届 一轮复习人教版 基因工程 学案.docx

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届一轮复习人教版基因工程学案

2020届一轮复习人教版基因工程学案

考点一　基因工程的操作工具

1．限制性核酸内切酶（简称限制酶）

（1）来源：

主要是从原核生物中分离纯化出来的。

（2）作用：

识别双链DNA分子的某种特定的核苷酸序列并切开特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键。

（3）结果：

产生黏性末端或平末端。

2．DNA连接酶

种类

E·coliDNA连接酶

T4DNA连接酶

来源

大肠杆菌

T4噬菌体

特点

只缝合黏性末端

缝合黏性末端和

末端

作用

恢复被限制酶切开的两个核苷酸之间的磷酸二酯键

3．载体

（1）作用：

携带外源DNA片段进入受体细胞。

（2）种类：

质粒、λ噬菌体的衍生物、动植物病毒等。

（3）条件

[基础自测]

1．判断下列叙述的正误

（1）切割质粒的限制性核酸内切酶均能特异性地识别6个核苷酸序列（×）

（2）载体质粒通常采用抗生素合成基因作为筛选标记基因（×）

（3）限制酶只能用于切割目的基因（×）

（4）DNA连接酶能将两碱基间通过氢键连接起来（×）

（5）限制性核酸内切酶、DNA连接酶和质粒是基因工程中常用的三种工具酶（×）

（6）E·coliDNA连接酶既可连接平末端，又可连接黏性末端（×）

（7）用于载体的质粒DNA分子上至少含一个限制酶识别位点（√）

（8）载体的作用是携带目的基因导入受体细胞中，使之稳定存在并表达（√）

2．载体需具备的条件及其作用（连线）

3．据两种限制酶的作用图示填空

（1）已知限制酶EcoRⅠ和SmaⅠ识别的碱基序列和酶切位点分别为G↓AATTC和CCC↓GGG，在图中画出两种限制酶切割DNA后产生的末端。

（2）写出产生的末端的种类：

①产生的是黏性末端；②产生的是平末端。

（3）EcoRⅠ限制酶和SmaⅠ限制酶识别的碱基序列不同，切割位点不同（填“相同”或“不同”），说明限制酶具有专一性。

4．学透教材、理清原因、规范答题用语专练

（1）①是________酶，②是____________酶，二者的作用部位都是______________。

（2）限制酶不切割自身DNA的原因：

__________________________________________。

答案：

（1）限制　DNA连接　磷酸二酯键　

（2）自身DNA不存在该酶的识别序列或识别序列已经被修饰

1.与DNA有关的酶的比较

名称

作用部位

作用底物

作用结果

限制酶

磷酸二酯键

DNA

将DNA切成两个片段

DNA连接酶

磷酸二酯键

DNA片段

将两个DNA片段连接为一个DNA分子

DNA聚合酶或热稳定DNA聚合酶

磷酸二酯键

脱氧核苷酸

将单个脱氧核苷酸依次连接到单链末端

DNA（水解）酶

磷酸二酯键

DNA

将DNA片段水解为单个脱氧核苷酸

解旋酶

碱基对之间的氢键

DNA

将双链DNA分子局部解旋为单链，形成两条长链

RNA聚合酶

磷酸二酯键

核糖核苷酸

将单个核糖核苷酸依次连接到单链末端

2．限制酶的特点与使用

（1）限制酶具有特异性，即一种限制酶只能识别特定的核苷酸序列，并在特定的位点上进行切割；限制酶不切割自身DNA的原因是原核生物DNA分子中不存在该酶的识别序列或识别序列已经被修饰。

（2）在获取目的基因和切割载体时通常用同一种限制酶，以获得相同的黏性末端。

但如果用两种不同限制酶切割后形成的黏性末端相同，在DNA连接酶的作用下目的基因与载体也可以连接起来。

（3）为了防止载体或目的基因的黏性末端自己连接即所谓“环化”，可用不同的限制酶分别处理含目的基因的DNA和载体，使目的基因两侧及载体上各自具有两个不同的黏性末端。

[对点落实]

1．（2016·全国卷Ⅲ）图（a）中的三个DNA片段上依次表示出了EcoRⅠ、BamHⅠ和Sau3AⅠ三种限制性内切酶的识别序列与切割位点，图（b）为某种表达载体的示意图（载体上的EcoRⅠ、Sau3AⅠ的切点是唯一的）。

↓　　　　　　　　↓　　　　　　　↓

——GAATTC——　——GGATCC——　——GATC——

——CTTAAG——　——CCTAGG——　——CTAG——

　　　　　↑　　　　　　　　↑　　　　　　　↑

图（a）

根据基因工程的有关知识，回答下列问题：

（1）经BamHⅠ酶切后得到的目的基因可以与上述表达载体被________酶切后的产物连接，理由是____________________________________________________________________

________________________________________________________________________。

（2）若某人利用图（b）所示的表达载体获得了甲、乙、丙三种含有目的基因的重组子，如图（c）所示。

这三种重组子中，不能在宿主细胞中表达目的基因产物的有________，不能表达的原因是_______________________________________________________________________

________________________________________________________________________。

图（b）　　　　　　　　　　图（c）

（3）DNA连接酶是将两个DNA片段连接起来的酶，常见的有________________和________________，其中既能连接黏性末端又能连接平末端的是______________。

解析：

（1）由题图可知，BamHⅠ和Sau3AⅠ两种限制性内切酶的共同识别序列是

，二者切割可以形成相同的黏性末端，因此经BamHⅠ酶切得到的目的基因可以与图（b）所示表达载体被Sau3AⅠ酶切后的产物连接。

（2）在基因表达载体中，启动子应位于目的基因的首端，终止子应位于目的基因的尾端，这样目的基因才能顺利地转录，再完成翻译过程，即顺利表达。

图中甲所示的目的基因插入在启动子的上游，丙所示目的基因插入在终止子的下游，二者的目的基因均不能被转录，因此目的基因不能表达。

（3）常见的DNA连接酶有E·coliDNA连接酶和T4DNA连接酶，其中T4DNA连接酶既能连接黏性末端又能连接平末端。

答案：

（1）Sau3AⅠ　两种酶切割后产生的片段具有相同的黏性末端　

（2）甲和丙　甲中目的基因插入在启动子的上游，丙中目的基因插入在终止子的下游，二者的目的基因均不能被转录（其他合理答案也可）　（3）E·coliDNA连接酶　T4DNA连接酶　T4DNA连接酶（其他合理答案也可）

2．（2016·江苏高考，有改动）下表是几种限制酶识别序列及其切割位点，图1、图2中标注了相关限制酶的酶切位点，其中切割位点相同的酶不重复标注。

请回答下列问题：

限制酶

BamHⅠ

BclⅠ

Sau3AⅠ

HindⅢ

识别序

列及切

割位点

（1）用图中质粒和目的基因构建重组质粒，应选用__________________两种限制酶切割，酶切后的载体和目的基因片段，通过________酶作用后获得重组质粒。

为了扩增重组质粒，需将其转入处于________态的大肠杆菌。

（2）为了筛选出转入了重组质粒的大肠杆菌，应在筛选平板培养基中添加________，平板上长出的菌落，常用PCR鉴定，所用的引物组成为图2中________________________________________________________________________。

（3）若BamHⅠ酶切的DNA末端与BclⅠ酶切的DNA末端连接，连接部位的6个碱基对序列为________________________，对于该部位，这两种酶________（填“都能”“都不能”或“只有一种能”）切开。

（4）若用Sau3AⅠ切图1质粒最多可能获得________种大小不同的DNA片段。

解析：

（1）基因工程中选择合适的限制酶切割质粒和目的基因时，应保留目的基因和至少一个标记基因结构的完整性，即遵循“目的基因切两侧，标记基因留一个”的基本原则，最好选择切割产生不同末端的两种限制酶同时切割质粒和目的基因，以避免目的基因的反向插入带来的不正常表达，因此据图分析应选择的限制酶为BclⅠ和HindⅢ，切割后质粒上保留的四环素抗性基因作为标记基因。

酶切后的载体和目的基因通过DNA连接酶的作用形成重组质粒，重组质粒需要导入Ca2＋处理后的处于感受态的大肠杆菌（处于感受态的大肠杆菌细胞膜的通透性大大增加，便于重组质粒进入）。

（2）由上述分析可知，为了筛选出导入重组质粒的大肠杆菌，应先配制含四环素的选择培养基，平板上长出的菌落为导入普通质粒或重组质粒的大肠杆菌菌落，进一步鉴定出导入重组质粒的大肠杆菌，可利用PCR扩增的方式，结合电泳技术来分析处理。

DNA的两条链是反向平行的，在PCR过程中，当引物与DNA母链通过碱基互补配对结合后，DNA聚合酶只能从引物的3′端延伸DNA链，因此应选择引物甲和引物丙。

（3）因为BclⅠ和BamHⅠ酶切产生的黏性末端相同，所以可以被DNA连接酶连接，连接部位的6个碱基对序列为

，但是连接后形成的DNA中不再具有BclⅠ和BamHⅠ的识别序列，连接部位不能被这两种酶切开。

（4）由图可知，能被限制酶BclⅠ和BamHⅠ切割的序列也能被Sau3AⅠ识别并切割，因此图中质粒上存在3个Sau3AⅠ的切割位点，若将3个切割位点之间的DNA片段分别编号为a、b和c，则完全酶切（3个切割位点均被切割）会产生3种大小的DNA片段，即为a、b和c；考虑只切1个切割位点，有3种情况，都产生1种大小的DNA片段，即大小均为a＋b＋c；考虑切2个切割位点，则会产生a＋b、c、a＋c、b、b＋c、a几种不同大小的DNA片段。

综上所述，若用Sau3AⅠ识别并切割图中质粒，最多可获得7种大小的DNA片段，即为a＋b＋c、a＋b、a＋c、b＋c、a、b、c。

答案：

（1）BclⅠ和HindⅢ　连接　感受　

（2）四环素　引物甲和引物丙　（3）

　都不能　（4）7

[类题通法]

选择限制酶的技巧

（1）根据目的基因两端的限制酶切点确定限制酶的种类

①应选择切点位于目的基因两端的限制酶，如图甲可选择PstⅠ。

②不能选择切点位于目的基因内部的限制酶，如图甲不能选择SmaⅠ。

③为避免目的基因和质粒的自身环化和随意连接，也可使用不同的限制酶切割目的基因和质粒，如图甲也可选择用PstⅠ和EcoRⅠ两种限制酶（但要确保质粒上也有这两种酶的切点）。

（2）根据质粒的特点确定限制酶的种类

①所选限制酶要与切割目的基因的限制酶一致，以确保具有相同的黏性末端。

②质粒作为载体必须具备标记基因等，所以所选择的限制酶尽量不要破坏这些结构，如图乙中限制酶SmaⅠ会破坏标记基因。

考点二　基因工程的基本操作程序

　基因工程的基本操作程序

―→

―→

―→

1．目的基因的获取

（1）目的基因：

主要是指编码蛋白质的基因，也可以是具有调控作用的因子。

（2）获取方法

2．基因表达载体的构建

（1）构建基因表达载体的目的

①使目的基因在受体细胞中稳定存在，并且可以遗传给下一代。

②使目的基因能够表达和发挥作用。

（2）基因表达载体的组成：

目的基因、启动子、终止子及标记基因等。

3．目的基因导入受体细胞

受体细胞类型

方法

植物细胞

农杆菌转化法、基因枪法、花粉管通道法

动物细胞

显微注射技术（注射到受精卵内）

微生物细胞

感受态细胞法（Ca2＋处理法）

4．目的基因的检测与鉴定

检测目的

检测方法

判断标准

目的基因是否插入转基因生物的DNA

DNA分子杂交技术

是否出现杂交带

目的基因是否转录出了mRNA

分子杂交技术

是否出现杂交带

目的基因是否翻译出蛋白质

抗原—抗体杂交技术

是否出现杂交带

个体水平的检测

如抗虫、抗病的接种实验

是否表现出相应的特性

[基础自测]

1．判断下列叙述的正误

（1）表达载体的复制和胰岛素基因的表达均启动于复制原点（×）

（2）转基因抗虫棉植株抗虫效果的鉴定必须通过分子检测（×）

（3）PCR反应中温度的周期性改变是为了DNA聚合酶催化不同的反应（×）

（4）抗虫基因即使成功地插入植物细胞染色体上也未必能正常表达（√）

（5）用PCR方法扩增目的基因时不必知道基因的全部序列（√）

（6）PCR体系中一定要添加从受体细胞中提取的DNA聚合酶（×）

（7）外源DNA必须位于重组质粒的启动子和终止子之间才能进行复制（×）

（8）目的基因导入双子叶植物一般采用农杆菌转化法（√）

（9）为培育抗除草剂的作物新品种，导入抗除草剂基因时只能以受精卵为受体（×）

（10）检测目的基因是否导入受体细胞可用抗原－抗体杂交技术（×）

2．基因表达载体的组成及各部分的作用（连线）

3．学透教材、理清原因、规范答题用语专练

（1）从图中可以看出，目的基因是________________，使用的载体是________，将基因表达载体导入受体细胞的方法是________________。

（2）请写出两种检测目的基因是否表达的方法：

__________________________________。

答案：

（1）Bt毒蛋白基因　Ti质粒　农杆菌转化法　

（2）抗原—抗体杂交法、用棉叶饲喂棉铃虫

1．获取目的基因的方法比较

方法

从基因文库中获取

人工合成

从基因组文

库中获取

从部分基因文

库中获取，如

cDNA文库

化学

合成法

逆转

录法

过程

2．PCR反应的过程

过程

说明

图解

变性

温度上升到90℃左右，双链DNA解聚为单链

复性

温度下降到55℃左右，两种引物通过碱基互补配对与两条单链DNA结合

延伸

温度上升到72℃左右，Taq酶从引物起始合成互补链，可使新链由5′端向3′端延伸

3．目的基因检测与鉴定的方法

[对点落实]

1．（2018·海南高考）甜蛋白是一种高甜度的特殊蛋白质。

为了改善黄瓜的品质，科学家采用农杆菌转化法将一种甜蛋白基因成功导入黄瓜细胞，得到了转基因植株。

回答下列问题：

（1）用农杆菌感染时，应优先选用黄瓜________（填“受伤的”或“完好的”）叶片与含重组质粒的农杆菌共培养，选用这种叶片的理由是_____________________________________

___________________________________________________________________________。

（2）若在转基因黄瓜中检测到这种甜蛋白，则表明该重组质粒中____________已转移到植物细胞中且能够表达；用该转基因黄瓜的某一植株与一株非转基因植株杂交，发现子代中含甜蛋白个体数与不含甜蛋白个体数之比为1∶1，则说明甜蛋白基因已经整合到________________（填“核基因组”“线粒体基因组”或“叶绿体基因组”）中。

（3）假设某种转基因作物因为受到病毒感染而减产，若要以该转基因作物为材料获得脱毒苗，应选用________作为外植体进行组织培养。

（4）通常，基因工程操作主要有4个步骤，即目的基因获取、重组表达载体的构建、将目的基因导入受体细胞、目的基因的检测与鉴定。

因此，基因工程的含义可概括为________________________________________________________________________

________________________________________________________________________

________________________________________________________________________。

解析：

（1）用农杆菌感染时，应优先选用黄瓜受伤的叶片与含重组质粒的农杆菌共培养，理由是叶片伤口处的细胞释放出大量酚类物质，可吸引农杆菌移向这些细胞。

（2）若在转基因黄瓜中检测到这种甜蛋白，则表明该重组质粒中甜蛋白基因已转移到植物细胞中且能够表达；用该转基因黄瓜的某一植株与一株非转基因植株杂交，发现子代中含甜蛋白个体数与不含甜蛋白个体数之比为1∶1，则说明甜蛋白基因已经整合到核基因组中。

（3）假设某种转基因作物因为受到病毒感染而减产，若要以该转基因作物为材料获得脱毒苗，应选用茎尖作为外植体进行组织培养。

（4）通常，基因工程操作主要有4个步骤，即目的基因获取、重组表达载体的构建、将目的基因导入受体细胞、目的基因的检测与鉴定。

因此，基因工程的含义可概括为按照人们的愿望进行设计，并通过体外重组和转基因等技术，赋予生物新的遗传特性，创造出符合人们需要的新生物类型。

答案：

（1）受伤的　叶片伤口处的细胞释放出大量酚类物质，可吸引农杆菌移向这些细胞　

（2）甜蛋白基因　核基因组　（3）茎尖　（4）按照人们的愿望进行设计，并通过体外重组和转基因等技术，赋予生物新的遗传特性，创造出符合人们需要的新生物类型

2．（2018·江苏高考有改动）为生产具有特定性能的α淀粉酶，研究人员从某种海洋细菌中克隆了α淀粉酶基因（1656个碱基对），利用基因工程大量制备α淀粉酶，实验流程见下图。

请回答下列问题：

（1）利用PCR技术扩增α淀粉酶基因前，需先获得细菌的________________。

（2）为了便于扩增的DNA片段与表达载体连接，需在引物的________端加上限制性酶切位点，且常在两条引物上设计加入不同的限制性酶切位点，主要目的是________________________________________________________________________

________________________________________________________________________。

（3）进行扩增时，反应的温度和时间需根据具体情况进行设定，下列选项中________的设定与引物有关，________的设定与扩增片段的长度有关。

（填序号）

①变性温度　②退火（复性）温度　③延伸温度　④变性时间　⑤退火（复性）时间　⑥延伸时间

（4）下图表示筛选获得的工程菌中编码α淀粉酶的mRNA的部分碱基序列：

图中虚线框内mRNA片段包含________个密码子，如虚线框后的序列未知，预测虚线框后的第一个密码子最多有________种。

（5）获得工程菌表达的α淀粉酶后，为探究影响酶活性的因素，以浓度为1%的可溶性淀粉为底物测定酶活性，结果如下：

缓冲液

50mmol/LNa2HPO4KH2PO4

50mmol/LTrisHCl

50mmol/L

GlyNaOH

pH

6.0

6.5

7.0

7.5

7.5

8.0

8.5

9.0

9.0

9.5

10.0

10.5

酶相对活性（%）

25.4

40.2

49.8

63.2

70.1

95.5

99.5

85.3

68.1

63.7

41.5

20.8

根据上述实验结果，初步判断该α淀粉酶活性最高的条件为________________________________________________________________________。

解析：

（1）利用PCR技术扩增α淀粉酶基因前，需先获得细菌的基因组DNA作为模板，并依据α淀粉酶基因两端的部分核苷酸序列合成两条引物。

（2）利用PCR技术扩增DNA时，只能从3′端延伸DNA子链，为了便于扩增的DNA片段与表达载体连接，需在引物的5′端加上限制性酶切位点，并且要注意在两条引物上设计加入不同的限制性酶切位点，这样既能防止目的基因、载体的自身连接，又能确保目的基因与表达载体的定向连接。

（3）PCR技术包括变性、退火（复性）和延伸三步，变性温度决定PCR反应中双链DNA的解链，且时间很短；退火（复性）时引物结合到互补的DNA单链上，退火（复性）温度由引物复性温度决定，其温度设定与引物的长度、碱基组成及浓度等有关；延伸时间与产物片段的长度有关，产物在1kb以内的延伸时间为1min左右，3～4kb的延伸时间为3～4min。

（4）图中虚线框内共含有24个碱基，mRNA上3个相邻的碱基编码1个氨基酸，故共包含8个密码子。

虚线框后的第1个密码子的第1个碱基是U，第2和第3个碱基各有4种可能性，因此共有16种可能性。

题干表明控制α淀粉酶的基因有1656个碱基对，说明图中虚线框后的第1个密码子肯定不是终止密码子（3种终止密码子为UAA、UAG、UGA），故虚线框后第1个密码子实际最多可能性有16－3＝13（种）。

（5）分析表格中的数据，酶相对活性最高为99.5%，对应的条件是pH为8.5，缓冲液为50mmol/LTrisHCl。

答案：

（1）基因组DNA　

（2）5′　使DNA片段能定向插入表达载体，减少自连　（3）②　⑥　（4）8　13　（5）pH为8.5，缓冲液为50mmol/LTrisHCl

考点三　基因工程的应用与蛋白质工程

一、基因工程的应用

1．植物基因工程：

培育抗虫转基因植物、抗病转基因植物和抗逆转基因植物；利用转基因改良植物的品质；利用植物生产药物等。

2．动物基因工程：

用于提高动物生长速度；用于改善畜产品品质；用转基因动物生产药物；用转基因动物作器官移植的供体等。

3．基因工程药物

（1）来源：

利用转基因的“工程菌”来生产的药物。

（2）种类：

细胞因子、抗体、疫苗、激素等。

4．基因治疗

（1）概念：

把正常基因导入病人体内，使该基因的表达产物发挥功能，从而达到治疗疾病的目的，这是治疗遗传病的最有效的手段。

（2）类型：

体外基因治疗和体内基因治疗。

二、蛋白质工程

（1）操作手段：

基因修饰或基因合成。

（2）结果：

对现有蛋白质进行改造或制造出新的蛋白质。

（3）设计流程

―→

―→

―→

[基础自测]

1．判断下列叙述的正误

（1）将人的干扰素基因重组到质粒后导入大肠杆菌，获得能产生人干扰素的菌株（√）

（2）利用乳腺生物反应器能够获得一些重要的医药产品，如人的血清白蛋白，这是因为将人的血清白蛋白基因导入了动物的乳腺细胞中（×）

（3）由大肠杆菌工程菌获得人的干扰素后可直接应用（×）

（4）蛋白质工程的目的是改造或合成人类需要的蛋白质（√）

（5）蛋白质工程可以合成自然界中不存在的蛋白质（√）

（6）蛋白质工程是在分子水平上对蛋白质分子直接进行操作，定向改变分子的结构（×）

2．填写蛋白质工程流程图中字母代表的含义

A．转录，B.翻译，C.分子设计，D.氨基酸序列，E.预期功能。

1．体外基因治疗与体内基因治疗的区别

方法

比较　　

体外基因治疗

体内基因治疗

不同点

途径

从患者体内获得某种细胞→体外完成基因转移→筛选、细胞扩增→输入体内

直接向患者体内组织细胞中转移基因

特点

操作复杂，但效果可靠

方法较简单，但效果难以控制

相同点

都是将外源基因导入靶细胞，以纠正缺陷基因，目前两种方法都处于临床试验阶段