饲用山羊豆的扩种试验及其共生结瘤固氮特性研究论文.docx
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饲用山羊豆的扩种试验及其共生结瘤固氮特性研究论文
饲用山羊豆的扩种试验及其共生结瘤固氮特性研究
摘要本论文综述了国内外关于山羊豆研究进展,阐述了山羊豆的生物生态学特性。
并完成了饲用山羊豆的扩种试验与共生结瘤固氮特性研究。
经扩种试验结果表明,在山西大陆性半干旱气候条件及石灰性碱性土壤下引种饲用山羊豆是可行的,用机械处理种子后萌发率和发芽率效果较好,通过对山羊豆扩种试验田的根瘤采集,分离、纯化山羊豆根瘤菌,并对山羊豆根瘤菌进行了理化特性分析、抗逆性能测定和分型鉴定。
从中选出了高效菌株。
进行半固体培养回接试验及其大田扩种接种研究,接种植株侵染明显好于空白对照植株。
选取其中固氮效果较好的菌株进行大田接种应用,发现其植株根瘤数量和植株生物产量具有显著正相关。
所有种植过山羊豆的土壤氮含量均得到显著提高,土壤有机质含量也有所增加,饲用山羊豆扩种成功,社会经济效益比较明显。
关键词:
山羊豆引种试验结瘤固氮
1引言
山羊豆(Galega)是豆科山羊豆属多年生豆科牧草,1920年开始被用于饲用植物进行研究,1932年前苏联饲料研究所在高加索山区进行野生饲用山羊豆栽培驯化,逐渐成为高加索森林草原带的一种新型优质牧草[1]。
饲用山羊豆抗逆性强,可在-40℃的低温下越冬,耐水渍14天以上,抗旱能力强,在早春干旱条件下,产量比其他牧草高,适宜在降水量400~450mm的地区种植。
对土壤要求不高,喜微酸性、透气性好的土壤,也能适应pH4.5左右的酸性土壤。
抗真菌、病毒和细菌性病害,以及抗昆虫、线虫等的侵害能力强。
营养价值高,蛋白质含量达20%~22%,脂肪含量3%~4%,胡萝卜素含量500~600μg/kg,营养生长阶段植株氨基酸含量达98g/kg。
研究表明,饲用山羊豆饲养奶牛可提高产奶量10%~40%。
生长期长达20年以上,具有改良土壤与水土保持的功能[2]。
1.1国内外山羊豆研究现状
山羊豆早在中世纪欧洲就用于治疗瘟疫、蛇咬伤、瘴气、排尿困难等疾病。
它含有多种生物碱[包括鸭嘴花碱(Ischaemum)和山羊豆碱(galegine)等]和黄酮类活性物质,具有治疗糖尿病、抗菌、抑制血小板凝集、利尿、排汗、催乳等功效[3]。
利用山羊豆碱研制出的药物Metformin和Galactogil已经分别应用于II型糖尿病和哺乳期母乳缺乏症的治疗。
利用山羊豆作饲料,按每千克母羊体重添加2g山羊豆干物质,从生产羔羊第一个月开始一直到产奶60天后,产奶量提高16.90%,120天后产奶量提高10.86%。
山羊豆原产于高加索高山地带,在亚美尼亚、格鲁吉亚、达格斯坦和阿塞拜疆等地有天然分布。
山羊豆的生态适应性范围很广,抗寒和抗旱性比苜蓿和三叶草都强,在俄罗斯的欧洲部分和西伯利亚地区都可生长,山羊豆在北欧和加拿大一些较寒冷地区也可以越冬。
在土壤水分不足的情况下仍然获得高于苜蓿和三叶草的产量。
在俄罗斯黑土地条件下春季比苜蓿返青早,饲喂利用期比苜蓿早15~20天。
山羊豆的生长速度快,生长旺盛期主茎每昼夜可生长4~5cm,而苜蓿一般1.8cm左右。
该草为长寿多年生牧草,在同一地上可生长10~15年而不衰。
国内对山羊豆的研究主要是对其引种试验的研究。
沙伟等人认为,在低温胁迫下,东方山羊豆及敖汉苜蓿脯氨酸含量、SOD、POD活性、可溶性蛋白含量先上升后下降。
经过对几项生理指标的综合分析后,认为山羊豆具有比敖汉苜蓿更强的抗低温能力[4]。
禤丽芳,师帅,郝伟伟,沙伟等人以东方山羊豆种子为材料,研究机械、酸蚀以及热水处理对东方山羊豆种子活力的影响,结果表明,各种处理均能对东方山羊豆种子活力产生影响,其中以机械处理效果最好,发芽快而整齐,发芽率高。
浓硫酸处理时,5min的效果最好。
温水处理时50℃效果最好[5]。
张清斌等人在1999年1月从哈萨克斯坦共和国引进多年生优良豆科牧草东方山羊豆分别在不同地点进行了多点试种,并对其播种密度、播种深度、产草量、单株种子平均产量、营养成分、适口性等方面进行了研究。
并且通过4年的多点引种栽培试验取得成功,总结出一套饲用山羊豆的栽培技术规程和适宜种植地区,他认为饲用山羊豆适宜我国干旱、半干旱种植苜蓿的地方栽培种植,并适宜年降水量在600mm以上的地区旱作[6]。
张自和用饲用山羊豆与传统三叶草、猫尾草混播育肥犊牛,效果提高21.8%。
张忠祥在陇东半干旱雨养农区引种饲用山羊豆,结果表明,山羊豆在当地适应性好,可进行推广栽培。
1.2山羊豆生物学特性
山羊豆为多年生豆科草本植物,根为粗壮直根型,主根深达1m,有根蘖,侧根发达,幼根着生根瘤。
茎中空、柔软,当年生茎粗可达2~4mm,茎长50~120cm,侧枝位于主茎中上部,茎节间长2~5cm不等。
叶为互生羽状复叶,每个叶柄着生有叶片2~7个,叶片为卵圆型或倒卵圆型,最大的叶片长轴5cm,短轴4cm左右。
叶腋中可产生新芽,发育成新枝。
花序腋生,含25~60个紫色小花。
播种当年不形成花蕾。
种子肾型,黄色和黄褐色,长2.0~2.5mm,千粒质量约为7.0~8.0g。
作为饲用植物,山羊豆不仅产量高,叶量丰富,而且营养物质,特别是粗蛋白质含量高。
一年干物质产量多在7.0~11.5t/hm2。
叶量一般占地上干物质重量的60.0%~70.0%(据作者对生长第一年茎叶比的测定,叶占地上风干物质总量的82.0%,茎只占18.0%)[7]。
干物质中粗蛋白质含量呈现蕾期为27.8%,始花期16.3%;相应时期干物质的可消化率分别为66.0%~71.0%和57.0%~61.0%[8]。
在100kg的东方山羊豆各类饲草中饲料单位的含量分别是:
青草中为20~24个,青贮饲料中21个,干草中78个,每个饲料单位中的可消化蛋白质为135~200g[9]。
饲用山羊豆所含生物碱胍仅占其干物质的0.14×10-5~0.4×10-3,因此无毒害作用[10]。
1.3本论文的研究方案和目的意义
本论文主要分为两个大部分,前面部分为山羊豆的扩种试验,后面部分主要是山羊豆的共生结瘤固氮特性的相关研究。
山羊豆的扩种试验是在山西省太原市境内进行的。
试验采用随机设计,分为4个品种处理,3个重复,一共12个小区,每个小区为5×2m2。
种子先进行发芽试验,发芽试验采用4种处理,分别为空白对照、机械处理、浓酸处理,温水处理,试验结果显示,机械处理后种子的发芽效果最好。
在山羊豆种子之前,为了保证有较高的成活率,把发芽后的种子在育苗盘里先进行育苗处理,然后移栽到试验田小区内。
在试验田小区内对植株的数据进行记录采集测定。
考查了山羊豆的物候期,山羊豆各个生理发育期的生理生态数性状,结果认为山羊豆在当地气候条件下,各个生理生态指标发育比较正常,在对生物生态性状数据调查并进行相关分析后,发现其植株根瘤菌数量和植株生物量具有相关性。
对山羊豆种植前后的土壤理化属性调查,结果发现种植过山羊豆的土壤氮含量得到显著提高,土壤有机质含量提高;山羊豆区域性气候适应性调查,抗逆性能测定结果认为,山羊豆气候适应性强,有较高的越夏率和越冬率,在当地环境下具有较高的抵抗病虫害能力。
通过本次山羊豆在山西的扩种试验,我们认为山羊豆适宜在山西的气候条件下种植推广。
本研究还对试验田内的山羊豆的共生结瘤固氮特性进行了调查研究,进行了根瘤采集,从中分离、纯化山羊豆根瘤菌。
并对山羊豆根瘤菌进行了理化特性分析、抗逆性能测定和分型鉴定。
从中筛选出5株菌株。
为了表达植株根瘤菌的固氮能力水平差异,寻求一种方便快捷的测定植物氮含量方法,绘制了植株叶片的SPAD值与植株氮含量的标准曲线,从而通过测定SPAD值反映根瘤菌固氮能力的水平。
进行半固体培养植株回接试验,回接试验采用半固体无氮处理植株培养,回接试验设置6个处理,空白对照和5个接菌处理,每个处理3次重复。
结果接菌植株侵染明显而空白对照植株根瘤无侵染,通过对试验植株进行SPAD值测定,并对接菌植株和空白对照植株的SPAD值进行比较分析,探讨菌株的固氮效果。
山羊豆是一种优质的牧草,同时也具有改良土壤和水土保持的生态功能,所以山羊豆在山西的扩种具有较高的生态经济价值。
山羊豆的生态功能主要表现在其固氮能力上,其固氮效果直接影响植株的生物量,而作为一种豆科植物,根瘤菌的作用是非常明显的,而选育出适宜当地的具有较高固氮能力的根瘤菌是山羊豆扩种能否成功的一个关键因子。
为此,我们在山羊豆扩种的同时,分离筛选出适宜本地接种应用的,具有较高固氮能力的山羊豆根瘤菌菌株,可以为将来山羊豆的扩种、推广种植提供菌源。
2试验材料与方法
2.1试验区概况
试验区位于山西省太原市。
试验区经度E112°34′,纬度N37°52′,海拔高度为800m。
气侯属暖温带大陆性季风气侯,在试验期间年平均气温约11.3℃,绝对最低气温-16.9~-24.3℃,绝对最高气温33.1~35.9℃,年降水量342mm,年日照时数2268h,无霜期200天。
试验地土壤数据:
土壤有机质含量为2.14%,全氮含量为0.18%,碱解氮含量为38.1mg/kg,有效磷含量为118.6mg/kg,有效钾含量为128.58mg/kg,pH为7.8。
2.2试验材料
试验种子全部引进于俄罗斯(瓦维洛夫全俄植物栽培研究所),实验品种列表如表1:
表1品种及其来源
Table1Varietyandorigin
品种编号
No.
来源地
Origin
1765
俄-阿迪格共和国
1779
俄-阿尔汉格尔斯克州
2168
俄-克拉斯诺达尔边疆区
2227
罗马尼亚
2.3田间试验方案设计
试验采用随机设计,分为3次重复,各试验地的小区面积为10m2(5×2m2)。
行间距为0.25m,小区间隔为0.40m。
土壤处理:
深翻土壤20~25cm,平整、作畦,并对土壤进行杂草除莠处理。
2.4调查项目及测定方法
2.4.1种子发芽试验
试验采用三种处理方法:
机械处理,热水处理和浓酸处理。
机械处理采用砂纸揉搓种子;热水处理为50℃恒温水浴30min;浓酸处理用98%浓H2SO4浸泡3min。
用未作任何处理的种子作为对照处理。
每种处理做完后,用蒸馏水冲洗3~5遍,放入垫有滤纸的培养皿,用蒸馏水浸泡,于25~28℃温箱内培养,每隔24小时,清水清洗培养皿内的种子,换水培养。
每天对种子萌发数(以胚根突破种皮为标准)和发芽数(以胚根突破种皮的长度达到种子本体长度的一半为标准)进行记录统计。
试验第二天计算萌发率,试验终期计算发芽率。
萌发率=第二天种子萌发数/试验种子总数;发芽率=发芽种子总数/试验种子总数。
2.4.2生物性状指标调查
于试验田小区中取不同山羊豆品种的完整植株样,每个品种每个小区随机选取10株,分别测量株高,分枝,茎粗,复叶数,茎叶重,根重,调查计数主根瘤数,侧根瘤数。
2.4.3物候期观测
在山羊豆移植试验田内,分别对山羊豆各个生理发育期进行记录。
记录山羊豆在试验期间内的播种期、出苗期、返青期、初花期、盛花期、结荚期、枯黄期。
2.4.4土壤肥力水平调查
全氮含量测定采用凯氏定氮法;有机质测定采用重铬酸钾容量法;有效磷测定采用0.5mol/LNaHCO3法;速效钾测定采用NH4OAc浸提,火焰光度法。
2.4.5区域气候性适应性研究
记录调查山羊豆在试验期间的越冬率和越夏率,越冬率为返青植株数和前一年越冬前植株数比值,越夏率为植株在夏季高温,高湿的气候条件下的前后比值。
抗逆性主要调查山羊豆的病害死亡植株数和虫害的植株数。
2结果与分析
2.1种子发芽试验
山羊豆种子硬实率高达50.0%~98.0%,相对发芽率较低,因种皮透水、透气差,在土壤中不能很好地吸水膨胀和萌发,不做种子处理时,50%~95%的种子不能正常发芽。
山羊豆种子的种皮比较坚韧,种子硬实细小,对于这样的植物种子,要进行栽培必须作一定得处理,来提高种子的萌发率和出芽率。
鉴于种皮比较坚硬的种子,一般采用浓酸处理和机械处理来破坏种皮,从而让种子能更好的吸收水分,利于种子的萌发。
本试验采用砂纸摩擦、酸蚀以及热水处理山羊豆种子,比较它们对山羊豆种子活力的影响以探索最佳的山羊豆种植前种子预处理方法,为提高山羊豆的种子发芽率提供依据。
图1是种子发芽试验的各种处理结果对照。
图1不同处理下山羊豆种子的萌发率和发芽率对照
Figure1Galegadifferenttreatmentoftheseedgerminationrateandgerminationrate
从上表中可以看出机械处理效果最好,萌发率和发芽率分别达到72.0%和84.6%,萌发率和发芽率最高。
而没有进行任何处理的种子的萌发率和发芽率都非常低,只有15.5%和29.8%。
效果非常显著,浓酸处理过后的种子萌发率也有一定得提高,萌发率和发芽率分别达到了44.6%和64.2%。
但是根据相关文献得知浓酸处理后的种子在生长发育过程中要受到一定得影响。
热水处理过的种子萌发率比较高,但是发芽率反而降低了,说明经过热水处理后,第二天的种子发芽率有明显的提高,但是第三天以后发芽的种子数量就降低了,主要原因就是热水处理后的种子经过一定时间后,温度就降低了,相应的种子吸水性也降低。
2.2生物性状指标调查
山羊豆作为一种优质牧草,较高的生物量是作为牧草的重要特征指标。
而其他的生物性状包括株高,分枝,茎粗复叶数是正常的生理发育指标,考查山羊豆这些指标可以表明山羊豆在引种过程中生理发育是否正常,并且也可以作为山羊豆引种的调查资料以供参考。
生长第3年后,于试验田小区中取不同山羊豆品种的完整健康的植株样,每个品种每个小区随机选取10株,分别调查测量株高,分枝,茎粗,复叶数,茎叶重,根重,调查计数主根瘤数,侧根瘤数。
调查结果如表2:
表2山羊豆生物性状调查表
Table2Galegaquestionnairebiologicaltraits
编号
No.
株高
Plants
high
分枝
Branch
茎粗
Diameter
复叶数
Leaf
number
茎叶重
Stem
Weight
根重
Root
weight
主根瘤数
Mainnodule
number
侧根瘤数
lateralnodules
number
1765
62.3
4.6
5.5
382.3
92.3
34.5
43.6
112.6
1779
80.2
5.3
8.5
425.6
270.5
42.9
159.7
283.5
2168
88.6
8.2
8.4
526.5
256.4
45.5
332.5
436.8
2227
95.5
6.8
10.2
826.2
325.1
57.8
186.4
421.3
表2的数据为每个小区10个植株样本的采集数据的平均值。
通过对试验田4个品种的生理性状的调查我们可以看出品种1765的各项指标的均值均低于其他3个品种,而作为牧草,生物性状指标是作为牧草质量的重要指标,1765品种各项指标较低的原因可能是品种的本身的问题,也有可能是该品种不适宜本地的土壤环境。
对山羊豆样本的地上生物量(茎叶重)和根瘤数(主根瘤数+侧根瘤数)进行了相关分析。
分析软件采用SPSS13.0。
分析结果如表3:
表3生物量和根瘤数的相关分析表
Table3Nodulebiomassandnumberofrelatedanalysis
均值
Mean
标准差
Std.
相关系数
R
地上生物量
261.1
117.98
0.972*
根瘤数
494.1
261.67
0.972*
*表示在0.05水平显著相关。
Correlationissignificantat0.05level(2-tailed)
通过对地上生物量和根瘤数的相关分析,可以看出地上生物量和根瘤数成显著相关。
2.3物候期观测
在一种植被引种评价中,通过对物候期的观测可以掌握引进植被的的生长规律,了解该植被的开花结实规律。
并且通过物候期的观测,我们可以清晰的了解植被在一定的地区内生长发育各时期的进展及其与当地环境条件的关系。
对植被的生长规律和当地环境条件的关系的分析,可以作为引种成效的重要参考依据,同时也对进一步的掌握植物的生理生态特征提供翔实的数据,从而对于育种的选择,品种的繁育,丰产的相应措施,已经制定管理的技术措施等提供必要的材料。
本试验通过对山羊豆种植后连续3年观测物候期,分别对山羊豆各个生理发育期进行记录。
记录山羊豆在试验期间内的播种期、出苗期、返青期、初花期、盛花期、结荚期、枯黄期。
调查结果如表4所示。
表4山羊豆物候期调查表
Table4ThesurveytableofGalegaphenophase
编号
No.
播种期
Sowing
返青期
Green
初花期
Earlyflowering
盛花期
Fullflowering
结荚期
Podding
成熟期
Mature
枯黄期
Wilting
1765
20060615
20061028
20070406
20070501
20070610
20070622
20070712
20071020
20080405
20080505
20080611
20080629
20080716
1779
20060615
20061121
20070416
20070508
20070625
20070630
20070730
20071125
20080421
20080512
20080630
20080705
20080728
2168
20060615
20061123
20070423
20070514
20070630
20070705
20070802
20071128
20080425
20080525
20080710
20080715
20080805
2227
20060615
20061128
20070421
20070516
20070630
20070705
20070805
20071128
20080422
20080520
20080708
20080715
20080805
从表4可以看出,2006年栽培的所有品种都没有开花结荚,由于所有的山羊豆品种都是在当年6月中旬移栽的,山羊豆生理发育比较慢,当年的幼苗生长缓慢,所以4个供试品种在2006年都没有完成其完整的生理生育期。
1765的生理期比其他3个品种都早10天左右,并且整个生理周期比其他短20天左右,说明这个品种生理发育比其他品种要快。
根据上面的生物性状调查可以发现1765品种各项指标相比其他品种都低。
表明该品种生理周期相对较短,生物性状指标相对较差。
2.5区域气候性适应性研究
2.5.1越冬率和越夏率的调查
植物的越冬率反映了植株在高寒的气候条件下的生存能力。
越夏率则表明植株在夏季高湿高温的环境下的生存状况,通过调查植物的越冬率和越夏率可以表明植株在当地的区域气候条件下的生长环境质量,从而反应植株对当地的区域气候的适应性。
在试验中,分别对实验田里的山羊豆各个品种进行了越冬率和越夏率的观测调查,调查观测结果见图2所示:
图2越冬率和越夏率的调查图
Figure2SurveyfigureoftheSummerratesandWinterrates
从上图中可以看出,供试的山羊豆品种在试验田内均具有90%左右的越冬率,95%左右的越夏率,品种间差异不大,主要说明供试山羊豆品种耐寒耐高温性能很好,同时也表明供试山羊豆都品种均能够很好的适应当地的气候条件。
2.5.2抗逆性分析
在试验过程中观察发现,夏天高温和高湿的条件下,不同品种的山羊豆都有不同程度的根部腐烂现象。
根据文献,根腐病原菌是山羊豆根部腐烂的主要因素。
另外不同的品种对病虫害的危害表现也不同,在春夏之际,1765,1779受蚜虫害较严重,而2168,2227受蚜虫害相对较轻。
2.6小结
2.6.1山羊豆在山西的扩种试验
通过对山羊豆的扩种试验研究,对山羊豆气候性适应性的调查,和抗逆性的观测,生理生物性状调查表明山羊豆作为质地优良牧草可以说,生长特性好,适应性强,而且考虑到生物多样性,可以作为一种生态作物来大面积种植。
山羊豆作为一种新型优良豆科牧草,在我国新疆,兰州,黑龙江均有引种种植成功报道。
与其他牧草资源相比,其利用历史不长,相应的研究亦有限。
根据已有的研究,结合我们在山西引种试验结果的观测,我们认为,山羊豆在山西的扩种试验是成功的。
不管作为生态植物还是作为优质牧草我们都可以大面积推广山羊豆在山西的种植栽培。
2.6.2山羊豆对土壤的影响
一种植被引种评价中,该植被对当地的生态环境的影响也是必须要考虑的重要因素。
在生态系统中,土壤是重要的环境因素,山羊豆作为一种豆科植物,它的根瘤固氮能力对土壤的培肥有很高的贡献。
种植过山羊豆的土壤氮含量得到显著提高,土壤腐殖质含量大幅增加,土壤有机质含量提高,土壤微生物环境也得到良好的改善。
同时山羊豆作为浅根系植物,山羊豆草地易形成结皮,有良好的水保作用。
2.6.3山羊豆水分利用和耗水性能的研究
山羊豆植株根系耗竭土壤深层水分的能力有限,利用山羊豆植株这一特性,可以有利于长期尺度下区域内土壤水分平衡的保持,以后可以考虑研究不同土壤层面的山羊豆水分利用情况,植株不同深度根系的水分利用,实际耗水量。
这样可以对推广种植山羊豆做出有力的贡献。
3山羊豆的共生结瘤固氮特性研究
3.1材料与方法
3.1.1山羊豆根瘤样品的采集
分别从12个试验小区内挖取新鲜的植株根部,轻轻抖掉土粒,放入黑色塑料袋。
带回实验室准备进行根瘤的采集。
3.1.2山羊豆根瘤菌的分离和纯化
3.1.2.1分离:
选取个大、粉红色的鲜瘤,冲洗掉泥土,分别标号放入灭菌器,先放95%的酒精内浸泡30秒,改换至0.1%升汞溶液中浸泡5分钟,再放无菌水中洗5-6次,取出一个根瘤,在用火焰灭过菌的载玻片上切成两半,用接种针挑去少许瘤子中间组织(红色)接入试管斜面划直线,或者用无菌镊子夹住半个瘤,切口面向培养基表面,从斜面上端,边挤边推送入管底部,取另一瘤用同样方法接入另一支试管,重复一次,试管标上编号。
从1765采集4株根瘤,分别编号为a1,a2,a3,a4。
从1779采集4株根瘤,分别编号为a5,a6,a7,a8。
从2168采集4株根瘤,分别编号为b1,b2,b3,b4。
从2227采集4株根瘤,分别编号为b5,b6,b7,b8。
把上述16支试管编号放入28~30℃培养室内培养观察2~3天。
然后挑选长好的菌落做进一步纯化。
试验中采用YMA培养基,培养基配方如下。
YMA培养基:
葡萄糖7g,甘油3mL,磷酸氢二钾0.5g,硫酸镁0.2g,氯化钠0.1g,氯化钙0.2g,酵母膏0.8g,微量元素液4mL,琼脂18~20g,蒸馏水1000mL。
3.1.2.2纯化:
先准备好带玻璃珠加水的无菌试管一支,从试管上长出的菌落上调一环入试管水中,在振荡器上震荡1分钟,使菌苔充分分散成菌悬液,取三个灭菌的培养皿,每皿先放1mL无菌水,然后取一环菌悬液在第一皿的水中来回划动,使菌进入无菌水中。
之后将接种环烧干后,从第一皿中挑一环菌液,接入第二皿,用同样的方法从第二皿中挑一环入第三皿。
如此得到三次稀释菌液,
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