Western blot分析CTPSOD的跨膜转导.docx
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Westernblot分析CTPSOD的跨膜转导
一.样品准备
不同发酵时间的发酵液(900ul),TCA-丙酮沉淀法沉淀蛋白。
1加脱氧胆酸钠至0.02%终浓度,混匀室温放置至少15min
2加100%TCA至10%终浓度,混匀,室温至少放置1h
34度14000转离心10分钟,弃上清,倒置干燥
3加冰预冷的丙酮,混合,低温放置至少20分钟
54度最高转速离心10分钟,倒上清,倒置干燥丙酮
30ul一乘上样缓冲液溶解沉淀,沸水煮5分钟
总体时间3小时
所用试剂:
转膜缓冲液:
(48mmol/LTris,39mmol/L甘氨酸,0.037%SDS,20%甲醇)
甘氨酸(MW75.07)2.9g
Tris(MW121.14)5.8g
SDS0.37g
甲醇200ml
蒸馏水至1000ml
溶解后室温保存,此溶液可重复使用3~5次(此溶液最好保存在4度冰箱,最多使用5次左右,不然影响转移效率)。
(先用蒸馏水溶解甘氨酸、Tris和SDS,然后再加入甲醇,最后补足液体。
如果先加入甲醇,溶解甘氨酸、Tris和SDS等比较困难)(可以配制成2×转移缓冲液进行保存,稀释后使用)
TBS缓冲液:
(10mMTris-HclpH7.5,150mmol/LNaCl)
1mol/LTris·HCl(pH7.5)10ml
NaCl8.8g
蒸馏水至1000ml
(可以配制成10×TBS缓冲液进行保存,稀释10倍使用)
10×TBS:
Tris12.11g,NaCl88g
蒸馏水至900ml,调节pH至7.5,定容1000ml
Tris4.844g,NaCl35.2g。
蒸馏水至350ml,调节pH至7.5,定容400ml
TBST缓冲液:
(含0.05%Tween20的TBS缓冲液)
20%Tween201.65ml
TBS700ml
混匀后即可使用,最好现用现配。
封闭液:
脱脂奶粉5g
TBST100ml
最好现用现配。
或者用含5%BSA的TBST
溶解后4℃保存。
使用时,恢复室温,用量以盖过膜面即可,一次性使用。
二.制备凝胶
样品制备过程中,制备凝胶
5%浓缩胶12%分离胶
配制凝固时间:
分离胶30分钟,浓缩胶50分钟
电泳时间:
80V二十分钟,100V100分钟左右。
可以降低电压,60V80V
滤纸和膜的准备(在电泳结束前20分钟应开始准备工作)。
A.检查是否有足够的transferbuffer,没有立即配制。
B.检查是否有合适大小的滤纸和膜。
C.将膜泡入甲醇中,约1-10分钟。
再转入transferbuffer中。
D.将合适的靠胶滤纸和靠膜滤纸分别泡入transferbuffer中。
转膜
1.准备6张和凝胶大小相近的滤纸和1张PVDF膜。
切滤纸和膜时一定要戴手套,因为手上的蛋白会污染膜。
2.甲醇活性化PVDF膜:
一般活化5-10min,用镊子捏住膜的一边轻轻置于有甲醇的培养皿里浸泡。
3.转膜液浸泡:
将电泳好的凝胶剥下,去掉浓缩胶,切割成合适大小,注意目的条带的位置。
在加有转移液的培养皿中放入切好的凝胶、平头镊子、一支玻璃棒、滤纸、浸过的膜。
4.在转膜液中对齐三层滤纸,用平头镊子赶出滤纸层中的气泡,夹出放在转膜仪上;分离胶盖于滤纸上,用手调整使其与滤纸对齐,轻轻用玻璃棒轻轻擀去气泡(由中间向两边赶)。
将膜盖于凝胶上,要盖满整个胶(膜盖下后不可再移动)并除气泡。
在膜上盖3张滤纸并除去气泡。
擀几下就可合起夹子。
整个操作要不断的擀去气泡。
5.盖上转膜仪上盖,设置好电压和时间。
一般用半干转膜仪10V45-60min
6转完后将膜用1×丽春红染液染1-2min(平头蘖枝夹住边缘,轻轻浸入染液)。
然后用水冲洗掉没染上的染液就可看到膜上的蛋白(超纯水多洗两遍,)。
将膜晾干备用。
封闭:
将膜用TBS从下向上浸湿后,移至含有封闭液的培养皿中,室温下脱色摇床上摇动封闭2h。
用TBS将膜上的封闭液洗去(轻轻晃晃就可)。
孵育一抗:
一抗用封闭液(或者用含有5%BSA的TBST)稀释至适当浓度(在1.5ml离心管中);将PVDF膜放入PE手套中,用封口机将膜封闭,将抗体溶液加到膜的蛋白面(转膜时做好标记)赶出残留气泡;室温下孵育2h后,用TBST在室温下脱色摇床上洗3次(多洗几次,多加TBST),每次10min;再用TBS洗一次,5min。
孵育二抗:
同上方法准备稀释二抗,摇床,室温下孵育1h后,用TBST在室温
下脱色摇床上洗3次,每次10min;再用TBS洗一次,5min。
一抗推荐稀释比例:
1:
200-1:
2000
二抗推荐稀释比例:
1:
5000-1:
100,0000
先前做过两次实验:
一抗1:
500,二抗1:
2000,背景较重,出现非特异条带。
这次做可以先把二抗浓度改为1:
20000,一抗:
1:
5001:
1000
显色(HRP酶)
1.增强化学发光法(ECL)
Ecl显色原理:
氨基苯二酰肼类主要是鲁米诺及异鲁米诺衍生物,是最常用的一类化学发光剂。
鲁米诺在免疫测定中既可用作标记物,也可用作过氧化物酶的底物。
在Ecl底物中,含有H2O2和鲁米诺,在HRP(辣根过氧化物酶)的作用下,发出荧光来。
试验步骤:
1)将A和B两种试剂在保鲜膜上等体积混合(一般各1ml/membrane)。
1min后,将膜蛋白面朝下与此混合液充分接触,1-2min后,将膜移至另一保鲜膜上,去尽残液,包好,放入X-光片夹中。
2)在暗室中,将1×显影液和定影液分别到入塑料盘中;在红灯下取出X-光片,用切纸刀剪裁适当大小(比膜的长和宽均需大1cm);打开X-光片夹,把X-光片放在膜上,一旦放上,便不能移动,关上X-光片夹,开始计时;根据信号的强弱适当调整曝光时间,一般为1min,也可选择不同时间多次压片,以达最佳效果;曝光完成后,打开X-光片夹,取出X-光片,迅速浸入显影液中显影,待出现明显条带后,即刻终止显影。
显影时间一般为1~2min(20~25℃),温度过低时(低于16℃)需适当延长显影时间;显影结束后,马上把X-光片浸入定影液中,定影时间一般为5~10min,以胶片透明为止;用自来水冲去残留的定影液后,室温下晾干。
3)根据结果调整曝光时间和曝光区域,得到最佳结果。
注意:
荧光在一段时间后会越来越弱。
显影和定影需移动胶片时,尽量用镊子拿胶片一角,手指甲不要划伤胶片,否则会对结果产生影响。
2.DAB显色
DAB(3,3二氨基联苯胺)和HRP反应产生棕色的不溶终产物。
这种棕色沉淀不溶于酒精和其它有机溶剂,对于必需使用传统复染和封固介质的免疫组化染色应用特别理想。
对于AP标记的二抗我们选用BCIPandNBT显色,它们在碱性磷酸酶(AP)作用下反应可生成一种不溶性黑紫色沉淀的强信号。
Western显色
ECL灵敏度比DAB高不少
预实验:
点杂交
剪一块大小合适的PVDF膜,甲醇浸泡10min,至半透明,晾干。
滴上不同浓度的蛋白(先加5UL,37度烘干,再加5UL,烘干)。
加封闭液,室温,摇床2小时,(温度低时,可适当延长封闭时间。
)
加不同浓度一抗,2小时,室温,摇床。
(1:
5001:
10001:
2000)不同梯度。
洗膜液洗4次,每次5分钟。
不同浓度二抗1小时,室温,摇床。
(1:
5000)
洗膜液洗4次,每次5分钟.
PBS洗5分钟.显色
疑问,孵育一抗和二抗的时间。
抗体稀释:
用1%BSA(TBST溶解)稀释(本实验室),3%BSA
09.4.19
将PVDF膜在甲醇中浸泡10分钟活化;
TBST冲洗PVDF膜,在滤纸上面晾干;
滴加相应的蛋白溶液,在滤纸上晾干水分;
孵育一抗(1:
500)37℃2h;
TBST漂洗3次,每次10min;
孵育二抗(1:
2000)37℃45min;
TBST漂洗3次,每次10min;
在滤纸上晾干水分,DAB显色;
结果如右图
7.30.2009Westernblot实验:
5%脱脂奶粉封闭过夜,早上室温摇床继续封闭2h。
第一张膜:
一抗1:
500孵育1h,二抗1:
20000孵育45min
第二张膜:
一抗1:
1000孵育1h,二抗1:
10000孵育45min
7.30下午继续电泳,转膜
转膜完毕后,丽春红染色,看不到蛋白条带(没有转上,还是转过头了,蛋白降解?
)
下次继续,点七个泳道,一个用来做考染,确定蛋白大体位置。
另外六个转膜。
转膜后,丽春红染色,根据蛋白条带位置将膜剪为6条,蛋白面表上序号。
没条孵育不同浓度的一抗和二抗,
一抗1:
500
二抗1:
2000、1:
5000、1:
10000
8月1号,Westernblotting实验
上样六个泳道,切下凝胶大小:
2.0×5.3
PVDF膜和滤纸大小2.3×5.6,向转膜仪上放滤纸、膜和凝胶时,发现膜的长度稍比凝胶短一点。
PVDF膜和滤纸大小应该在2.3×5.8
先把切好的凝胶放在转移缓冲液中浸泡,剪下合适大小的膜放入甲醇中活化5min,水中洗数分钟,在浸泡于转移缓冲液中。
剪下滤纸泡在转移缓冲液中(泡滤纸和凝胶的要分开),在转移缓冲液中叠放好滤纸,赶出气泡。
依次将滤纸和膜凝胶叠放入转膜仪上,防治过程中防止形成气泡,或用玻璃棒赶出。
转膜电压:
10V60min;但是不知什么原因电流很低,转30min后,电流还是很低,电压改为15V,电流还是上不来,还剩余15分钟时,电压改为20V。
转膜结束后,丽春红染色,条带明显。
牛奶封闭,摇床室温3h(实际封闭6h)
孵育一抗:
5%BSA的TBST稀释一抗,比例1:
500,1:
1000
4度孵育过夜,然后37度孵育1小时
TBST洗涤:
10min×6所用的TBST是含有0.1%Tween20的TBS(原先用的是0.05%Tween20)
孵育二抗:
5%BSA的TBST稀释二抗,比例1:
2500,1:
5000,1:
10000
37度孵育1小时
TBST洗涤:
10min×6
超纯水或者TBS冲洗膜,晾干,显色-没有结果
第一次做Westernblotting时的条件是:
孵育一抗(1:
500)37℃2h;
TBST漂洗3次,每次10min;
孵育二抗(1:
2000)37℃45min;
TBST漂洗3次,每次10min
8月3号,Westernblotting实验
SDS-PAGE电压:
80V100V
转膜电压:
20V30min,效果较好。
5%脱脂牛奶封闭,37度摇床,60转/min封闭1-2h
孵育一抗:
稀释比例1:
500和1:
750
4度孵育过夜,然后37度孵育1h
TBST漂洗:
5min一次
10min×5漂洗时间过长?
孵育二抗:
稀释比例1:
20001:
40001:
8000
室温孵育1h
TBST漂洗:
5min一次
10min×5
结果没有条带。
现在可以确定的是转膜条件,效果很好。
现在用的是5%牛奶封闭,原先是5%BSA封闭,可能封闭时间太长。
还有就是TBST漂洗的时间,孵育一抗后,漂洗的时间应该较短一些,比如
10min×3
孵育二抗后,则可以根据背景的高低,来决定抗体的浓度和漂洗时间
9月1号Westernblotting实验
前记:
二抗是和一抗结合,所以前面封闭和孵育一抗的时间要做好,还有就是一抗的稀释浓度,二抗是影响到背景的高低。
参考以前做的结果来看,一抗推荐稀释比例在200-2000,我用过500的比例,有结果,但有非特异条带。
所以一抗应该降低浓度,延长孵育时间。
500孵育1h;1000孵育2h37度
二抗推荐比例5000-100000,但是我用过2000,有结果。
因时间二抗购买时间有点长,可以才用20004000孵育时间45-60min,37度
参照8月3号
SDS-PAGE电压:
80V100V
转膜电压:
20V30min,效果较好。
5%脱脂牛奶封闭,37度摇床,60转/min封闭1-2h
TBST仍用含0.05%Tween20的
细胞裂解液:
RIPA裂解配方:
50mMTris-HCl(pH7.4)、150mMNaCl、1mMPMSF
1mMEDTA、1%Tritonx-100、1%脱氧胆酸钠、0.1%SDS
CTP-SOD(多少活力单位)处理细胞,
一瓶细胞长到75%汇合度时,换无血清的DMEM培养基2-3ml,加入多少活力单位的蛋白,处理2h。
弃掉培养基,灭菌PBS洗涤细胞两次,胰酶消化(适度轻微),灭菌PBS吹打下细胞,转移至1.5mlEP管,离心弃掉上清,加入适量细胞裂解液,吹打或者振荡裂解细胞。
?
沉淀的细胞直接用1×SDSPAGEbuffer悬起,煮沸裂解。
9月2号
配制Western的试剂(10×TBS,TBST,转移缓冲液),
沉淀蛋白用的试剂(2%脱氧胆酸,100TCA),
还有蛋白电泳所用的缓冲液(pH6.81M1.5M)
沉淀以前的蛋白发酵液,做一次Western
9月2号,周三
将以前做的时间-表达量关系的发酵液用脱氧胆酸-TCA沉淀
向900ul发酵液中加入10ul2%脱氧胆酸,冰浴10min,然后加入100ul100%TCA冰浴20min。
12000rpm,4度离心10min,弃上清,加入冰预冷丙酮1ml,-20度,放置20-30min
离心,沉淀用20-30ul1×loadingbuffer溶解,100度处理5min。
TAKARA的的分子量蛋白MARKER按照说明书配制,分装到PCR管中,10ul一管,用时100度处理5-10min。
电泳结果表明:
沉淀的蛋白量足够,方法可行
今天配制的SDS-PAGE缓冲液用的五楼的酸度计,不太准确。
AP也是刚配制的,灌注凝胶后,一直不凝?
9月3号,周四
上午清理超净工作台,灭菌吸头,离心管等,准备配制0.1M的pyrogallol,做细胞实验。
又配制了一次聚丙烯酰胺凝胶,还是不凝。
去谢老师实验室借了500AP,重新配制15%凝胶,很快就凝结了,说明实验室的AP过期,不能用了。
点样,看新配的缓冲液是否能用。
结果:
蛋白Marker六条带都有,分子量最小的条带弥散。
配制12%凝胶,准备晚上做WESTERN.
12%凝胶,电泳结束后切下一部分,考马斯亮蓝染色,确定目的条带位置,然后将剩余凝胶切为合适大小,在转移液中浸泡,剪下同样大小的滤纸,同样浸泡
转膜:
条件20V,转了26min,电流由0.2A上升到了0.9A,停止了转膜,丽春红染色,剪下条带,蒸馏水洗去丽春红(可能丽春红染色时间较长,红色没有完全洗掉),5%牛奶四度封闭过夜。
22:
00-
9月4号,周五
早上8点,封闭过夜(10h)的膜拿出,室温摇床继续封闭1h,
稀释一抗和二抗,直接用TBST稀释。
一抗:
1:
5001:
750
二抗:
1:
20001:
4000
封闭结束后TBST冲洗PVDF膜,在干净的滤纸上把膜晾干。
孵育一抗(1:
500)37℃1h;
TBST漂洗4次,每次9min;
孵育二抗(1:
2000)37℃45min;
TBST漂洗3次,每次90min;
在滤纸上晾干水分,DAB显色;500ul灭菌水先加入A液25ul充分混匀,然后加入B,C液各25ul。
混匀后用于显色。
吸取50-100ul显色液至EP手套上,将膜的蛋白面放在显色液上显色,一般1-2min可以显色,显色后将膜放入双蒸水中停止显色。
显色后效果较好,背景很低,几乎为白色!
9月5号周六
早上将以前纯化的蛋白电泳,准备重复做一次Wesrtern,
12%凝胶,70V20min,100V60min。
转膜:
20V电流从0.18A变为0.25A,和上次相比变化较小,转了45min。
将其中一张膜丽春红染色,转膜效果较好。
封闭:
TBST溶解的5%脱脂牛奶,37度,摇床80r/min封闭2h。
TBST冲洗掉多余封闭液,孵育一抗,37度,摇床120r/min孵育1h
TBST漂洗4次,每次10min。
滤纸吸干TBST
孵育二抗,37度,摇床120r/min孵育45min,
滤纸吸干TBST,DAB显色,结果一般,仍有非特异条带。
DAB显色:
1min左右就可以显出棕黄的条带,如果没有条带出现,说明实验失败。
显色时间过长会导致膜的背景较高。
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