl溶液中,室温作用20min(温度升高,作用时间缩短)。
*此法能增强特异性染色,降低背景,但需注意水解过度将破坏抗原性及形态结构。
加热法的注意事项
*达到规定的温度(92~95℃以上);
*维持一定的时间;
*避免切片干涸(抗原可能完全丢失);
*加热后必须经过室温自然冷却20~30分钟,使未折叠的蛋白分子链恢复天然构型;
*修复液:
-最常用的是pH6.0的0.01mol/L的枸橼酸盐缓冲液;
-最新研究表明碱性修复液更有效,推荐使用1mM的EDTA缓冲液(pH8.0)。
4、载玻片的处理
*抗原修复过程中,由于高温、高压等诸多固素的影响,极易造成脱片。
为防止脱片,常用粘附剂处理载玻片。
-新载玻片上有油污,要用洗液浸泡12~24h,自来水冲洗后再用蒸馏水清洗;用绸布擦干或烤箱烤干。
清洁的载玻片再用粘附剂处理。
*常用的粘附剂有:
-APES(3-氨丙基三乙氧基硅烷)
-Polv-L-Lysine(多聚赖氨酸)
-铬明胶溶液
APES(3-aminopropyltriethoxysilane)
3-氨丙基三乙氧基硅烷
*现用现配。
用纯丙酮或甲醇配制2%APES(v/v);
*将洗净的玻片浸于此液中20~30秒钟;
*取出稍停片刻,再入纯丙酮酮溶液洗去未结合的APES,置通风橱中晾干或60℃烤箱烤干。
Polv-L-Lysine(多聚赖氨酸)
*将清洁玻片浸于100&61549;g/ml(10%w/v)的多聚赖氨酸溶液中(去离子水稀释),37℃放置30min,然后60℃烤箱烘烤1h或室温过夜干燥。
装盒备用。
铬明胶溶液
*试剂:
铬明矾(chromealum)0.25g
明胶(gelatine)2.5g
蒸馏水500ml
*先将铬明矾溶解于40℃少量蒸馏水中,再加入明胶及蒸馏水,可在70℃水浴中使明胶溶化,搅拌均匀后,即可使用。
如有残渣,可过滤后再用。
*用时稍加溶化,切片浸入2~3min,过夜晾干。
(二)冰冻切片
*冰冻切片是指将组织在冷冻状态下直接切片。
*在切片前组织不经过任何化学药品处理或加热过程。
-缩短了制片时间
-抗原性不受损失
*对稳定性差的抗原,如淋巴细胞表面抗原尤其适合。
*组织冻结过程中,细胞内、外的水分会形成冰晶,冻结的速度愈慢,冰晶颗粒愈大,可严重影响组织、细胞的形态结构。
因此制备冻块时要求低温、速冻。
1、冰冻组织块的常用方法
*液氮中冰冻:
组织投入液氮中(一196℃)中10~20sec;
*干冰中加入丙酮(或异戊烷),液体立即气化起泡,温度降至一70℃,将组织投入,若在干冰丙酮中置一盛有异戊烷的容器,组织投入该容器内结冻则更好;
-上述组织在速冻时应浸埋于OCT包埋剂或甲基纤维素糊状液内,以保护组织。
-制成冻块后若需保存,应以铝箔或塑料薄膜封包,贮存于-70℃冰箱。
2、切片
*供免疫组化用的冰冻切片同样要求附贴平整,并有连续性。
*载玻片也应清洁无油污,但一般无需涂抹粘附剂;
*切片时,使用恒温冷冻切片机,在箱内温度-25℃。
切片厚度一般为4~8um。
3、切片后处理
*切好的冰冻切片,室温下自然晾干1~2h后,入4&61616;C丙酮固定10min,待干燥后作免疫组化染色或封存于-20℃。
*冰冻切片由于切片技术要求较高,不易得到连续性很好的切片,其形态结构亦不如石蜡片,且冻块和切片不便于长期贮存,因此冰冻切片的应用受限。
(三)组织印片
*将洁净载玻片轻压于已暴露病灶的新鲜组织切面,细胞即粘附于玻片,晾干后浸入冷丙酮或醋酸-乙醇固定10min,自然干燥后染片或-20℃保存。
(四)细胞培养片(细胞爬片)
*贴壁细胞培养时,置盖片于培养瓶中,使细胞在盖片上生长,达适当密度后取出固定(丙酮-20℃固定10~20min),再进行免疫染色。
-盖片的处理方法同载玻片的处理,但泡酸时间2h即可。
-为了防止细胞脱片,可用多聚赖氨酸处理。
(五)细胞涂片
*大多数细胞涂片由细胞悬液制成,包括:
-血液、尿液、脑脊液;
-体腔积液;
-组织穿刺吸取,如骨髓、淋巴结或其他实质性组织
-悬浮培养的细胞或贴壁细胞经消化后形成的悬液。
(五)细胞涂片(续)
*细胞涂片的方法:
-手涂法
*将细胞浓度调节到106/ml左右,可直接涂于载玻片上,但要均匀、不重叠。
*图片范围应小于1cm直径,以节约试剂。
-涂片机涂片法
*将细胞样品制成2×105~6/ml细胞悬液,吸取50~100&61549;l(1~2×104~5cells)加入涂片机内,1000rpm离心2min后细胞就均匀分布于玻片上。
三、免疫组化常用的染色方法
*根据标记物的不同分为
-
(一)免疫荧光法
-
(二)免疫酶标法
-(三)亲和组织化学法
(一)免疫荧光法
【原理】
*用于免疫荧光的标记物是小分子的荧光素,可标记抗体或抗原;
*荧光素经某种特定波长的光照射激发后,能发射出一种比激发光波波长更长而且能量较低的荧光,籍此可作定位观察或示踪;
*借助于荧光显微镜进行观察。
1、常用的荧光素
*
(1)异硫氰酸荧光素(FluoresceinIsothiocyanate,FITC)
*
(2)四甲基异硫氰酸罗丹明(TetramethylRhodamineIsothiocyanate,TRITC)
*(3)四乙基罗丹明(RB200)
*(4)碘化丙啶(propidiumiodide,PI)
(1)异硫氰酸荧光素(FITC)
*易溶于水和乙醇。
*最大吸收光谱为490~495nm,最大发射光谱为520~530nm.呈翠绿色荧光,分子量389.4。
*在碱性条件下,FITC的异硫氰酸基在水溶液中与Ig的自由氨基形成共价键,成为标记的荧光抗体。
一个lgG分子上最多能标记15~20个FITC分子。
(2)四甲基异硫氰酸罗丹明(TRITC)
*最大吸收光谱550nm,最大发射光谱620nm,呈红色荧光,分子量为444。
*与蛋白质结合的方式同FITC。
(3)四乙基罗丹明(RB200)
*不溶于水,易溶于乙醇和丙酮。
*最大吸收光谱为570nm,最大发射光谱为595~600nm,呈橙红色荧光,分子量为580。
*RB200在五氯化磷(PCl5)作用下转变成磺酰氯(SO2Cl),在碱性条件下,易与蛋白质的赖氨酸&61541;-氨基反应而标记在蛋白分子上。
(4)碘化丙啶(PI)
*是常用的DNA荧光标记探针,可作为FITC的胞核对比染色。
*PI可嵌入到双链DNA和RNA碱基对中并与之结合,但对碱基无特异性选择。
*最大吸收光谱是493nm,最大发射光谱是630nm,呈红色荧光。
2、荧光抗体的保存
*一要防止抗体失活,二要保持荧光素不脱落和不受激发猝灭。
-一般认为0~4℃可保存1~2年,-20℃可保存3~4年。
-要小量分装,防止反复冻融。
-保存前需加防腐剂(浓度为1:
5000~10000的硫柳汞或1:
1000~5000叠氮化钠)。
3、免疫荧光的染色方法
*免疫荧光染色法常用的
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