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结核杆菌培养基的种类及应用
结核杆菌培养基的品种及利用之杨若古兰创作
自从1882年Koch发现结核杆菌以来,为促进结核杆菌生长,缩短培养时间,达到提前分离、鉴定的目的,人们对结核杆菌的养分、生理代谢及人工培养进行了一系列的研讨,经过一个多世纪的不懈努力,曾经对结核杆菌的生长规律有了比较深入地了解,而且构成了很多成熟的培养方法.尽管古代分子生物学技术在结核病研讨中发挥着愈来愈次要的感化,但是结核杆菌的培养在结核病的诊断、流行病学目标、结核菌的分型鉴定、药敏试验、结核病药物的研讨等方面仍然有着不成替代的感化.为了能够较零碎地了解、有针对性地选择合适、恰当的培养基,本文就国内外较为成熟的培养基品种及利用进行如下综述.
1 按培养基的性状分类
培养结核杆菌的培养基,从性状上分次要有固体培养基、液体培养基、半流体培养基、固液双相培养基等类型,这些培养基各有特点.
1.1 固体培养基 最经常使用的是罗氏培养基,也是最具代表性的一种,其他的还有小川辰次(Tatsujiogawa)鸡蛋培养基和Middlebrook7H10、7H11等琼脂培养基等.在固体培养基中,因为可以直接观察菌落的形状并可做鉴别用,是以经常使用于临床标本的分离培养、鉴别、保管菌种及对抗结核药物的敏感性测定等方面,缺点是结核菌生长缓慢.
1.2 液体培养基 经常使用的有苏通(Sauton)培养基、Middlebrook7H9等液体培养基.结核杆菌在液体培养基中能够更广泛的接触养分成分,是以在液体中生长绝对较快,次要在液体概况生长,搅动时下沉至管底,可获得大量的结核杆菌.次要缺点是:
在对临床标本的收集、采样、运输方面有晦气的一面;不克不及根据肉眼观察菌落形状;培养基净化机会多,影响结核杆菌的生长,净化时不容易与结核杆菌鉴别,需涂片染色镜检判断结核杆菌是否生长.
1.3 半流体培养基 改良苏通半流体琼脂培养基是一种人工综合培养基,基质透明,呈半流体形态,生长的结核杆菌构成白色颗粒状菌落悬浮于培养基中段,便于观察.
1.4 固液双向培养基 Septi-CheckAFB双相培养基是国外利用较早的一种培养基[1],采取BD专利式封闭式固液双相一体化培养基设计.液相为Middlebrook7H9分枝杆菌公用增菌培养基,可敏捷繁殖分枝杆菌,固相为3种固体培养基平面:
Middlebrook7H11和改良的L-J培养基用于及时将增菌肉汤内分枝杆菌进行分离纯化以获得单个菌落,巧克力琼脂用于初期发现净化菌,防止时间浪费.因为有液相作为基础,是以结核杆菌生长较快,也是一种非常无效的培养基.国内有效平菇制备的平菇双相培养基[2]是利用平菇浸出液为基础,加小牛血清、琼脂等成分而配制的一种培养基,根据琼脂的量分歧制成液相、固相培养基.在国内利用较少,次要特点是成本低,制备简单,适合于基层使用,有必定的研讨价值.
2 按成分分类
次要分为以鸡卵和琼脂为基础的两种培养基[3].为了使结核杆菌达到快速生长的目的,可加上血液、椰汁、平菇液等分歧养分成分,从而配制出各种分歧的培养基.
2.1 以鸡卵为基础的培养基 有L-J培养基、Ogawa培养基、丙酮酸钠培养基和丙酮酸钠细胞色素C培养基等.在鸡卵为主的培养基中,鸡卵液是关键成分,在制备培养基时,要充分考虑鸡卵液的新颖程度和养分成分是否受到破坏.
L-J培养基 是一种经典的培养基[4],次要成分有天门冬素、KH2PO4、MgSO4・7H2O、枸橼酸镁、甘油、鸡卵液等,须要血清凝固器对培养基进行凝固,以包管培养基中有必定的凝固水,以满足长时间培养的须要.根据成分品种及剂量的分歧,又可分为酸性L-J培养基和碱性L-J培养基.将L-J培养基中KH2PO4的量由添加为14g,就是酸性L-J培养基,而将KH2PO改为K2HPO,就是碱性L-J培养基.L-J培养基制备简单,次要用于分枝杆菌初次分离培养、传代培养、菌落观察、保管菌种、药物敏感性测定及菌种鉴定等,而酸性L-J培养基和碱性L-J培养基用于分枝杆菌分离培养时,标天职别用碱和酸处理.结核杆菌在L-J培养基上生长时,培养时间较长,大约在4~8周,是以晦气于临床快速检测的需求,但作为其他快速诊断的参照,和作为结核杆菌诊断的尺度有非常次要的意义.
Ogawa培养基 成分较少,又少了天门冬素,是以是一种比L-J培养基更为经济的培养基,次要成分有谷氨酸钠、KH2PO4、甘油、鸡卵液等,还可以通过调整KH2PO4的量及谷氨酸钠的量制备成改良培养基(ModifiedOgawa),此培养基的用处与L-J培养基不异,因为价廉,特别适合于发展中国家[5].
丙酮酸钠培养基 是在L-J培养基的基础上加入丙酮酸钠,除去甘油制备而成,次要用于从标本平分离牛型分枝杆菌或作为本菌的传种及保管.而丙酮酸钠细胞色素C培养基是在Ogawa培养基基础上,杨乐荫等用0.1%丙酮酸钠代替甘油,并加入2.5%葡萄糖液及细胞色素C制成丙酮酸钠细胞色素C培养基,与丙酮酸钠培养基、Ogawa培养基对临床标本比较,其培养的培养阳性率最高,显示了丙酮酸钠细胞色素C培养基的优胜性.
2.2 以琼脂为基础培养基 包含苏通(Sauton)培养基Middlebrook7H9、7H10、7H11、7H12,匡氏培养基Proskauer培养基和Beck琼脂培养基等.这些培养基主如果由无机盐类及一系列的无机化合物等成分构成.琼脂的感化主如果赋形剂,通过调整琼脂的量,一方面可以制备成分歧性状的培养基;另一方面,在液体培养基中的少量琼脂有益于结核杆菌在中段构成菌落,从而便于观察.
Sauton培养基[6] 次要成分有天门冬素、K2HPO4、MgSO4・7H2O、柠檬酸、枸橼酸铁铵、甘油等,根据是否加入琼脂及琼脂的量,又构成了液体培养基及半固体培养基(也称改良苏通半流体培养基)等.在培养基的制备上,也不须要特殊的设备,通过高压灭菌法既可处理培养基,是以操纵简单,次要用于牛型分枝杆菌的培养,卡介苗的生产及中草药对结核杆菌的感化的研讨中.
Middlebrook系列培养基 是国外最经常使用于结核杆菌研讨和诊断目的的培养基之一,从成分上看,最大的特点是成分多、配制复杂[6],但是培养时间短,是以愈来愈受到国内外学者的关注,其中7H9、7H12为液体培养基,7H10、7H11为固体培养基.通过在培养基中加入标识表记标帜14C的棕榈酸,当有分枝杆菌生长时,就可利用培养基中的标识表记标帜物而发生有放射性14CO2,然后由BACTETB460监测零碎检测其含量,是以非常敏感.Middlebrook系列培养基次要用于分枝杆菌培养及药物敏感性的测定.
Proskauer培养基和Beck琼脂培养基 使用简便,但是菌落不典型,呈扁平状、露滴状,多为光滑型[7].
3 按目的分类
在前述的培养基基础上,根据研讨目的分歧,加入特定物资后,可以制备成用于快速培养、鉴别、药敏等分歧用处的培养基,次要为了满足临床的须要.
3.1 用于快速培养 次要有BectonDiskinson(BD)公司研制的系列全主动培养零碎和OrganonTeknika公司研制开发的培养零碎.其的还有Difco公司ESP零碎、生物梅里埃公司的VITAL零碎等.因为与古代进步前辈的仪器设备、技术结合,检测灵敏度高,时间短,但通常价位较高.
20世纪70年代末,BD公司研制的培养零碎次要有初期的BACTEC460TMTB,成为全球第一台专业的全主动分枝杆菌培养鉴定仪,该零碎培养基以Middlebrook7H12为基础,在培养基中加入标识表记标帜14C的棕榈酸,因故也称为放射同位素液体培养法,因为存在废弃物放射性环境净化和探针空刺开放性检测技术缺陷,公司又推出无放射性净化的BACTEC9000MB及BACTECMGIT960全主动快速分枝杆菌培养鉴定药敏零碎,真正实现了分枝杆菌快速、平安、无放射性检测.BACTECMGIT960培养基以Middlebrook7H9为基础,配方良好的BBLPANTATM抗菌剂和OADC养分剂.采取一种荧光物资作为分枝杆菌生长唆使剂,是以也称为分枝杆菌生长唆使管法(mycobacteriagrowthindicatortube,MGIT),是目前全球最快的分枝杆菌培养、鉴定、药敏零碎.很多学者[8~10]利用发现,结核分枝杆菌平均检出时间为14.4天,最快10天.适用于多种标原根源,对各种分枝杆菌检测都适用.
MB/BacT分枝杆菌培养零碎是由OrganonTeknika公司开发的,将血液培养中判断细菌生长的pH唆使剂用于结核杆菌的培养.结核杆菌代谢中发生的CO2变更通过化学感受器监测,利用酸碱度的变更使pH唆使剂色彩改变,最初通过发射光度计检测色彩变更.其平均检测时间比LJ早2周.该零碎仍然采取Middlebrook7H9液体培养基,当有阳性旌旗灯号时,需取培养液进行涂片及鉴定确认.
Difco公司ESP零碎,是一种全主动的血培养零碎,可以连续监测细菌的生长.具有没有放射性的特点,与BACTECTB460比较[11,12],在检测时间上差别无明显性,可以替代使用,Williams-BouyerN等将ESP与BACTECMGIT960进行了具体比较[13],在全体检测时间上稍长些,对戈登分枝杆菌监测率高.作为一种液体培养基,须要与固体培养基结合使用,而不克不及作为一种独立零碎.
我国学者根据国内具体情况,利用血液、椰汁、植物激素、平菇液、豆浸液等分歧养分成分,配制成多种分歧的快速培养基.如用平菇制备的平菇双相培养基,在落实培养基基础上的豆浸液培养基、植物激素培养基等.
3.2 用于选择 因为结核杆菌生长缓慢,且养分请求高,是以对于其他的微生物极易生长,通常在培养基中都加有抑菌物资.在罗氏培养基中,微量孔雀绿既可按捺杂菌的生长,又可对结核杆菌的生长有促进感化.Gynft通过把孔雀绿的浓度提高,同时加入青霉素、萘啶酸制备成选择性的改良罗氏培养基[14].在Middlebrook7H10、Middlebrook7H11的基础上,通过加上多黏菌素B、羧苄青霉素C、两性霉素B和三甲氧氨嘧啶即可制备成结核菌素的选择培养基,其目的主如果为了减少净化率,提高阳性率.
3.3 用于鉴别 最次要的有(对硝基苯甲酸)和TCH(噻吩-2-羧酸)鉴别培养基.用溶解浓缩后,在制备L-J培养基的同时,加入二甲基甲酰胺或丙二醇制成PNB培养基,加入噻吩-2-羧酸制成TCH培养基,用于结核分枝杆菌、牛分枝杆菌和非结核性分枝杆菌的初步鉴定[15].
3.4 用于药敏 匡氏培养基是由我国研制的一种在结核杆菌快速药敏试验中有很好价值的培养基[16].虽然BD公司的产品能够快速的检测结核杆菌,而且在药敏方面也有必定的上风,但初期的培养零碎存在放射性,新开发的培养零碎又存在净化率较高的成绩,而在传统的含药罗氏培养基上存在抗结核药物受热失活和蛋白质吸附两个次要成绩至今尚未解决,而匡氏培养基的长处在于不存在高蛋白组分对药物的吸附感化,又无加热凝固等形成药物失活成绩,是以在药敏试验方面有着明显的优胜性.次要由无机盐、维生素、琼脂、甘油和小牛血清等成分构成.药敏试验陈述结果比罗氏培养基平均早29天,多数药敏结果可在3周内陈述,对结核病的临床医治有次要指点意义.BACTEC系列培养零碎、ESP零碎等都可用于药敏试验,一些液体培养基(苏通培养基和胆固醇液体培养)可用于中草药对结核杆菌抑菌试验.
3.5 用于L型细菌的培养 结核杆菌L型的养分基本上与原菌不异,但普通须要加入必定量的渗透压波动剂和血清,国外次要使用的培养基[17]有巯基醋酸盐培养基、PPLO琼脂、VSY肉汤和高桥的胰腺大豆蛋白胨琼脂培养基(TSA-I)等.国内庄玉辉等[18]已成功地利用改良TSA-L培养基培养L型菌.此外安徽蚌埠医学院的L型液体培养基(代号92-3TBL),培养15天后可取沉渣镜检.
在结核杆菌的培养研讨中出现过很多培养基,以上介绍的是国内外通用的一些培养基,有很多新出现的培养基虽然培养时间缩短,但同时出现成绩也很多,是以要慎重选择.另外,要用一种培养基同时达到多种目的也是很困难的,是以很多实验室多同时利用几种培养基,以便于从各个角度来满足临床和科研的须要.总之,只需结核病还威逼着人类的健康,对培养基的研讨还将继续下去,但是如何深入、过细地研讨现有培养基各成分的彼此感化及如何使古代生物技术与传统培养技术更好的结合等成绩还有待于进一步的研讨.
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