快速测定生物样品中蛋白含量的同步荧光法研究.docx
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快速测定生物样品中蛋白含量的同步荧光法研究
快速测定生物样品中蛋白含量的同步荧光法研究
崔凤灵X,闫迎华,张强斋,渠桂荣,卢雁
(河南师范大学化学与环境科学学院,河南省环境污染控制重点实验室,新乡453007
摘要:
最佳实验条件下,基于脱氧尿苷与人血清白蛋白(HSA相互作用,导致血清白蛋白的同步荧光光谱发生特异性变化,且体系的同步荧光强度和溶液中白蛋白的浓度呈良好的线性关系,建立了以脱氧尿苷为探针,运用固定波长同步荧光光谱快速测定生物样品中蛋白质总含量的新方法。
深入考察了$K值、反应介质、试剂用量、离子强度、加入顺序、反应时间等因素对测定的影响。
在最佳实验条件下,体系的同步荧光强度与血清白蛋白在2176~52414LgPmL范围内的线性相关系数为019991,方法的检出限可达0111LgPmL。
运用本方法对人血清、唾液和尿液等生物样品进行测定并进行加标回收实验,回收率在9810%~10215%之间。
对11份空白溶液进行平行测定,相对标准差为112%。
用经典的考马斯亮蓝G2250(CBB法做了对照实验,两种方法测定结果基本一致。
还考察了一些常见离子和有机物存在时对蛋白质测定的影响。
本方法已用于血清、唾液和尿样等生物样品中蛋白质总量的快速测定。
关键词:
脱氧尿苷;人血清白蛋白(HSA;考马斯亮蓝G2250(CBB;同步荧光光谱;分子探针
中图分类号:
O657.3文献标识码:
A文章编号:
100020720(2009122009205
蛋白质是一类重要的生物大分子,它是构成生命体最重要的物质基础之一。
蛋白质的定量测定是临床检验中诊断疾病及检查治疗效果的重要指标。
因此,蛋白质定量测定在化学、生物、医药、食品等各相关学科中已经成为一个非常热门的研究课题[1]。
血清白蛋白是动物和人体血浆中重要的载体蛋白,它能和许多种内源或外源化合物产生作用,承载着将药物运输到达靶点产生药效和储存药物延长药效等重要作用,对研究药物的药效和药理及临床用药有重要意义[2]。
蛋白质测定较常用的经典方法有凯氏定氮法、Lowry法、考马斯亮蓝法、紫外分光光度法[3]等,其中,凯氏定氮法因其适用样品广泛,测试结果准确,是常用分析有机化合物含氮量的经典方法之一[4]。
近来又发展了一些新方法如荧光光度法[4,5]、化学发光法[6]和共振光散射法[7]等。
同步荧光光谱法自1971年被提出以来,由于其与常规荧光分析法相比具有灵敏度高、选择性好、光谱简化、谱带窄化及可减小散射光影响等优点[8],已成功地应用于多组分的同时测定[9]以及生物分子[10]的研究中。
核苷是生物系统的基本构件,具有广泛的生物活性[11,12]。
核苷类化合物是目前公认最有抗病毒潜能的一类药物[13],有关研究已成为当今药物化学中的热点课题。
脱氧尿苷(2c2Deoxyuridine是一种重要核苷类药物中间体,常用于合成具有抗癌、抗病毒活性的52溴脱氧尿苷、52氟脱氧尿苷、碘苷等尿嘧啶类核苷药物。
因而,研究脱氧尿苷与蛋白质的相互作用并以其做为分子探针测定生物样品中蛋白质的含量有重要的意义。
X收稿日期:
2008212225;修订日期:
2009203210
基金项目:
国家自然科学基金(20673034、高等学校博士学科点专项科研基金(20060476001和河南省教育厅自然科学基金(2006150012项目资助
作者简介:
崔凤灵(1963-,女,教授;E2mail:
cuifl718@
1实验部分1.1仪器与试剂
FP26500荧光分光光度计(日本分光公司;T26紫外2可见分光光度计(北京普析通用仪器公司;PB210型酸度计(北京赛多利斯仪器系统公司;BS2110S型电子天平(北京赛多利斯天平公司;脱氧尿苷110@10-3
molPL水溶液;人血清白
蛋白(HSA,华兰生物工程公司410@10-5
molPL水溶液,在冰箱中保存(1~4e;pH714的Tris2HCl缓冲溶液;考马斯亮蓝溶液(溶液中含0101%考马斯亮蓝G2250,417%乙醇,815%磷酸;015molPL的NaCl水溶液。
所用试剂均为分析纯,实验用水均为二次去离子水。
112实验方法
于10mL比色管中依次加入:
pH714的Tris2HCl缓冲溶液210mL,015molPL的NaCl溶液210mL,一定体积的HSA标准溶液,110@10-3
molPL的脱氧尿苷溶液012mL,用水定容至刻度,摇匀,用1cm石英吸收池,在$K=50nm时扫描体系的同步荧光光谱。
2结果与讨论
2.1脱氧尿苷与HSA的相互作用研究
分别用紫外吸收光谱(图1和同步荧光光谱(图2研究了脱氧尿苷与人血清白蛋白的相互作用。
紫外吸收光谱显示,实验条件下蛋白质分别在210和280nm左右出现两个峰,加入不同浓度的脱氧尿苷后,210nm处的吸收峰红移至215nm,而280nm处的峰消失,同时在260nm左右出现新的强吸收峰,吸收光谱的这种特征变化,表明了
HSA与脱氧尿苷之间发生了相互作用,形成了新的复合物。
在蛋白质分子内的三种荧光生色团中,常用
色氨酸残基的荧光来考查其构象的变化[14]
。
在普通荧光光谱中,这三种内源荧光生色团的荧光发射峰基本重叠,难以区分,所得结果比较笼统,而同步荧光光谱能将其区分开。
固定激发波长与发射波长的间距$K,同步扫描激发波和发射波即可得同步荧光光谱,这种光谱已被用于蛋白质的构象变化的分析。
由$K=20nm时扫描得到的同步荧光只显示酪氨酸残基的光谱特性,而$K=60nm所得的同步荧光只显示色氨酸残基的光谱特性。
Burstein认为色氨酸的最大发射波长与其所处的环境有关,随其所处环境的疏水性逐渐降低、
其
图1紫外吸收光谱Fig.1UVabsorptionspectra
1-脱氧尿苷;2-人血清白蛋白;3~6-脱氧尿苷2人血清白蛋白
(12c2Deoxyuridine,c2c2Deoxyuridine=012@10-5molPL;(2HSA,cHSA=018@10-6
molPL;(3~62c2Deoxyuridine2HSA,cHSA=
018@10-6
molPL,c2c2Deoxyuridine=012,014,016,018@10-
5
molP
L
图2胞苷酸与白蛋白相互作用的同步荧光光谱
Fig.2ThesynchronousfluorescencespectraofHSAatvariousconcentrationsof2c2Deoxyuridinewhilethe$K=15nm(aand
$K=60nm(b
1~6:
cHSA=018@10-6molPL;c2c2Deoxyuridine=0,012,014,016,018,110@10-5
molPL
(a$K=20nm;(b$K=60nm
最大发射波长红移
[15]
若色氨酸的最大发射波长改变,则说明蛋白质的构象发生了改变,故由发射波长的改变可判断蛋白质的构象变化。
从图2可以清楚的看出酪氨酸残基和色氨酸酸残基的最大波长都发生了红移,说明脱氧尿苷与HSA发生作用使其所处环境的疏水性降低。
2.2同步荧光光谱测定方法
室温条件下,设定荧光激发与发射狭缝宽度均为5nm,$K=50nm,以同步荧光信号(相对强度对激发波长测绘同步荧光光谱图,在固定脱氧尿苷浓度的条件下,逐渐增加HSA的浓度,进行同步荧光光谱扫描。
在最佳实验条件下扫描得到了2c2Deoxyuridine2HSA体系的同步荧光光谱(图3。
体系的同步荧光强度随HSA浓度的增加有规律的增大,在一定浓度范围内与血清白蛋白的浓度呈良好的线性关系。
据此,建立了一种同
步荧光光谱法分析测定蛋白质的新方法。
图3最佳实验条件下体系的同步荧光光谱
Fig.3Synchronousfluorescencespectraofthesystemunder
theoptimumconditions
2.0mLTris2HCl+2.0mLNaCl+0.2mL2c2Deoxyuridine+XHSA
1~20:
cHSA=0,014,018,112,116,210,214,218,312,316,410,414,418,512,516,610,614,618,712,716(@10-6
molPL
2.3最佳实验条件的选择
2.3.1$K的选择在一定条件下分别考察了$K
为10,15,20,30,40,50,60nm时,体系的同步荧光光谱特征。
结果显示,当$K=50nm时,可以得到同步荧光信号最强且半宽度最小的单峰同步荧光光谱。
故本实验选择$K=50nm。
2.3.2pH的影响pH在6.8~7.6范围内体系的稳定性好、灵敏度高,本实验选择pH7.4。
2.3.3介质的选择考察了Na2B4O72H3B03+NaCl、NaOH2K2HPO4、Tris2HCl、Na2HPO42C6H8O7、H3BO3+KCl2NaCO3、KH2PO42Na2B4O7等6种缓冲溶液在pH7.4的条件下对体系同步荧光强度的影响。
结果表明,在Tris2HCl缓冲溶液中体系的灵敏
度最高、稳定性最好,且Tris2HCl缓冲溶液的用量在2.0mL时体系灵敏度最高。
本实验选用pH7.4的Tris2HCl缓冲溶液2.0mL为反应介质。
2.3.4试剂用量在上述实验条件下,考察了脱氧尿苷试剂用量在0.1~1.0mL之间对体系同步荧光强度的影响。
试剂浓度的增加使同步荧光强度减小,灵敏度降低。
反之,试剂用量减小灵敏度升高,但重现性变差,综合两方面的原因,本实验选择脱氧尿苷试剂用量为0.2mL。
2.3.5离子强度的影响以0.5molPL的NaCI考察了离子强度对体系同步荧光强度的影响。
结果发现:
当NaCI用量在0.5~5.0mL时,离子强度对体系的同步荧光强度有一定影响,NaCI用量为2mL即离子强度为0.1molPL时灵敏度最高。
本实验选择的离子强度为0.1molPL,即0.5molPL的NaCI溶液2.0mL。
2.3.6加入顺序的影响考察了各种不同的物质加入顺序对体系同步荧光强度的影响。
当加入顺序为Tris2HClyNaClyHSAy2c2Deoxyuridine时体系的同步荧光强度最高、且稳定性最好。
2.3.7反应时间和稳定性在上述实验条件下,
考察了反应时间对体系同步荧光强度的影响。
结
果表明,在室温下,该反应在5min内即可完成,且体系的同步荧光强度至少在5h内基本不变。
2.4线性范围、回归方程、检出限
在最佳实验条件下,以体系的同步荧光强度对HSA浓度绘制标准工作曲线,线性回归方程为
ISF=13.60246+211.19154@107
CHSA(molPL,相关系数为R=0.9991。
测定的浓度范围在2.76~524.4LgPmL之间。
根据IUPAC的定义[16]
对11份空白溶液进行平行测定,计算了方法的检出限为0.11LgPmL。
2.5样品的测定和回收率
取自于河南师范大学校医院的人血清样品中蛋白质的浓度较大,实验前将血清样品用二次去离子水稀释100倍至本方法的检测范围,唾液和尿样也进行了合适倍数的稀释,按照实验方法对
上述样品进行测定并进行加标回收实验,测定结果见表1。
参照文献[17],用经典的考马斯亮蓝G2250(CBB法做了样品测定的对照实验,结果见表2。
从表2中数据可以看出,两种方法所得结果基本一致。
表1对生物样品的测定结果(n=6
Tab.1Determinationresultsofbiologicalsamples(n=6
样品
加入量
QP(LgPmL
测得量
QP(LgPmL
回收率
P%
RSD
P%
血清样
55.2
110.4
165.6
133.93
190.83
243.38
299.58
-
100.9
99.6
100.0
0.50
0.60
0.86
0.65
尿样
55.2
110.4
165.6
15.27
71.05
128.79
179.28
-
100.8
102.5
99.1
0.38
0.69
1.3
0.47
唾液样
55.2
110.4
165.6
86.88
139.21
195.12
251.58
-
98.0
98.9
99.6
0.73
1.5
0.25
0.95
表2CBB法与同步荧光法测定蛋白质的结果对照Tab.2Comparisonoftheexperimentalresultsbysynchro2nousfluorescenceandCBBG2250methods
样品
测定值QP(LgPmL
同步荧光法CBB法RSDP%(n=6
血清样133.9132.30.59
尿样15.2717.120.48
唾液样86.8884.180.96
2.6干扰实验
在最佳实验条件下,考察了一些常见离子和有机物存在时对蛋白质测定的影响。
相对误差控制在?
5%内,以下物质共存(倍不干扰样品的测定:
K+(177、Ca2+(72、Zn2+(6、NH4+(65、SO42-(35、PO43-(28、C2O42-(7、F-(27;糊精(36、淀粉(54、果糖(35、葡萄糖(97、麦芽糖(36、柠檬酸(5、丝氨酸(37、DL2苏氨酸(28、蔗糖(58。
某些物质的共存倍数较小,但样品中这些物质的实际含量很低,通过稀释便可消除干扰而不影响测定,因此测定前不用对样品进行特殊处理。
参考文献
[1]崔凤灵,张强斋,王俊丽等.分析试验室,2008,
27(1:
23
[2]CuiFL,ZhangQZ,YanYHetal.CarbohydPolym,
2008,73(3:
464
[3]李娟,张耀庭,曾伟等.中国生物制品学杂志,
2000,13(2:
118
[4]JiangCQ,LuoL.AnalChimActa,2004,506(2:
171
[5]CuiFL,CuiYR,LuoHXetal.ChinSciBull,2006,
51(18:
2201
[6]ZhangHM,ZhuZW,LiNQ.JAnalChem,1999,
363(4:
408
[7]江波,胡庆红.分析试验室,2002,21(3:
27
[8]陈国珍,黄贤智,许金钩.荧光分析法(第二版.北
京:
科学出版社.1990
[9]鄢远,彭学军,许金钩.分析测试学报,1995,
14(1:
16
[10]CuiFL,WangL,FanJetal.JPharmBiomedAnal,
2004,34(1:
189
[11]KumarR,SharmaN,NathMetal.JMedChem,2001,
44(24:
4225
[12]KumarR,NathM,TyrrellDL.JMedChem,2002,
45(10:
2032
[13]ShiragamiH,IneyamaT,UchidaY.JNucleosides&Nu2
cleotides,1996,15(1-3:
47
[14]Trynda2LemieszL,KaraczynA,KeppleBKetal.JIn2
orgBiochem,2000,78(4:
341
[15]朱铿,童沈阳.高等学校化学学报,1996,17(4:
539
[16]IrvingHMHN,FreiserH.in:
T.S.West(Ed.,IU2
PAC,CompendiumofAnalyticalNomenclature,Definitive
Rules,PergamonPress,Oxford,1987
[17]王文平,郭祀远,李琳等.食品研究与开发,
2008,29(1:
115
Studyondeterminationofthetotalproteininbiologicalsamplesbysynchronousfluorescencetechnique
CUIFeng2ling*,YANYing2hua,ZHANGQiang2zhai,QUGui2rongandLUYan(SchoolofChemistryandEnvir2onmentalScience,KeyLaboratoryforYellowRiverandHuaiheRiverWaterEnvironmentandPollutionControlMinis2tryofEducation,HenanNormalUniversity,Xinxiang453007,FenxiShiyanshi,2009,28(12:
9~13Abstract:
Undertheoptimumexperimentalconditions,2c2Deoxyuridinecouldinteractwithhumanserumalbumin(HSA,resultinginthespecificchangesoftheintrinsicfluorescenceofserumalbumin.Synchronousfluorescencein2tensityofthesystemhadagoodlinearrelationshipwiththeserumalbuminconcentrationintherangeof2176~52414LgPmL,andthedetectionlimitofthismethodwas0.11LgPmL.Anovelmethodforthedeterminationoftheproteinswith2c2Deoxyuridineasamolecularprobewasdeveloped.Theeffectfactorsforspectralcharacterizationandintensityofsynchronousfluorescencesuchasthevalueof$K,reactionmedium,reagentconcentration,ionicstrength,additionsequence,reactiontimewerealsoinvestigated.Therecoverieswere98.0%~102.5%and11blanksolut2ionstotheparallelexperimentaldataobtainedtherelativestandarddeviationof1.12%.TheCBBG2250methodwasdoneasthecontrolexperimentandtheresultswereingoodaccordancewiththosebysynchronousfluorescencemethod.Theresultsindicatedthatthismethodwassimple,rapid,andhadhighsensitivity,widelinearrange,goodstabilityandhighselectivity.Itwassuccessfullyappliedtothedeterminationofthetotalproteinsinhumanbodyfluidssuchashumanserum,salivaandurinesamples,andtheresultsweresatisfactory.
Keywords:
2c2Deoxyuridine;Humanserumalbumin;CoomassiebrilliantblueG2250;Synchronousfluorescencespectra;Molecularprobe
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