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基础生物化学实验

生物化学实验

实验基本原理

1有效数字计算（结合电子天平的应用等）

加减法：

进行数字加减时，最后结果所保留的小数点后的位数应与参与运算的各数中小数点后位数最少者相同，其尾数“四舍五入”。

如：

++=，应取。

乘除法：

进行数字乘除时，最后结果的有效数字应与参与运算的各数中有效数字位数最少者为准，而与小数点的位数无关，其尾数“四舍五入”。

如：

×=,应取。

2误差分析

误差为实验分析的测定值与真实值之间的差值。

误差越小，测定值越准确，即准确度越高。

误差可用绝对误差和相对误差表示。

绝对误差=测定值-真实值

相对误差=绝对误差÷真实值×100%

一般用相对误差表示结果的准确度，但因真实值是并不知道的，因此实际工作中无法求出分析的准确度，只得用精确度来评价分析的结果。

3偏差分析（结合“可溶性蛋白或赖氨酸实验”要求掌握）

精确度表示在相同条件下，进行多次实验的测定值相近的程度。

一般用偏差来衡量分析结果的精确度。

偏差也有绝对偏差和相对偏差两种表示方法。

绝对偏差=单次测定值-算术平均值（不计正负号）

相对偏差=绝对偏差÷算术平均值×100%

例如：

分析某一材料糖含量，共重复测定5次，其结果分别为：

%，%，%，%，%，用来表示精确度的偏差可计算如下：

分析结果算术平均值个别测定的绝对偏差（不计正负）

%%

%%

%%%

%%

%%

平均绝对偏差=（%+%+%+%+%）÷5=%

平均相对偏差=÷×100%=%

在实验中，有时只做两次平行测定，这时就应用下式表达结果的精确度：

两次分析结果的差值÷平均值×100%

4实验结果的表述：

实验结果可用列表法（“影响酶作用的因素”常用）和作图法（综合实验用）表示。

第1章分光光度技术

分光光度技术是光学（光谱）分析技术的一种，它是利用物质的特征吸收光谱来对不同物质进行定性和定量分析的一项技术。

我们将重点介绍紫外光-可见光分光光度法。

一、紫外光-可见光分光光度法的基本原理

1、讨论的波长范围：

200～400nm的紫外光区和400～760nm的可见光区。

人肉眼可见的光线称可见光，波长范围在400～760nm；

200～400m为紫外光区，760～400000nm为红外光区。

2、发射光谱与吸收光谱：

发射光谱：

不同光源发射光谱不同。

对电灯来说，钨灯发射可见光源，氢灯发射紫外光源。

吸收光谱：

被溶液吸收后的光谱。

（在分光镜上呈现暗带的光谱）。

当一束单色光通过溶液时，一部分被溶液吸收，一部分光可反射、折射、吸收、透过，溶液的厚度愈大，光过越少。

3、吸收光谱中的透光度（T）与吸光度（A）：

吸收光谱类仪器的检测读数盘上都有两种数字，T或A（或E消光度）

（1）透光度（T）：

表示透过的光占入射光的比例（%表示）

当一束光通过一杯样品溶液时，射光=反射光+折射光+吸收光+透过光

当用空白（组成该样品溶液的溶剂）校正后，入射光=吸收光+透过光

透光度（T）=样品透过光强度/空白透过光强度

此时空白透过光强度是样品真正入射光强度。

（2）吸光度（A）：

是物质所吸收的光的一种度量，数值上等于透光度的倒数的对数（透光度的负对数），即A=-lgT

（3）朗伯-比尔定律：

A=KCL，吸光度与溶液浓度（C）和液层厚度（L）成正比。

（K为常数，同种物质K相同，不同物质K不同）

如固定L（比色皿厚度），A只与C成正比。

朗伯-比尔定律使用条件：

待测液是均匀稳定的稀溶液；入射光是严格的单色光。

4、分光光度法（比色法，P23）：

（1）定义：

利用分光光度计产生的单色光照射待测溶液，通过检测吸光度，对溶液中存在的具有光吸收能力的物质进行定性或定量分析的方法。

（2）测定方式：

用已知标准浓度和未知浓度的待测液进行比色分析，根据两者间的吸光度做比较求得待测液的浓度。

还需设置“空白”，以消除光的反射和折射。

（3）光源：

通过钨灯或氢灯产生可见光或紫外光。

二、分光光度法的测量方法

1、标准曲线法：

配制一系列不同浓度（C）的标准溶液，以纯溶剂为空白，测定标准溶液的A值，以A值为纵坐标，C为横坐标绘制标准曲线。

2、回归方程法：

得到的标准曲线数据可通过一元线性回归求出标准曲线方程。

（见P27附。

具体应用，先确定x和y，再按公式计算）。

3、仪器直读浓度法：

7200等分光光度计可直接读出浓度。

只需配出一个C标，校正仪器至已知浓度，将待测液推入光路，旋钮拨至C档，即可直接读出浓度。

4、列解联立方程法:

对于多组分和二组分混合液可选择多个或两个波长（一般为各组分的最大吸收波长）分别测出吸光度（A），再按方程组计算。

（P124，实验29属于此类）

三、分光光度法的应用（见P26）参考原则：

•有紫外吸收的可选用紫外分光光度计测定，如蛋白质、核酸、生物碱、硝酸盐等

•无色的物质可通过显色用可见分光光度计测定，如蛋白质、氨基酸、核酸、酶、糖类等

•有色的物质可直接用可见分光光度计测定，如色素。

四、紫外-可见分光光度法测定物质浓度的一般操作（P27）

1、配制标准溶液，制标准曲线

2、样品准备和提取：

称样→浸提（加热或研磨）→稀释至一定浓度→显色（紫外不必）

3、测定：

选择适当波长→选择适当比色皿→倒入待测液→调节仪器→读数→记录

4、计算：

根据公式，带入各数据计算结果。

思考题

（1）分光光度法的基本原理如何应用在哪些方面

（2）结合实验，总结分光光度法测定物质含量的一般操作过程和注意事项。

（3）简述分光光度计的组成及使用方法。

（4）名词：

透光率，吸光度，吸收光谱，标准曲线

第2章离心技术

1、概念：

1）离心：

是利用离心机产生离心力来分离具有不同沉降系数的物质的方法。

2）离心技术（centrifugalmethod）是利用离心机旋转运动产生的离心力，将悬浮液中的悬浮微粒快速沉降，而达到分离、浓缩或提纯等目的的一门技术。

应用：

在生物科学，尤其是在生物化学和分子生物学方面的应用已经十分广泛。

2、基本原理：

物质颗粒在离心过程中受到的作用力主要有离心力、介质阻力和介质浮力等。

1）离心力（F）：

定义：

物质颗粒在离心场中受到一个远离旋转轴的力即为离心力。

表示：

常用地球引力的倍数表示，“数字×g”（g为重力常数）。

例如25000×g，则表示相当于地球引力的25000倍（高速离心）。

实际应用中，特别是低速离心，常用每分钟转数v表示（r·min-1或rpm）。

2）浮力密度：

物质的质量减去在一定介质中所受的浮力即为浮力密度。

只有物体的密度大于介质密度的情况下，该物体才会发生沉降。

3）沉降阻力：

物体在介质中沉降时，所受到的介质阻力。

沉降阻力取决于介质的粘度。

4）沉降速度：

即单位时间内物质颗粒移动的距离。

它与物体的密度成正比，与介质的摩擦系数（粘度）成反比。

3、离心机的分类（P10）

可从转速、用途、离心形式、转子形式、使用温度等方面对离心机进行分类。

根据离心机转速不同，可分为三类：

低速（普通）、高速和超速离心机。

（1）普通离心机：

转速在8000rpm或6000×g以下，一般性制备用（一般实验中用）。

（2）高速离心机：

转速可达25000rpm或89000×g，需要带有冷却离心腔的制冷设备，以控制转子高速旋转产生的磨擦热。

（3）超速离心机：

转速在30000rpm以上，可产生高达500,000×g的离心力；可使亚细胞器、病毒分级分离，也可用于测定蛋白质、核酸的相对分子量等。

由于转速极高，因此它除带有制冷设备外，还具备真空系统。

4、常用离心技术

1）差速离心法：

基于待测物质颗粒的大小、密度不相同，其沉降速度不一样而得到分离。

2）速率区带离心（沉降速度超速离心）：

样品中粒子（大分子）因大小和沉降速度不同，在梯度介质中呈分离的区带状沉降，（管中形成区带）。

同样的粒子处于同一区带（图1-1-4）

首先在离心管中灌装好预制的一种密度梯度介质液，在其上面小心铺上一层样品溶液（图1-1-4），离心期间，样品中各组分会按照各自的沉降速率沉降，被分离成一系列的样品组分区带，故称率区带离心。

3）等密度梯度离心（沉降平衡超速离心）：

样品中粒子（大分子）因浮力密度不同，粒子移至它本身相同密度的地方形成区带（管中形成区带）（图1-1-5）。

如果离心管中介质中的密度范围包括待分离样品中所有组分的密度，离心过程中，各组分将逐渐移至与它本身密度相同的地方形成区带。

速率区带法和等密度梯度法的区别：

开始介质有无梯度（前者有，后者无但在离心中自动生成）；

介质不同（前者可用蔗糖、甘油等，后者常用碱金属的盐溶液）。

5、离心技术的应用

1）物质的分离：

将固体与液体分离，或将互不相溶的液体分开。

2）测定沉降系数和分子量：

超速离心

6、离心操作的一般过程

1）仪器选择：

根据需要选择

2）离心准备：

样品装入离心管，做好标记并进行平衡。

再按对称方向放到离心机中。

3）离心：

关闭离心腔盖，调整旋钮或按钮至设定时间及转速（低速离心机逐渐增速）开始离心。

4）检测、分离已离心样品：

取出离心管，用长吸管、移液器、注射针头等工具吸取所需的液体分离层，或直接倾去液体层，留下所需的固体层。

思考题

（1）何为离心技术它有什么用处

（2）简述离心机的分类。

（3）结合实验，说明普通离心操作应注意哪些问题。

（4）名词：

离心力，沉降系数，沉降速度，差速离心，等密度梯度离心

第3章层析技术

定义：

层析技术（层析法）是根据物质的理化性质而建立的分离、分析物质的方法。

（P15）

发现历史：

层析法也称色谱法，是1906年俄国植物学家将植物叶片提取的色素通过装填有CaCO3的柱子，各种色素以不同速率流动后形成不同的色带而被分开，由此得名为“色谱法”。

层析法不断发展，相继出现气相层析、高压液相层析、薄层层析、亲和层析、凝胶层析等。

层析法是生物化学中常用的分离分析技术之一。

一、层析法的基本原理

层析法是利用混合物中各组分物理、化学性质的差异（如吸附力、分子形状及大小、分子亲和力、分配系数等），使各组分在两相（固定相和流动相）中发生相互作用（吸附、溶解、结合等）使各组分以不同速度移动而达到分离的目的。

1、分配系数（K）：

通常被用来描述一种化合物在互不相溶的两个相中的分配状况。

2、分离原理（P15）（见图1-2-1）

3、层析法分类

1）按层析过程的机理（依据的理化性质）分类

2）按两相的物态（固、液、气）分类

3）按操作形式（支持物、装置等）分类（见P17,表1-2-1层析法分类表）

4、几种层析方法简介

1）分配层析

（1）原理：

利用混合物在两种不相混溶的液相（固定相和流动相）中的分配系数不同，分配系数小的溶质在流动相中的分配的数量多，移动快；分配系数大的溶质在固定相分配的数量多，移动慢。

（2）应用：

纸层析，以滤纸上吸附的水为固定相，以有机溶剂为流动相，常用于分离鉴定氨基酸、核苷酸、色素等小分子有机物。

物质在纸上的移动速率可以用Rf值表示：

在相同条件下，Rf值是固定的，可用于鉴定被分离的物质。

2）吸附层析

（1）原理：

利用固定相的固体吸附剂表面对不同组分吸附力的大小及流动相对它的溶解作用（解吸作用）的差异进行分离。

（2）应用：

薄板层析是常用的吸附层析方法之一。

它用水作粘合剂将硅胶G均匀铺在玻璃板上形成一薄层作为固定相，由展开剂作为流动相，可用于分离氨基酸、单糖、寡糖、脂类等。

3）离子交换层析

（1）原理：

固定相的离子交换剂对各种离子有不同的亲和力，它们结合的牢固程度不同，选用不同pH的洗脱液做流动相便可将混合物中的各种离子逐个洗脱下来。

（2）应用：

离子交换柱层析常填充不溶性高分子化合物（树脂，纤维素等），以分离各种可解离的物质，如蛋白质、氨基酸、核酸、生物碱等。

4）凝胶层析（分子筛层析或分子排阻层析）

（1）原理：

根据混合物中各分子的大小和形状不同而进行分离。

固定相为多孔网络结构的凝胶颗粒。

当各种分子流过层析柱时，比凝胶孔径大的分子不能进入胶孔，在凝胶颗粒间的空隙向下移动，最先被洗脱出来；比网孔小的分子能自由出入胶孔内外，在柱内经过的路程较长，移动慢，最后被洗脱出来。

（2）应用：

大分子分离提纯，测蛋白质分子量。

5、层析技术的一般操作过程：

以柱层析薄层层析为例，对层析的操作过程简介如下：

1）层析柱（板）的制作：

装柱：

将层析介质（如树脂、葡聚糖颗粒等）均匀、致密地填充于层析柱中，并用洗脱液或样品缓冲液平衡一定时间（见下图）

制板：

层析介质（如硅胶G）用溶剂调匀后平铺于玻板上，待晾干后进行活化。

2）加样或点样：

加样：

用于柱层析，待分离样品溶解后加于层析柱顶上；点样：

用于薄层层析或纸层析，用毛细管等细小管状物将待分离样品点于薄层的一端。

3）洗脱或展层：

用流动相流过固定相的过程在柱层析中称为洗脱，在薄层层析中称为展层

4）检测与鉴定：

根据样品性质特征用不同方法

思考题

（1）简述层析法的基本原理及分类

（2）凝胶层析的原理如何

（3）简述层析技术的一般操作过程，层析技术可应用在哪些方面

（4）名词：

展层，洗脱，制板，分配系数

第4章电泳技术

定义：

电泳技术是根据带电颗粒在电场中向着与其所带电荷相反电极移动的原理建立的分离分析物质的方法。

（P30）

历史：

1808年就发现电泳现象，但作为一种生物化学研究方法，在1937年后才得到了较大发展。

目前，电泳技术已成为生物化学、免疫学、分子生物学以及与其密切相关的医学、农、林、牧、渔、制药分析中必不可少的手段。

一、电泳的基本原理

1、带电质点：

不同物质由于本身解离或其表面吸附有其它带电质点，在电场中便会向一定电极移动。

aa、Pr和核酸都可两性解离，带有电荷。

2、迁移率（m）：

表示不同带电颗粒在电场中的泳动速度，其单位为cm2·V-1·s-1：

m=颗粒泳动速度（cm·s-1）/电场强度（cm·V-1）

3、影响迁移率的主要因素:

（1）内因：

带电颗粒的性质和颗粒的大小、形状。

一般说颗粒带净电荷越多，直径越小，越接近球形，在电场中迁移率越快，反之越慢。

（2）外因：

电场强度、溶液pH值、溶液的离子强度、电渗现象、温度的影响。

二、电泳的分类

1、按分离原理分类：

（P32）

分为区带电泳、移界电泳、等速电泳和聚焦电泳等4种。

区带电泳最常用，电泳过程中，不同的离子成分在均一的缓冲液体系中分离成独立的区带。

2、按有无固体支持物分类：

分为自由电泳和支持物电泳两大类。

支持物电泳的支持物有多种，应用最多。

根据支持物的特点又可分为：

（1）无阻滞支持物，如滤纸、醋酸纤维膜、纤维素粉、淀粉、聚酰胺粉末，凝胶颗粒等。

（2）有阻滞支持物，通常为高密度的凝胶，如淀粉凝胶、聚丙烯酰胺凝胶、琼脂糖凝胶等。

用于放置支持物的电泳槽的形式也是多种多样的，有垂直的、水平的、柱状的（花篮式）、毛细管的、湿小室及幕状的等。

聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）是以聚丙烯酰胺凝胶作支持物的区带电泳。

PAGE分离物质的三种效应：

（1）电荷效应：

按所带电荷分离物质。

（2）分子筛效应：

凝胶聚合成三维网状结构，通过控制网孔大小分离不同大小的分子。

（3）浓缩效应：

当使用不连续凝胶系统时，分离物质快速通过浓缩胶（大网孔）、而聚集于分离胶（小网孔）上呈一薄层，使分离物质处于同一起跑线。

因为以上三种效应，使分离物质的分辨率提高。

2、聚丙烯酰胺凝胶的聚合：

聚丙烯酸胺凝胶是由单体、丙烯酰胺（简称Acr）和交联剂、双体的N,N-甲叉双丙烯酰胺（简称Bis）在加速剂（四甲基乙二胺）和催化剂（过硫酸铵）的作用下聚合交联成三维网状结构的凝胶。

（见图l-4-2）

三、聚丙烯酰胺凝胶电泳

•凝胶孔径大小，主要受凝胶浓度的影响。

凝胶浓度越大，孔径越小。

凝胶浓度过大，胶硬而脆，易折断。

3、PAGE的应用

（1）分离蛋白质和同工酶：

（P38）

形成不同的蛋白带和酶带（参见实验10及下图）

（2）测定蛋白质分子量：

采用SDS-PAGE。

在样品中加十二烷基硫酸钠（SDS）降低天然蛋白质分子间的电荷差别，蛋白质结构变得松散，形状趋于一致，使各种SDS-蛋白复合物在电泳时产生迁移率差异只与分子量有关。

（3）测蛋白质等电点：

采用等电聚焦电泳法（IEF-PAGE）。

在凝胶柱中加入两性电解质载体，造成一定的pH梯度，使具有不同pI值的蛋白质聚焦在相应的pH中，这时所带净电荷为零，不再泳动，而浓缩成狭窄的区带（参见P36及P55）。

4、凝胶电泳的一般操作方法：

（1）根据所分离物质的特性及要求选择相应的凝胶、电泳仪及电泳槽（园盘、垂直板、多用途）

（2）配制相应凝胶溶液（烧杯中，参见P65）

（3）灌胶：

花篮式电泳装置，在玻管中倒入凝胶溶液，直接加水覆盖胶液

（4）胶凝固后倾出水，将玻管固定于电泳槽，倒入电极缓冲液并检查是否漏液

（5）点样：

将样品加至凝胶上的上样孔中

（6）电泳：

接上电泳仪开始电泳

（7）剥胶、显色

（8）分析：

条带比较或照相或光密度扫描

思考题

什么叫电泳简述电泳的基本原理。

什么叫迁移率电场强度、pH、温度对迁移率有何影响

凝胶电泳技术可应用在哪些方面

名词：

等电聚焦，区带电泳，分子筛效应，浓缩效应。

实验1影响酶作用的因素

1、酶具有什么特性

（1）高效性：

酶的催化效率一般比无机催化剂高1000万至10万亿倍，因此在生物体内的各种酶只需要极少的量就能催化大量底物发生反应。

（2）专一性：

指酶对催化的底物及反应类型具有选择性，所以酶的种类很多。

（3）易变性：

酶是蛋白质，要求温和的反应条件；在一定范围内，温度、PH值等变化都会使酶的催化能力发生变化。

（4）可调性：

植物通过调节酶的活性进行不同的反应和适应不同的环境。

2、什么是酶的活性酶催化效率的高低。

3、酶的活性需要什么条件需要适应环境的条件——其中适宜的温度和PH值就是其中之一。

根据酶的特性及需要的条件，下面分别给出不同的温度环境、不同的PH环境和催化底物，来探讨酶的活性需要的条件。

原理：

淀粉酶活性高低不同，淀粉水解的程度就不同，生成的产物也不同；其水解产物遇碘也会呈现不同的颜色。

故可根据加碘呈现的不同颜色来判断淀粉的水解程度，从而了解温度、pH对酶促反应速度的影响。

淀粉在酶的作用下，逐步降解成的分子量大小不一的中间产物糊精，最后再水解成葡萄糖和麦芽糖；不同的糊精遇碘显不同的颜色。

淀粉+淀粉酶水解淀粉糊精水解紫糊精水解红糊精水解消色糊精水解葡萄糖+麦芽糖

遇I2遇I2遇I2遇I2遇I2遇I2

蓝色蓝紫色紫色红褐色无色无色

（1）温度对酶活性的影响：

由于酶是蛋白质，所以受温度影响，在高温下，酶变性而失去活性；低温下，酶的活性被抑制；适宜温度，酶的活性最强。

（这种变性用什么来验证呢用不同温度（冰水、40℃水浴和沸水浴）作用淀粉酶，使淀粉部分、完全和不分解后与碘（I2）出现的不同颜色来观察。

其中，冰水属低温，酶的活性被抑制，淀粉只能少部分分解，所以遇I2变为紫红色；40℃水浴，酶的活性最强，淀粉完全分解，遇I2变为无色或碘色；沸水浴，酶变性而失去活性，遇I2变为兰色）

（2）pH对酶活性的影响：

酶的活性受环境pH的影响极为显着，通常只在一定的pH范围内，酶才表现出活性。

植物酶的最适pH在之间，而对今天萌发的小麦种子来说，主要起催化作用的酶为淀粉酶，最适pH是5。

[今天淀粉酶在不同PH（3、5、7）下，使淀粉部分和完全分解后与碘（I2）出现的不同颜色来观察。

其中，PH为3属强酸性环境，大部分酶已变性失活，淀粉只有一小部分水解，遇I2变为蓝紫色；PH为5属酶的最适PH，酶的活性最强，淀粉完全分解，遇I2变为无色或碘色；PH为7属中性环境，酶的活性被部分抑制，淀粉只有少部分不分解，遇I2变为红紫色色]

（3）酶的催化特异性（专一性）：

酶对作用的基质具有严格的选择性，即酶具有专一性。

[如淀粉酶只能催化淀粉水解，而不能催化蔗糖水解，所以今天我们用淀粉和蔗糖做底物来验证。

即：

淀粉+淀粉酶完全水解葡萄糖+麦芽糖Cu2+生成Cu2O砖红色沉淀；

蔗糖+淀粉酶不水解没有Cu2O砖红色沉淀生成]

Ⅰ温度对酶活性的影响

甲组：

颜色变化为：

紫红色、无色或碘色、蓝色

乙组：

颜色变化为：

无色或碘色、无色或碘色、蓝色

ⅡpH对酶活性的影响

颜色变化为：

紫红色、无色或碘色、蓝紫色

Ⅲ酶的催化特异性

鉴定：

颜色变化：

蓝色、蓝色、蓝绿色，说明淀粉酶液中含有还原性杂质

测定：

淀粉+淀粉酶完全水解葡萄糖+麦芽糖Cu2+生成Cu2O砖红色沉淀；

蔗糖+淀粉酶不水解没有Cu2O砖红色沉淀生成）

思考题

（1）实验中为什么要检验淀粉酶溶液，淀粉溶液或糖溶液

（2）温度对酶活性有影响，说明酶具有什么性质实验中如何观察

为说明酶具有易变性。

由于酶是蛋白质，所以易受温度影响，在高温下，酶变性而失去活性；低温下，酶的活性被抑制；适宜温度，酶的活性最强。

实验中通过在冰水、40℃水浴和沸水浴中淀粉底物的消失情况进行观察，即冰水中，酶的活性被抑制，淀粉部分分解，遇碘（I2）显紫红色；沸水浴中，酶变性而失活，淀粉不分解，遇I2变兰色；40℃水浴，酶的活性最大，淀粉完全分解，遇碘不显色。

（3）PH对淀粉酶活性有影响，其最适PH是多少实验中如何判断

淀粉酶的最适PH值是5。

实验中通过PH为3、5、7检验淀粉酶的最适pH为5，即pH值为3时，酶的活性丧失，淀粉不分解，遇碘（I2）显蓝色；pH值为5时，酶的活性最大，淀粉完全分解，遇碘不显色；PH值为7时，酶的活性被部分抑制，部分淀粉已分解，遇碘显紫红色。

实验2谷物蛋白含量的快速测定——双缩脲法（P46）

在研究植物营养、代谢作用及生长发育等生命活动中，往往需要测定样品中蛋白质的含量。

那么怎样测定呢用碱性铜溶液。

因为肽键在这种溶液中会产生紫色化合物，其颜色的深浅与肽键的数量成正比，也就是跟蛋白质含量成正比。

颜色的深浅我们用一种仪器来测定，即用分光光度法测定，以此得出蛋白质的含量。

碱性铜溶液又称为双缩脲试剂、肽键试剂，所以我们的实验方法就叫双缩脲法。

原理：

在浓碱液中，蛋白质中的肽键（与双缩脲相似的肽键），能与Cu2+结合，生成紫色和紫红色化合物，颜色的深浅与蛋白质含量成正比，故可用分光光度法测定其含量。

思考题

（1）试验为什么要加无水乙醇（从蛋白质的结构上考虑）、KOH及碳酸铜

答：

加无水乙醇的原因:

一是做溶剂，使蛋白质溶解出来；二是破坏蛋白质的空间结构使其次级键断裂，让肽键暴露出来，利于反应进行。

加KOH的原因：

提供强碱条件。

加碳酸铜的原因：

提供反应所需的Cu2+。

{注意在实验中：

加入碳酸铜、无水乙醇10ml、10%氢氧化钾10ml的顺序不能颠倒。

如果先加KOH，再加碳酸铜及无水乙醇、测定的蛋白质含量会降低，这是为什么（从蛋白质的性质上考虑）——因为没有无水乙醇的作用，既不能使蛋白质溶解在其中，也没有破坏蛋白质的空间结构，没有使肽键暴露出来，不利于反应进行，所以测定的蛋白质含量会降低。

}

（2）用本组的实验数据计算绝对偏差和相对偏差。

（见教材P3的第3点，实验数据用4个人的，要求写在实验报告上）

（3）进行有效数字的计算。

（见教材P3的第1点）

实验3谷