显微镜直接计数法实验报告.docx

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显微镜直接计数法实验报告

显微镜直接计数法实验报告

　　篇一：

显微镜直接计数法实验报告

　　显微镜直接计数法

　　一、实验目的

　　1、明确血细胞计数板计数原理；

　　2、掌握使用血细胞计数板进行微生物计数的方法。

二、实验原理

　　利用血细胞计数板在显微镜下直接计数，是一种常用的微生物计数方法。

此法的优点是直观、快速。

　　该计数板（构造如图1所示），是一块特制的载玻片，其上由四条槽构成三个平台。

中间的平台又被一短横槽隔成两半，每一边的平台上各刻有一个方格网，每个方格网共分九个大方格，中间的大方格即为计数室，微生物的计数就在计数室中进行。

　　计数室的刻度一般有两种规格，一种是一个大方格分成16个中方格，而每个中方格又分成25个小方格；另一种是一个大方格分成25个中方格，而每个中方格又分成16个小方格。

所以无论是哪种规格的计数板，每一个大方格中的小方格数都是相同的即共有400个小格。

　　2

　　每一个大方格边长为1㎜，则每一大方格的面积为1㎜，盖上盖玻片后，载玻片与盖

　　3

　　玻片之间的高度为㎜，所以计数室的容积为㎜。

　　其计算方法如下：

　　设5个中方格中的总菌数为A，菌液稀释倍数为B1．16×25的计数板计算公式

　　细胞数/ml=×16×10000×B=32000AB个2．25×16的计数板计算公式

　　细胞数/ml=×25×10000×B=50000AB个三、实验器材

（1）菌悬液：

酵母菌悬液

（2）其他物品：

血球计数板，显微镜，盖玻片，无菌毛细管等。

四、实验步骤

　　1．稀释：

将酵母菌悬液进行适当稀释，菌液如不浓，可不必稀释。

（一般样品稀释度要求每小格内约有5—10个菌体为宜）

　　2．镜检计数室：

在加样前，先对计数板的计数室进行镜检。

若有污物，则需清洗后才能进行计数。

　　3．加样品：

将清洁干燥的血球计数板盖上盖玻片，再用无菌的细口滴管将稀释的酵母菌液由盖玻片边缘滴一小滴（不宜过多），使菌液沿缝隙靠毛细渗透作用自行进入计数室，静置5—10分钟即可计数。

　　4．显微镜计数：

将血球计数板置于显微镜载物台上，先用低倍镜找到计数室所在位置，然后换成高倍镜进行计数。

　　若选用25×16规格的计数板则每个计数室选5个中方格，可选4个角和中央的中格（即80个小格），若选用16×25规格的计数板，则数四个角：

左上、右上、左下、右下的四个中方格，（即100小格）中的菌体进行计数。

做好记录。

　　5．清洗血球计数板：

使用完毕后，将血球计数板清洗干净，干燥后归还。

　　五、实验原始过程记录血细胞计数板规格25×16

　　实验现象

（1）、在显微镜视野中可以清晰地看到血细胞计数板的构造，如实验原理所述一致；同时也观察到有少许污迹；

（2）、在盖玻片边缘滴一小滴菌悬液后，菌悬液迅速充满计数室，无气饱；

　　（3）、视野中清晰地看见有密密麻麻的白色小颗粒（形如鱼卵）、且有部分细胞正处于出芽生殖阶段，有的明显形成芽体。

　　（4）、逐渐稀释后，细胞在一侧变得十分密集，而另一侧比没稀释前稀疏许多，能够数出计数室内最小方格内的细胞数，各中格子中菌数如表1：

表1：

各中格中菌数记录与处理表

　　A表示五个中方格中的总菌数；B表示菌液稀释倍数。

　　六、结果与分析

（一）、实验结论与分析

　　1、1ml酵母菌悬液中约有57350000个酵母细胞；2、微生物的个体之小；

　　3、酵母主要以出芽生殖方式进行增殖，繁殖力强。

　　本实验经血细胞计数板计数得到1ml酵母菌悬液中酵母细胞个数只能是一个概数。

原因有许多，就计数板就存在着固有误差，不可避免；加之实验者在相对狭窄的显微镜视野中进行计数及所用的计数规则因人而异，误差更大。

误差来源及如何提高实验准确性详见注意事项与思考题回答。

（二）、注意事项：

　　1、加样切勿贪多，一般滴一滴即可（最多两滴），且计数室内不能产生气泡。

　　2、计数时，位于格线上的菌体一般只数上方和右边线上的。

如遇酵母出芽，芽体大小达到母细胞的一半时，即作两个菌体计数。

计数一个样品要从两个计数室中计得的值来计算样品的含菌量。

　　3、应在水龙头下用水柱冲洗清洗血球计数板，切勿用硬物洗刷，洗完后自行晾干或用吹风机吹干。

镜检，观察每小格内是否有残留菌体或其他沉淀物。

若不干净，则必须重复洗涤至干净为止。

（三）、思考题

　　1、据你体会，说明血细胞计数板计数的误差主要来自哪些方面？

应如何尽量减少误差、力求准确？

答：

　　A、系统误差：

Ⅰ、仪器不够准确与精密：

如计数板磨损致使刻度不均匀，显微镜镜头磨损等Ⅱ、细胞分布不均匀

　　B、偶然误差：

　　操作人员器材处理、使用不当，稀释不准确，细胞识别错误：

如盖玻片、吸管、计数板等不洁净；显微镜视野不明亮等

　　C、措施

　　系统误差可通过规范操作、提高熟练程度和校正仪器而避免或纠正，但细胞分布误差却难于彻底消除。

如下措施可以减少偶然误差：

（1）所用器材均应清洁干燥，计数板、盖玻片等的规格应符合要求或经过校正。

（2）所配制的酵母菌悬液浓度合适且便于稀释，做到等渗、新鲜、无杂质微粒。

（3）菌悬液要滴加适量，稀释倍数不宜太大，一般样稀释度要求每小格内约有5—10个菌体为宜。

　　（4）严格操作，在加上盖玻片后滴加菌悬液使其充满计数室，且须一次性充满，防止产生气泡，充入细胞菌液的量以不超过计数室台面与盖玻片之间的矩形边缘为宜。

　　（5）一定要调好显微镜，使能够清晰地观察到计数室的最小方格的刻线等。

（6）其他如同注意事项。

　　篇二：

微生物大小的测定及显微镜直接计数法

　　微生物学实验报告

　　题目：

微生物大小的测定及显微镜直接计数法姓名：

学号：

年级班级：

组别：

同组者：

时间：

　　目的要求

　　1．学习并掌握使用显微镜测微尺测定微生物大小的方法。

　　2．了解血球计数板的构造、明确其计数原理。

　　3．学习并掌握使用血球计数板测定微生物细胞或孢子数量的方法。

　　基本原理

　　l．测微尺的构造：

显微镜测微尺是由目镜测微尺和镜台接物测微尺组成目镜测微尺是一块圆形玻璃片，其中有精确的等分刻度，在5mm刻尺上分50份。

目镜测微尺每格实际代表的长度随使用接目镜和接物镜的放大倍数而改变，因此在使用前必须用镜台测微尺进行标定。

　　镜台测微尺为一专用的载玻片，中央有精确等分线将长为1mm的直线等分成100个小格，每格长10μm，专用于校正目镜测微尺。

　　2.球菌用直径表示大小；杆菌用宽和长来表示

　　图一：

测微尺的校正

　　3．显微直接计数法：

将小量待测样品悬浮液置于计菌器上，于显微镜下直接计数的一种简便、快速、直观的方法。

　　显微计数法适用于各种含单细胞菌体的纯培养悬浮液，如酵母、细菌、霉菌孢子等。

菌体较大的酵母菌或霉菌孢子可采用血球计数板，一般细菌则采用彼得罗夫·霍泽（PetrofHausser）细菌计数板或Hawksley计数板。

三种计数板的原理和部件相同，只是细菌计数板较薄，可以使用油镜观察。

而血球计数板较厚，不能使用油镜，计数板下部的细菌不易看清。

　　血球计数板是一块特制的厚型载玻片，载玻片上有4条槽而构成3个平台。

中间较宽的平台，被一短横槽分隔成两半，每个半边上面各有一个计数区。

计数区的刻度有两种：

一种是计数区（大方格）分为16个中方格，而每个中方格又分成25个小方格；另一种是一个计数区分成25个中方格，而每个中方格又分成16个小方格。

计数区由400个小方格组成。

每个大方格边长为1mm，其面积为lmm2，盖上盖玻片后，盖载玻片间的高度为，所以每个计数区的体积为。

使用血球计数板计数时，通常测定五个中方格的微生物数量，求其平均值，再乘以25或16，就得到一个大方格的总菌数，然后再换算成1毫升菌液中微生物的数量。

设5个中方格中的总菌数为A，菌液稀释倍数B，则：

　　A1mL菌液中的总菌数=5×25×104×B=5×104×A·B（25个中格）

　　A=5×16×104×B=×104×A·B（16个中格）

　　实验器材

　　1．菌种：

酿酒酵母（Saccharomycescerevisiae），枯草芽孢杆菌

　　2．仪器、材料：

显微镜、目镜测微尺、镜台测微尺、擦镜纸、香柏油、血球计数板、盖玻片、吸水纸、计数器、无菌滴管等。

　　操作步骤

　　1．微生物大小的测定。

（1）目镜测微尺的安装

　　把目镜的上透镜旋开，将目镜测微尺轻轻放在目镜的隔板上，使有刻度的一面朝下。

旋上目镜透镜，再将目镜插入镜筒内。

（2）校正目镜测微尺

　　将镜台测微尺放在显微镜的载物台上，使有刻度的一面朝上。

先用低倍镜观察，调焦距，待看清镜台测微尺的刻度后，转动目镜，使目镜测微尺的刻度与镜台测微尺的刻度相平行，利用推进器移动镜台测微尺，使两尺在某一区域内两线完全重合，然后分别数出两重合线之间镜台测微尺和目镜测微尺所占的格数（图

　　一）。

用同样的方法换成高倍镜和油镜进行校正，分别测出在高倍镜和油镜下两重合线之间两尺分别所占的格数。

　　由于已知镜台测微尺每格长10μm，根据下列公式即可分别计算出在不同放大倍数下，目镜测微尺每格所代表的长度。

　　两重合线间镜台测微尺格数×10目镜测微尺每格长度（μm）=两重合线间目镜测微尺格数

　　（3）菌体大小的测定

　　将镜台测微尺取下，换上细菌染色制片，先在低倍镜和高倍镜下找到目的物，然后在油镜下用目镜测微尺测量菌体的大小。

先量出菌体的长和宽占目镜测微尺的格数，再以目镜测微尺每格的长度计算出菌体的长和宽。

　　值得注意的是，和动植物一样，同一种群中的不同菌体细胞之间也存在个体差异，因此在测定每一种菌种细胞大小时应对多个细胞进行测量，然后计算取平均值。

　　2．显微镜计数。

（1）无菌生理盐水适当稀释制备酿酒酵母菌悬液。

（2）镜检血球计数板。

　　（3）加样品。

血球计数板盖上盖玻片，将酵母菌悬液摇匀，用无菌滴管吸取少许，从计数板平台两侧的沟槽内沿盖玻片的下边缘摘入一滴，利用表面张力沟槽中流出多余的菌悬液。

加样后静置5min，使细胞或孢子自然沉降。

　　（4）将加有样品的血球计数板置于显微镜载物台上，先用低倍镜找到计数室所在位置，然后换成高倍镜进行计数。

若发现菌液太浓或太稀，需重新调节稀释度后再计数。

一般样品稀释度要求每小格内有5~10个菌体为宜。

每个计数室选5个中格（可选4个角和中央的一个中格）中的菌体进行计数。

若有菌体位于格线上，则计数原则为计上不计下，计左不计右。

如遇酵母出芽，芽体大小达到母细

　　胞的一半时，即作为两个菌体计数。

计数一个样品要从两个计数室中计得的平均数值来计算样品的含菌量。

　　（5）清洗。

　　使用完毕后，将血球计数板及盖玻片进行清洗、干燥，放回盒中，以备下次使用。

　　实验结果

　　思考题

　　1．为什么更换不同放大倍数的目镜或物镜时，必须用镜台测微尺重新对目镜测微尺进行校正？

　　答：

因为在不同放大倍数的目镜或物镜下，目镜测微尺每格代表的长度会发生变化。

　　2．在不改变目镜和目镜测微尺，而改用不同放大倍数的物镜来测定同一细菌的大小时，其测定结果是否相同？

为什么？

　　答：

相同。

因为用不同的物镜时都重新校正目镜测微尺，目镜测微尺每格代表的长度可按照重新校正的数据计算。

　　3．哪些因素会造成血球计数板的计数误差，应如何避免？

　　答：

器材处理、使用不当，稀释不准确，细胞识别错误等因素所造成的误差；由于仪器（计数板、盖片、吸管等）不够准确与精密带来的误差；由于细胞分布不均匀等因素带来的细胞计数误差。

前两者可通过规范操作、提高熟练程度和校正仪器而避免或纠正；细胞分布误差可通过多次计数取平均值来减小。

　　篇三：

显微镜直接计数法

　　血球计数板计数法

　　利用血球计数板在显微镜下直接计数，是一种常用的微生物计数方法。

此法的优点是直观、快速。

将经过适当稀释的菌悬液（或孢子悬液）放在血球计数板载玻片与盖玻片之间的计数室中，在显微镜下

　　3

　　进行计数。

由于计数室的容积是一定的（㎜），所以可以根据在显微镜下观察到的微生物数目来换算成单位体积内的微生物总数目。

由于此法计得的是活菌体和死菌体的总和，故又称为总菌计数法。

　　血球计数板，通常是一块特制的载玻片，其上由四条槽构成三个平台。

中间的平台又被一短横槽隔成两半，每一边的平台上各刻有一个方格网，每个方格网共分九个大方格，中间的大方格即为计数室，微生物的计数就在计数室中进行。

　　计数室的刻度一般有两种规格，一种是一个大方格分成16个中方格，而每个中方格又分成25个小方格，共400小格；另一种是一个大方格分成25个中方格，而每个中方格又分成16个小方格，总共也是400小格。

所以无论是哪种规格的计数板，每一个大方格中的小方格数都是相同的。

　　2

　　每一个大方格边长为1㎜，则每一大方格的面积为1㎜，盖上盖玻片后，载玻片与盖玻片之间的高

　　3

　　度为㎜，所以计数室的容积为㎜。

其计算方法如下：

　　1．16×25的计数板计算公式

　　细胞数/ml=×400×1000×稀释倍数2．25×16的计数板计算公式

　　细胞数/ml=×400×1000×稀释倍数

　　器材酵母菌悬液，血球计数板，显微镜，盖玻片，无菌毛细管等。

操作步骤

　　1．稀释：

将酵母菌悬液进行适当稀释，菌液如不浓，可不必稀释。

　　2．镜检计数室：

在加样前，先对计数板的计数室进行镜检。

若有污物，则需清洗后才能进行计数。

3．加样品：

将清洁干燥的血球计数板盖上盖玻片，再用无菌的细口滴管将稀释的酵母菌液由盖玻片边缘滴一小滴（不宜过多），使菌液沿缝隙靠毛细渗透作用自行进入计数室，一般计数室均能充满菌液。

注意不可有气泡产生。

静置5—10分钟即可计数。

　　4．显微镜计数：

将血球计数板置于显微镜载物台上，先用低倍镜找到计数室所在位置，然后换成高倍镜进行计数。

在计数前若发现菌液太浓或太稀，需重新调节稀释度后再计数。

一般样品稀释度要求每小格内约有5—10个菌体为宜。

若选用25×16规格的计数板则每个计数室选5个中方格，可选4个角和中央的中格（即80个小格），若选用16×25规格的计数板，则数四个角：

左上、右上、左下、右下的四个中方格，（即100小格）中的菌体进行计数。

位于格线上的菌体一般只数上方和右边线上的。

如遇酵母出芽，芽体大小达到母细胞的一半时，即作两个菌体计数。

计数一个样品要从两个计数室中计得的值来计算样品的含菌量。

　　5．清洗血球计数板：

使用完毕后，将血球计数板在水笼头上用水柱冲洗，切勿用硬物洗刷，洗完后自行晾干或用吹风机吹干。

镜检，观察每小格内是否有残留菌体或其化沉淀物。

若不干净，则必须重复洗涤至干净为止。

　　实验报告

　　将结果记录于下表中。

A表示五个中方格中的总菌数；B表示菌液稀释倍数。