Chapter 3酶的提取与分离纯化.docx
- 文档编号:4872459
- 上传时间:2022-12-11
- 格式:DOCX
- 页数:18
- 大小:577.33KB
Chapter 3酶的提取与分离纯化.docx
《Chapter 3酶的提取与分离纯化.docx》由会员分享,可在线阅读,更多相关《Chapter 3酶的提取与分离纯化.docx(18页珍藏版)》请在冰豆网上搜索。
Chapter3酶的提取与分离纯化
Chapter3酶的分离与纯化
我们要研究或使用一种酶,首先要采用相关方法先得到它,因此酶的分离与纯化是酶的生产、应用及酶学性质研究的基础。
Section1酶制剂的制备过程
一个完整的酶制剂制备方案应该包括:
酶活力测定体系的建立、材料的选择、材料的预处理、酶的酶学性质初步研究、酶的分离与纯化、酶制剂的保存。
一、材料的选择
注意把握植物的季节性、微生物的生长期(对数生长期)和动物的生理状态等。
二、材料的预处理
(一)细胞破碎
上节课我们提到根据酶的分布,可将酶分为胞内酶和胞外酶。
若是胞外酶,就不存在细胞破碎的问题,但是胞外酶的种类很少,绝大多数酶都属于胞内酶。
要想获得胞内酶,就得先进行细胞破碎,使酶从细胞内释放出来,这样才能进一步进行酶的提取和分离纯化。
细胞破碎的方法很多,有机械破碎法、物理破碎法、化学破碎法和酶溶法。
在实际使用时,我们要根据细胞的特性和酶的特性选择适宜的方法,有时也可以联合采用2种或2种以上的方法,以达到细胞破碎的效果,而又不影响酶的活性。
1、机械破碎法
按照所用破碎机械的不同,又可以分为捣碎法、研磨法和匀浆法。
(1)捣碎法:
常用于动物内脏、植物叶芽等比较脆嫩的组织细胞的破碎,也可以用于微生物,特别是细菌的细胞破碎。
(2)研磨法:
常用于微生物和植物组织细胞的破碎。
(3)匀浆法:
常用于破碎易于分散、比较柔软、颗粒细小的组织细胞。
大块的组织或者细胞团需要先用组织捣碎机或研磨器械捣碎分散后才能进行匀浆。
2、物理破碎法
根据物理力的不同,可分为冻融法、渗透压法和超声波破碎法。
(1)冻融法:
适用于易于破碎的细胞,如革兰氏阴性菌。
如将-20℃冷冻的细胞突然放进沸水浴中,或沸水浴中的热细胞突然放进-70℃冷冻,这样都可以使细胞破坏。
但是,在酶的提取时,要注意不能在过高的温度下操作,以免引起酶的变性失活。
(2)渗透压法:
适用于易于破碎的细胞,如动物细胞或革兰氏阴性菌。
使用时,先将细胞分离出来,悬浮在高渗透压的溶液中,平衡一段时间后,将细胞迅速转入低渗透压的蒸馏水或缓冲溶液中,由于渗透压的作用而使细胞破碎。
(3)超声波破碎法:
适用于多数微生物的破碎。
超声波破碎法操作过程中产生大量的热,因此操作需在冷库中进行,或将样品置于冰浴中,并采用问歇操作,如破碎30~60s,间歇1min,如此反复进行。
3、化学破碎法
常用的化学试剂有:
①有机试剂(甲苯、丙酮、丁醇、氯仿等);②表面活性剂(Tween、特里顿(Triton)等);③螯合剂(EDTA:
乙二胺四乙酸)等。
他们都可以增加细胞膜的通透性,是酶容易释放。
4、酶溶法
最常用的酶溶剂为溶菌酶,适用于革兰氏阳性菌细胞壁的分解;应用于革兰氏阴性菌时,需附加EDTA作为助溶剂。
(二)防止蛋白酶的水解作用
预防的措施是加入蛋白酶抑制剂。
常用的丝氨酸蛋白酶抑制剂有苯甲基磺酰氟(PMSF)、二异丙基氟磷酸;金属蛋白酶抑制剂有EDTA和EGTA(乙二醇四乙酸)
(三)除核酸
一般微生物和植物的粗酶液中有大量的核酸污染。
除核酸的常用方法是沉淀法,沉淀剂的选择需要大量的试验来选定,已知的有1%~2%的链霉素硫酸盐、PEG、溶菌酶等。
三、初步探索酶的特性
经过上述过程获得粗酶液后,为了制订合适的纯化方法,我们应先通过试验探索酶以下几方面的性质:
等电点(IEF-PAGE)、分子量(SDS-PAGE,聚丙烯酰胺凝胶电泳)、稳定性(温度和pH的稳定性)、动力学常数(对底物、激活剂和抑制剂的动力学常数)等。
四、制定酶的分离程序
酶的纯化方法很多,具体采用哪种方法,一般来说,应该考虑以下几点:
(一)首先分析目标酶是否有极端条件的不寻常稳定性、分子量特大或特小等特性;
(二)尽早使用选择性好的方法:
如亲和层析、高效液相色谱分析等;
(三)第一步层析选用交换能力高的层析技术:
这样所用层析材料体积小,洗脱体积也小,有利于后续的操作;
(四)在造成酶被稀释的步骤后面要紧接着用一个酶浓缩的方法;
(五)每步纯化过程,通过酶活力和蛋白浓度的测定,监测纯化的效率。
为了判断一个分离纯化方法的优劣,常采用回收率(反应酶的损失情况)和纯化倍数(反应方法的有效程度)两个指标。
一个好的方法,应该回收率较高,纯化倍数也较大。
五、酶的纯度检验
常用的方法是SDS-PAGE法。
单一条带,表示达到了电泳纯。
注意的是,当酶由不同亚基组成时,会出现多条条带。
Section2酶的提取与分离
一、酶的提取
(一)常用方法:
盐溶液提取、酸溶液提取、碱溶液提取和有机溶剂提取。
(1)盐溶液提取:
适用于大多数酶。
盐溶现象:
大多数P酶在低浓度的盐存在的条件下,酶的溶解度随盐浓度的升高而增加。
盐析现象:
在盐浓度达到某一界限后,酶的溶解度随盐浓度升高而降低。
(2)酸、碱溶液提取:
适用于在酸(碱)性条件下溶解度较大且稳定性较好的酶。
为避免酶变性失活,pH3~6(pH10~12.5)有利于酶的提取。
同时加酸(碱)液的过程,要一边搅拌一边缓慢加进,以免出现局部过酸(碱)现象,而引起酶的变性失活。
(3)有机溶剂提取:
适用于与脂质结合牢固或含有较多非极性基团的酶。
常用有机溶剂有乙醇、丙酮、丁醇等。
(二)影响酶提取的主要因素
(1)酶在所使用溶剂中的溶解度;
(2)酶向溶剂扩散的速度:
酶向溶剂扩散的速度与温度(↗)、黏度(↘)、扩散面积(↗)、扩散距离(↘)及两相间的浓度差(↗)有密切关系;
(3)温度:
在不影响酶活性的条件下,适当提高温度,有利于酶的提取。
适当提高温度,可以提高酶的溶解度,也可以增大酶分子的扩散速度,但是温度过高,易引起酶的变性失活,所以提取时温度不宜过高。
(4)pH值:
提取时,溶液的pH值不宜过高或过低,以免引起酶的变性失活,并避开酶的等电点。
当pH值等于某酶的等电点时,酶分子的溶解度最小。
(5)提取液的体积:
增加提取液的用量,可以提高酶的提取率。
但是过量的提取液,会使酶的浓度降低,对进一步的分离纯化不利。
因此,控制提取液的总量一般为原料体积的3~5倍。
二、酶的分离
常用的酶分离方法有沉淀法、层析法、电泳法、离心法、过滤和膜分离法、萃取法等。
(一)沉淀法:
通过改变某些条件或添加某种物质,使酶在溶液中的溶解度降低,从溶液中沉淀析出,而与其他溶质分离的技术过程。
包括盐析法、等电点沉淀法、有机溶剂沉淀法、复合沉淀法、热处理沉淀法等。
1、盐析法
利用不同蛋白质在不同的盐浓度条件下溶解度不同的特性,在酶液中添加一定浓度的中性盐,使酶或杂质从溶液中析出,从而使酶与杂质分离的过程。
主要用于蛋白类酶的分离纯化。
通常采用的中性盐有硫酸铵、硫酸钠、硫酸钾、硫酸镁、氯化钠和磷酸钠等。
硫酸铵是最常用的盐,这是由于硫酸铵在水中的溶解度大,且受温度影响小(如在25℃时,其溶解度为767g/L;在0℃时,其溶解度为697g/L),不影响酶的活性,分离效果好且价廉易得。
但是硫酸铵溶液的缓冲能力差,且铵离子的存在往往会干扰蛋白质的测定,所以有时也用其他中性盐进行盐析。
由于不同的酶有不同的结构,盐析时所需的盐浓度各不相同;此外,酶的来源、酶的浓度、杂质的成分等对盐析时所需的盐浓度亦有所影响。
在实际应用时,可以根据具体情况,通过试验确定。
经过盐析得到的酶沉淀,含有大量盐分,一般可以采用透析、超滤或层析等方法进行脱盐处理,使酶进一步纯化。
盐析法的优点是简便、安全、重现性好;缺点是分辨率低、纯度提高不明显。
2、等电点沉淀法
利用两性电解质在等电点时溶解度最低,及不同两性电解质的等电点不同这一特性,通过调节溶液的pH值,使酶或杂质沉淀析出,从而使酶与杂质分离的方法。
在溶液的pH值等于溶液中某两性电解质的等电点时,该两性电解质分子的净电荷为零,分子间的静电斥力消除,使分子能聚集在一起而沉淀下来。
因此可以通过调节介质的pH,把目的酶和杂蛋白分开。
但由于蛋白质在pI点附件一定范围的pH内都可发生沉淀,只是沉淀的程度很不一样,而且相当多的蛋白质的pI点很靠近,所以该法的回收率和纯化倍数都不理想,一般只用于酶的粗分离阶段。
3、有机溶剂沉淀法
利用酶与其他杂质在有机溶剂中的溶解度不同,而使酶或杂质沉淀析出,从而使酶与杂质分离的方法。
有机溶剂之所以能使酶沉淀析出,主要是由于有机溶剂的存在会使溶液的介电常数降低。
例如,20℃时水的介电常数为80,而82%乙醇水溶液的介电常数为40。
溶液的介电常数降低,就使溶质分子间的静电引力增大,互相吸引而易于凝集,同时,对于具有水膜的分子来说,有机溶剂与水互相作用,使溶质分子表面的水膜破坏,也使其溶解度降低而沉淀析出。
常用的有机溶剂有乙醇、丙酮、异丙醇、甲醇等。
有机溶剂的用量一般为酶液体积的2倍左右,且使用时受pH、离子强度的影响,一般应将酶液的pH值调到欲分离酶的等电点附近。
该法的优点是,析出的酶沉淀一般比盐析法析出的沉淀易于离心或过滤分离;不含无机盐,常用于食品工业酶制剂的制备;分辨率比盐析法好,而且有机溶剂易于除去或回收。
缺点是,容易引起酶的变性失活,须在低温条件下操作,而且沉淀析出后要尽快分离,尽量减少有机溶剂对酶活力的影响。
4、复合沉淀法(共沉淀法)
利用离子型表面活性剂、非离子型聚合物在一定条件下能与蛋白质直接或间接地形成络合物,使酶沉淀析出,然后再用适当方法使需要的酶溶解出来,除去杂蛋白和沉淀剂,从而达到纯化目的的方法。
常用的复合沉淀剂有单宁、聚丙烯酸、PEG(PEG4000、PEG6000)、SDS等高分子聚合物。
如以单宁作为复合沉淀剂时,先将酶液的pH调到4~7,加入适量的单宁(一般为酶液的0.1%~1%),生成酶-单宁复合物沉淀。
酶-单宁复合物可以直接应用于制药行业,如菠萝蛋白酶用单宁沉淀法得到的单宁-菠萝蛋白酶复合物可以直接作为药品,用于治疗咽喉炎。
如果要进一步纯化,可将酶-单宁复合物沉淀分离出来后,用乙醇或丙酮处理以除去单宁;也可以用pH8~11的碘酸钠或硼酸钠使酶溶解出来;还可以采用吐温、PEG或PVP(聚乙烯氮戊环酮)等大分子进行复分解反应,使酶游离出来。
单宁复合沉淀剂主要适用于蛋白酶、淀粉酶、糖化酶、果胶酶、纤维素酶等的沉淀分离。
再如用聚丙烯酸作为复合沉淀剂时,先将酶液的pH调3~5,加入适量的聚丙烯酸(一般为酶液的30%~40%),生成酶-聚丙烯酸沉淀。
将沉淀分离出来后,用稀碱液调节pH值至6以上,酶与丙烯酸分开,再加入一定量的Ca2+、Mg2+、Al3+等金属离子,聚丙烯酸反应生成聚丙烯酸盐沉淀,而使酶游离出来。
5、热处理沉淀法
因为大部分酶都易热变性,对于一个热稳定性好的酶,如α-淀粉酶、酵母醇脱氢酶、铜锌超氧化物歧化酶等,可以通过加热进行热处理,使大多数杂蛋白受热变性沉淀而被除去。
这种方法提纯效果好,但是操作过程要十分小心,要搅拌良好,防止局部过热,一般用比变性温度高10℃的水浴迅速升温,在变性温度下保持一定时间后,用冰迅速冷却,而且在操作之前,必须对欲分离的酶及酶液中的杂蛋白等杂质的种类、含量及其物理、化学性质有比较全面的了解。
(二)离心法
离心是借助于离心机旋转所产生的离心力,使不同大小、不同密度的物质分离的技术。
在采用离心法进行分离时,我们要根据欲分离物质以及杂质的颗粒大小、密度和特性的不同,选择适当的离心机、离心方法和离心条件。
1、离心机的选择
离心机多种多样,按分离形式可分为沉降式和过滤式;按操作方式有间歇、连续和半连续之分;按照用途有分析用、制备用、分析一制备两用之别;按照离心机的结构特点有管式、吊篮式、转鼓式、碟式等多种;通常按照离心机的最大转速,可分为常速(低速)离心机、高速离心机和超速离心机3种。
(1)常速离心机(低速离心机):
主要用于培养基残渣和细胞碎片等固形物的分离,也用于酶的结晶等较大颗粒的分离。
(2)高速离心机:
主要用于细胞碎片和细胞器等的分离。
(3)超速离心机:
主要用于DNA、RNA、蛋白质等生物大分子以及细胞器、病毒等的分离纯化;样品纯度的检测;沉降系数和相对分子质量的测定等。
2、离心方法的选择
对于常速离心机和高速离心机来讲呢,由于他们所分离的颗粒的大小和密度都相差较大,因此只要选择好了离心速度和离心时间,就能达到理想的分离效果;因此,离心方法的选择主要是针对超速离心。
超速离心法根据各自不同的特性又可以分为差速离心法、密度梯度离心法或等密梯度离心法。
(1)差速离心法:
采用不同的离心速度和离心时间,使不同沉降速度的颗粒分批分离的方法,主要用于分离大小和密度相差较大的颗粒。
。
差速离心法的操作流程呢,是先将均匀的悬浮液装进离心管,选择好离心速度和离心时间,使大颗粒首先沉降;然后将上清液在加大离心力的条件下进行离心,分离出较小的颗粒;如此离心多次,使不同沉降速度的颗粒分批分离出来。
差速离心法的优点呢,是操作简单、方便;缺点呢,是分离效果差,目的酶中含有较多杂质;目的酶沉降在离心管底部,相互之间受到挤压,破坏蛋白质的原始结构。
(2)密度梯度离心:
将样品在密度梯度介质中进行离心,使沉降系数比较接近的物质进行分离的一种区带分离方法。
密度梯度介质的特性对密度梯度离心的效果影响很大。
梯度介质应具有足够大的溶解度,不与样品中的组分发生反应,不会引起样品组分的凝集、变性或失活。
常用的梯度介质是5%~60%的蔗糖密度梯度系统。
密度梯度一般采用密度梯度混合器进行制备。
密度梯度混合器由贮液室、混合室、电磁搅拌器和阀门等组成,配制时,将稀溶液置于贮液室,浓溶液置于混合室,两室的液面必须在同一水平,首先开动搅拌器,然后同时打开阀门,流出的梯度液经过导管小心地收集在离心管中,即制备得到的密度梯度介质。
一般来说,密度梯度介质可以分为线性梯度、凸形梯度和凹形梯度等。
当贮液室与混合室的截面积相等时,形成线性梯度;当贮液室的截面积大于混合室的截面积时,形成凸形梯度;而当贮液室的截面积小于混合室的截面积时,则形成凹形梯度;常用的密度梯度介质是线性梯度。
离心前,将样品小心地铺放在预先制备好的密度梯度溶液的表面,经过离心,不同大小、不同形状、具有一定沉降系数差异的颗粒在密度梯度溶液中形成若干条界面清楚的不连续区带。
再通过虹吸、穿刺或切割离心管的方法将不同区带中的颗粒分开收集,得到所需的物质。
(3)等密梯度离心法:
当欲分离物的密度处于离心介质的密度范围内,在离心力的作用下,不同密度的颗粒向下沉降或向上飘浮,足够时间后,在各自等密度点形成区带的分离方法。
操作流程是:
先把一定浓度的离心介质溶液与样品液混合均匀,在适当离心力下作用足够时间,离心介质在离心力场中沉降,自动形成密度梯度;样品中不同浮力密度的颗粒在其各自的等密度点位置上形成区带。
常用的离心介质是铯盐,如氯化铯、硫酸铯、溴化铯等。
除了上述我们所提到的离心机的种类、离心方法、离心介质、密度梯度等可能会影响离心的效率外,离心力、离心时间、离心介质的pH值和温度等离心条件也是很重要的参数。
因此,我们接下来学习离心条件的确定。
3、离心条件的确定
(1)RCF:
对于离心条件的确定呢,我们首先要考虑的就是RCF。
在低速离心的时候,我们一般不用RCF来表示,但是在高速离心和超速离心时,一般只用相对离心力(RCF)。
RCF指颗粒所受到的离心力与地心引力之比。
n2指的是转速的平方,r指的是旋转半径。
由此,我们可知道,在转速一定的条件下,颗粒距离轴心越远,离心力就越大。
(2)离心时间的概念,依据离心方法的不同而有所差别。
对于常速离心、高速离心和差速离心来说,离心时间是指颗粒从离心管中样品液的液面完全沉降到离心管底的时间,称为沉降时间或澄清时间;
对于密度梯度离心而言,离心时间是指形成界限分明的区带的时间,称为区带形成时间;
对于等密梯度离心来说,离心时间是指颗粒完全达到等密度点的平衡时间,称为平衡时间。
沉降时间决定于颗粒的沉降速度和沉降距离。
操作时,采用较高的转速离心较短的时间,或采用较低的转速离心较长的时间,可以得到相同的离心效果。
(3)在离心的过程中,为了防止欲分离物质的凝集、变性和失活,除了在离心介质的选择方面加以注意以外,还必须控制好温度和pH值。
离心温度一般控制在4℃左右,对于某些耐热性较好的酶,也可以在室温条件下进行离心分离。
但是在超速离心和高速离心时,必须采用冷冻系统,这是为了避免由于转子在高速旋转时发热而引起温度过高。
离心介质的pH值必须是处于酶稳定的pH值范围内。
过高或过低的pH值可能会引起酶的变性失活,还可能引起转子和离心机其他部件的腐蚀。
(三)过滤
接下来我们来学习第三种分离技术:
过滤。
过滤呢,指的是借助于过滤介质将不同大小、不同形状的物质分离的技术过程。
常用的过滤介质有滤纸、滤布、纤维、多孔陶瓷、烧结金属和各种高分子膜。
根据过滤介质的不同,过滤可以分为非膜过滤和膜分离技术。
非膜过滤,指的是采用滤纸、滤布、纤维、多孔陶瓷、烧结金属等高分子膜以外的材料作为过滤介质的分离技术,包括粗滤和微孔过滤。
膜分离技术,指的是借助于一定孔径的由丙烯腈、醋酸纤维素、赛璐玢、尼龙等高分子聚合物制成的高分子薄膜,选择性地让小于其孔径的分子通过,而把大于其孔径的分子截留的技术。
掌握了过滤的宏观分类后,我们分别对非膜过滤和膜分离技术进行学习。
前面我们介绍了,非膜过滤包括粗滤和微孔过滤。
1、非膜过滤
(1)粗滤,指的是借助于过滤介质截留悬浮液中直径大于2μm的大颗粒,使固形物与液体分离的技术。
主要用于分离酵母,霉菌,动、植物细胞,培养基残渣。
(2)微孔过滤,指的是采用过滤介质截留直径为0.2~2μm的物质颗粒的技术,主要用于细菌、灰尘等光学显微镜可以看到的物质颗粒的分离。
在无菌水、矿泉水、汽水等软饮料的生产中广泛应用。
根据推动力的不同,粗滤可分为常压过滤、加压过滤、减压过滤。
①常压过滤的推动力是液位差,如滤纸过滤。
过滤装置竖直安装,悬浮液置于过滤介质的上方,由于存在液位差,在重力的作用下,滤出液通过过滤介质从下方流出,大颗粒的物质被截留在介质表面,从而达到分离。
常压过滤的优点是:
设备简单,操作方便易行;缺点是:
过滤速度较慢,分离效果较差,难于大规模连续使用。
②加压过滤的推动力是压力泵或压缩空气产生的压力,如生产中常用的各式压滤机。
加压过滤,设备简单,过滤速度较快,过滤效果好,在生产中广泛应用。
③减压过滤(真空过滤或抽滤),指的是通过在过滤介质的下方抽真空,以增加过滤介质上下方之间的压力差,推动液体通过过滤介质,而把大颗粒截留的过滤方法,如抽滤瓶。
减压过滤多用于黏性不大的物料的过滤。
2、膜分离技术
根据推动力的不同,膜分离技术可以分为加压膜分离、电场膜分离和扩散膜分离。
(1)加压膜分离的推动力为静压差。
在薄膜两边流体的静压差的作用下,小于孔径的物质颗粒穿过膜孔,大于孔径的颗粒被截留。
根据所截留的物质颗粒的大小不同,加压膜分离可分为微滤、超滤和反渗透。
(2)电场膜分离的推动力为电场。
在半透膜的两侧分别装上正、负电极,在电场的作用下,小分子的带电物质向着与其本身所带电荷相反的电极移动,透过半透膜,而达到分离的目的,如电渗析和离子交换膜电渗析。
(3)扩散膜分离的推动力为扩散作用。
小分子物质利用扩散作用,不断透过半透膜扩散到膜外,而大分子被截留,从而达到分离的效果,如透析。
对于加压膜分离,我们来分为学习一下微滤、超滤和反渗透。
①微滤:
以微滤膜为过滤介质,截留的颗粒直径为0.2~2μm。
如无菌室和生物反应器的空气过滤,热敏性药物和营养物质的过滤除菌。
②超滤:
以超滤膜为过滤介质,截留的颗粒直径为20~2000Å,主要用于分离病毒和各种生物大分子。
对于超滤来说,流率是个很重要的概念。
流率指的是每平方厘米的膜每分钟透过流体的量。
膜孔径的大小、颗粒的形状与大小、溶液浓度、操作压力、温度等对流率有显著影响。
这里要特别强调的是,操作压力对流率的影响比较复杂。
一般情况下,压力增加,流率也增加;但是对于一些胶体溶液,当压力高到一定程度后,再增加压力,流率不再增加;对于一般溶质分子而言,压力增加时,其透过性降低,但是某些溶质分子可以随着压力增加而提高透过性,因此操作压力要通过试验来妥善选择。
超滤技术不仅可用于酶的分离纯化,同时还可用于酶液的浓缩。
③反渗透:
以反渗透膜为过滤介质,截留的颗粒直径小于20Å,主要用于分离各种离子和小分子物质。
在无离子水的制备、海水淡化等方面广泛应用。
电场膜分离的方法主要有电渗析和离子交换膜电渗析。
①电渗析:
主要用于溶液脱盐、海水淡化、纯水制备。
其操作流程是:
用两块半透膜将透析槽分隔成3个室,在两块膜之间的中心室通入待分离的混合溶液,在两侧室中装入水或缓冲液并分别接上正、负电极,接正电极的称为阳极槽,接负电极的称为阴极槽。
接通直流电源后,中心室溶液中的阳离子向负极移动,透过半透膜到达阴极槽,而阴离子则向正极移动,透过半透膜移向阳极槽,大于半透膜孔径的物质分子则被截留在中心室中,从而达到分离。
②离子交换膜电渗析:
用离子交换膜代替一般的半透膜。
主要用于脱盐,海水淡化,纯水制备,从发酵液中分离柠檬酸、谷氨酸等带电荷的小分子发酵产物,凝胶电洗脱等。
离子交换膜上带有某些基团,因此其既具有截留大于孔径的颗粒的特性,又可以根据同性电荷相斥、异性电荷相吸的原理,只让带异性电荷的颗粒透过,而把带同性电荷的物质截留,所以离子交换膜电渗析的选择透过性比电渗析强。
(3)对于扩散膜分离,最重要的方法就是透析。
透析主要用于酶和其他生物大分子的分离纯化,从中除去无机盐等小分子物质。
透析膜可用动物膜、羊皮纸、火棉胶或赛璐玢等制成。
操作流程为:
将欲分离的混合液装在透析膜内侧,外侧是水或缓冲液,在一定的温度下,透析一段时间,使小分子物质从膜的内侧透出到膜的外侧。
必要时,膜外侧的水或缓冲液可以连续更换。
透析的优点是设备简单、操作容易。
缺点是透析时间较长,透析结束时,透析膜内侧的保留液体积较大,浓度较低,难于工业化生产。
Polysaccharide多聚糖colloids胶体,胶质particulate微粒状物质
(四)层析分离
1、层析法的起源
层析法也称色谱法,是1903年俄国植物学家MichaelTswett发现并命名的。
将植物色素溶液通过装有CaCO3吸附剂的柱子,然后用石油醚淋洗,各种色素以不同的速率流动后形成不同的色带而被分开。
2、层析法的基本原理是利用混合液中各组分的物理、化学性质(分子的大小和形状、分子极性、吸附力、分子亲和力、分配系数等)的不同,使各组分在流动相和固定相中的分布程度不同,并以不同的速度移动而达到分离的目的。
层析分离设备简单、操作方便,在实验室和工业化生产中均广泛应用。
3、层析法的分类
按层析机理分为:
吸附层析、分配层析、离子交换层析、凝胶层析和亲和层析。
按操作形式分为:
柱层析、纸层析和薄层层析。
4、吸附层析
(1)吸附层析的原理:
利用吸附剂对不同物质的吸附力不同而使混合物中各组分分离的方法,是各种层析技术中应用最早的技术。
由于吸附剂来源丰富、价格低廉、可以再生,吸附设备简单,至今仍在实验室和工业生产中广泛使用。
(2)吸附层析的操作流程:
层析时,将欲分离的混合溶液自柱顶加入,当样品液全部进入吸附层析柱后,加入洗脱剂进行洗脱;洗脱时,被吸附在吸附剂上的物质在洗脱剂的作用下解吸而随溶液向下移动,又遇到新的吸附剂,被重新吸附,后面流下的洗脱液再把它解吸而向下流动,然后再被下层的吸附剂吸附。
如此反复,经过一段时间后,不同的物质在吸附柱内形成各自的区带,将被吸附的物质从层析柱中洗脱出来,分步收集后,分别进行定性、定量检测。
以洗脱液体积对被洗脱组分浓度作图,可以得到洗脱曲线。
(3)洗脱方法
吸附层析的洗脱方法主要有3种,溶剂洗脱法、置换洗脱法和前缘洗脱法。
①溶剂洗脱法:
是目前应用最广泛
- 配套讲稿:
如PPT文件的首页显示word图标,表示该PPT已包含配套word讲稿。双击word图标可打开word文档。
- 特殊限制:
部分文档作品中含有的国旗、国徽等图片,仅作为作品整体效果示例展示,禁止商用。设计者仅对作品中独创性部分享有著作权。
- 关 键 词:
- Chapter 酶的提取与分离纯化 提取 分离 纯化