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土壤微生物数量测定方法整理
土壤微生物的分离鉴定及数量测定
(一)培养基的制备
Ⅰ测定微生物总量培养基:
1.细菌培养基(牛肉膏蛋白胨琼脂培养基)
牛肉膏Beefextract5.0g
蛋白胨Peptone10.0g
NaCI5.0g
蒸馏水H201000m1
琼脂15~20g
PH7.2~7.4
制备步骤:
⑴在100mL小烧杯中称取牛肉膏5.0g,蛋白胨10.0g,加50mL蒸馏水,置电炉搅拌加热至牛肉膏,蛋白胨完全溶解.
⑵向小铝锅中加入500mL蒸馏水,将溶解的牛肉膏,蛋白胨倒入铝锅中并用自来水洗2~3次.加入5.0gNaC1,在电炉上边加热边搅拌.
⑶加入洗净的琼脂条,继续搅拌,加热至琼脂完全熔化,补足水量至1000mL.
⑷用NaOH或HC1调至pH7.0.用酸度计或用玻棒沾少许液体用精密pH试纸测定其pH值,并用10%NaOH调至所需pH值,必要时用滤纸或脱脂棉过滤。
一般比要求的pH高出0.2,因为高压蒸汽灭菌后,pH常降低。
⑸根据不同需要,可将配好的培养基分装入配有棉塞的试管或三角瓶。
注意分装时避免培养基挂在瓶口或管口上引起杂菌污染。
如液体培养基,应装试管高度的1/4左右;固体培养基装试管高度的1/5左右;装入三角瓶的量以三角瓶容量的一半为限。
,塞好棉塞,装入小铁丝筐,然后用旧报纸将棉塞部分包好.标签表明培养基的名称、配制日期等。
⑹高压蒸汽灭菌,用0.1Mpa(15lb/in2)121℃灭菌(15-20)30min.
2.放线菌培养基(改良高氏1号琼脂培养基)
可溶性淀粉20g
KNO31g
K2HPO40.5g
MgSO4•7H2O0.5g
NaCl0.5g原0.05g
FeSO4•7H2O0.01g
pH7.2-7.4
制备步骤:
(1)计算根据配方计算各种药品所需要的量,然后再分别称量。
(2)称量准确称量各种成分。
(3)溶化配制时,先用少量冷水将淀粉调成糊状,倒入少许沸水中,在火上加热,边搅拌边依次逐一溶化其他成分,溶化后,补足水分到1000ml,调PH(可不调)。
(4)分装、包扎、灭菌。
注:
各成分按配方顺序依次溶解,对于微量成分,可预先配成高浓度的溶液,方便配置时量的控制。
配制时,先用少量冷水,将淀粉调成糊状,倒入少于所需水量的沸水中,在火上加热,边搅拌边依次逐一溶化其他成分,溶化后,补足水分到1000ml,调pH。
另:
倒平板之前,在溶化的培养基中加重铬酸钾溶液,每300mL培养基加3%重铬酸钾1mL(l00ppm)。
3.真菌培养基(马丁(Martin)-孟加拉红琼脂培养基)
葡萄糖10.0g
MgSO4.7H2O0.5g
蛋白胨5.0g
孟加拉红33.4mg(或者每升加1%溶液3.3mL)
K2HPO41g
蒸馏水H201000m1
PH自然(4-5)
制备步骤:
(1)计算根据配方计算各种药品所需要的量,然后再分别称量。
(2)称量和熔化按培养基配方,准确称取各成分,并将各成分依次溶化在少于所需要的水量中待各成分完全溶化后,边加边搅拌,以防糊底,补足水分到所需体积。
再将孟加拉红配成1%的溶液,在1000ml培养液中加入1%的孟加拉红溶液3.3ml,混匀后,加入琼脂加热溶化。
(3)分装、加塞、包扎、灭菌。
(4)链霉素的加入由于链霉素受热易分解,所以临用时将培养基溶化后待温度降低至45摄氏度左右时才能加入。
注:
⑴灭菌前加卡那霉素20μg/ml,或者倒平板之前加链霉素。
⑵倒平板之前加乳酸,每100mL培养基加0.lmL。
Ⅱ测定功能菌所用培养基:
1.亚硝酸细菌培养基(改良的斯蒂芬逊(Stephenson)培养基A)
(NH4)2SO42.0g
NaH2PO40.25g
MnSO4·4H2O0.01g
MgSO4·7H2O0.03g
K2HPO40.75g
CaCO35.0g
蒸馏水1000ml
PH7.2
注:
CaCO3最后加,不需要溶解,直接调PH,培养基中有这个成分是为了缓冲pH。
因为硝化细菌的生长会产生酸化效应,使得氢离子过剩,到了一定程度硝化作用将无法继续,所以要碱性物质平衡酸碱。
下同。
2.硝酸细菌培养基(改良的斯蒂芬逊(Stephenson)培养基B)
NaH2PO40.25g
K2HPO40.75g
MgSO4·7H2O0.03g
MnSO4·4H2O0.01g
CaCO31.0g
Na2CO31.0g
NaNO21.0g
蒸馏水1000ml
PH7.2
3.反硝化细菌培养基
柠檬酸钠5.0g
KNO32.0g
KH2PO41.0g,
K2HPO41.0g
MgSO4·7H2O0.2g
蒸馏水1000ml
pH值7.2~7.5
4.好气性自生固氮菌培养基(改良阿须贝(Ashby)无氮培养基)
苯甲酸钠1.5g
K2HPO40.2g
MgSO4·7H2O0.2g
NaCl0.2g
CaSO4·2H2O0.1g
PH7.4—7.6
注:
在培养基分装入试管时,每管加入一1cm滤纸长条,要露出液面。
5.氨氧化细菌培养基(蛋白胨氨化培养基)
K2HPO40.5g
KH2PO40.5g,
MgSO4·7H2O0.5g
蛋白胨5.0g
蒸馏水1000ml
PH7.0~7.2
6.好气性纤维素分解菌培养基(依姆歇涅茨基纤维素分解菌培养基)
KH2PO41.0g
FeCl3·6H2O0.1g
MgSO4·7H2O0.3g
CaCl2·6H2O0.1g
NaCl0.1g
NaNO32.5g
pH7.2~7.4
注:
在培养基分装入试管时,每管加入一1cm滤纸长条,需露出液面。
(二)试剂的配制
1.格里斯试剂(GriessReagent)第一、第二液:
第一液:
将0.5g的对氨基苯磺酸(SulfanilicAcid)溶于150ml的20-30%稀醋酸溶液中,保存于棕色瓶中。
第二液:
将0.5gα-萘胺(α-naphthylamine)加入50ml蒸馏水中,煮沸后,缓缓加入150ml的20-30%稀醋酸溶液中,保存于棕色瓶中。
2.纳氏试剂
甲液:
将20.0g碘化汞和10.0g碘化钾溶于100ml蒸馏水中。
乙液:
将20.0g氢氧化钾溶于100ml水中。
分别配制甲、乙二液,待冷却后混合,放置2天后使用。
保存于棕色瓶中。
取上清液使用,保存期三周,随着沉淀增加会影响测定结果。
3.二苯胺试剂:
溶1.0g无色的二苯胺(Diphenylamine)于20ml蒸馏水中,然后徐徐加入100ml浓硫酸(相对密度1.84)中,保存于棕色瓶中。
(三)实验器材
1.仪器设备
4℃冰箱、立式自动电热压力蒸汽灭菌器、恒温培养箱、电子天平、电热恒温水浴锅、超净工作台、微量移液器、全温空气摇床、旋涡混合器、磁力搅拌器、微波炉等。
2.器材准备
⑴将90ml水装入250ml三角瓶中,并装有15-20个玻璃珠,灭菌。
⑵将9ml水装入试管,灭菌。
⑶试管架,1ml无菌吸管,记号笔,白瓷比色板,接种环,酒精灯等。
(四)实验方法
1.样品采集
在靠近植株根系部,去除表层0-5cm的表土,采集5-20cm土壤剖面,多点采集,混匀后四分法取1kg,装无菌塑料袋带回,4℃冰箱保存。
2.悬液制备
称取10g土壤样品,放入盛有90ml无菌水的三角瓶中,置于摇床上室温振荡20min,
使土样与水充分混合,将土壤中的微生物细胞充分分散,从土壤中分离出来。
此为10-1土壤悬液,吸取lml此土壤悬液于9ml无菌水中,另用无菌吸管吹吸3次混匀,制成10-2土壤悬液。
以此类推依次制成10-3、10-4、10-5、10-6、10-7、10-8不同稀释度的土壤悬液。
3.土壤悬液稀释度选择
⑴细菌:
10-4~10-6
⑵放线菌:
10-3~10-5
⑶真菌:
10-2~10-4
以上采用稀释平板法,分别设置三个浓度梯度,二次重复。
⑷亚硝酸细菌:
10-3~10-6
⑸硝酸细菌:
10-3~10-6
⑹反硝化细菌:
10-4~10-7
⑺好气性自生固氮菌:
10-3~10-6
⑻氨氧化细菌:
10-5~10-8
⑼好气性纤维素分解菌:
10-2~10-5
以上采用最大或然法(MPN),分别设置四个浓度梯度,三次重复。
4.接种(平板接种技术)
平板接种是用接种环将菌种接至平板培养基上,或用移液管,滴管将一定体积的菌液移至平板培养基上,然后进行培养.其目的是进行菌落形态观察,分离纯化菌种,活菌计数,或进行其它试验.其方法有多种,根据实验的目的要求不同,可分以下几种.
①斜面菌种接至平板
划线法:
按无菌操作的方法自斜面用接种环直接取少量菌体,在平板培养基表面自左至右轻轻连续划线或分区划线,注意不要划破培养基.或先制成菌悬液,接种在平板边缘的一处,将接种环灼烧灭菌,再从有菌的部位如上方法划线接种.
点接法:
一般用于霉菌菌落观察的接种.无菌操作下,用接种针从斜面或孢子悬液中取少量孢子,轻轻点接在平板培养基上,点接的部位和点接的次数根据实验目的与要求确定.
②菌悬液接至平板涂抹法:
用灭菌的移液管或滴管吸取一定体积的菌液移至平板上,然后用无菌的玻璃涂棒将菌液均匀涂布在整个平板上.
混菌法:
先将菌液加入培养皿中,然后加入融化并冷却至45~50℃的固体培养基,轻轻摇匀,平置,待完全凝固后倒置培养.
③平板菌种接至斜面
此法一般是将分离培养得到的单菌落,在无菌操作下分别接种到斜面培养基上,以便进一步扩大培养或作保存之用.接种之前先选好平板上的单菌落,并做好标记.左手拿平板,右手拿接种环,在火焰上方或火焰旁边操作,灼烧接种环后将接种环在空白培养基处冷却,以免将菌种烫死,然后挑取菌落,在火焰旁边稍等片刻,此时左手将平板放下,拿起斜面培养基,按斜面接种的方法接种.
5.培养
将所有试管和平板置于25-28℃黑暗条件下避光培养。
培养时间由短到长分别为:
⑴真菌:
2~3d;
⑵细菌:
3~4d;
⑶放线菌:
5~7d。
⑷氨氧化细菌:
7~8d;
⑸好气性自生固氮菌:
7~8d;
⑹亚硝酸细菌:
10~14d;
⑺硝酸细菌:
10~14d;
⑻反硝化细菌:
10~14d;
⑼好气性纤维素分解菌:
10~14d;
6.结果观察
⑴亚硝酸细菌:
取出培养液5滴于白瓷比色板上,加入格里斯试剂(GriessReagent)第一、第二液各两滴,如有亚硝酸盐存在,则呈红色。
⑵硝酸细菌:
取出培养液5滴于白瓷比色板上,加入格里斯试剂(GriessReagent)第一、第二液各两滴,如不呈红色,表示亚硝酸均已经完全消失。
此时,另取培养液5滴于白瓷比色板上,加二苯胺试剂2滴,如呈蓝色,则表示亚硝酸已经被氧化成硝酸,说明有硝酸细菌的存在。
⑶反硝化细菌:
加入格利斯亚硝酸试剂,观察颜色变化,确定正负反应。
⑷好气性自生固氮菌:
观察试管培养液表面与滤纸接触处有无褐色或黏液状菌膜生成,或有无圆晕混浊出现。
⑸氨氧化细菌:
取出培养液5滴于白瓷比色板上,加入纳氏试剂两滴,如有氨氧化细菌存在,则呈棕色或褐色。
⑹好气性纤维素分解菌:
观察滤纸条是否成团,有无黄色或橘黄色菌斑出现及滤纸断裂情况。
7.镜检计数
稀释平板菌落计数
平板接种培养有混合平板培养法和涂抹平板培养法两种方法.
⑴混合平板培养法
将无菌平板编上10-7,10-8,10-9,每一设置三个重复,用无菌吸管按无菌操作要求吸取1×10-9稀释液各1mL放入编号10-9的3个平板中,同法吸取10-8稀释液各1mL放入编号1×10-8的3个平板中,再吸取1×10-7稀释液各1mL放入编号1×10-7的3个平板中,由低浓度向高浓度时,吸管可不必更换.然后在9个平板中分别倒入已熔化并冷却至45~50℃的细菌培养基(图5-2),轻轻转动平板,使菌液与培养基混合均匀,冷凝后倒置,在30℃下培养.至菌落长出后即可计数.
⑵涂抹平板计数法
涂抹平板计数法与混合法基本相同,所不同的是先将培养基熔化后趁热倒入无菌平板中,待凝固后编号,然后用无菌吸管吸取0.1mL菌液对号接种在不同稀释度编号的琼脂平板上,每个编号设三个重复.再用无菌刮铲将菌液在平板上涂抹均匀(图24-3),每个稀释度用一个灭菌刮铲,更换稀释度时需将刮铲灼烧灭菌.在由低浓度向高浓度涂抹时,也可以不
更换刮铲.将涂抹好的平板平放于桌上20~30min,使菌液渗透入培养基,然后将平板倒转,保温培养,至菌落长出后即可计数.
计算结果时,常按下列标准从接种后的3个稀释度中选择一个合适的稀释度,求出每克菌剂中的含菌数.
(1)同一稀释度各个重复的菌数相差不太悬殊.
(2)细菌,放线菌,酵母菌以每皿30~300个菌落为宜,霉菌以每皿10~100个菌落为宜.
选择好计数的稀释度后,即可统计在平板上长出的菌落数,统计结果按下式计算.
混合平板计数法:
每g样品的菌数=同一稀释度几次重复的菌落平均数×稀释倍数
涂抹平板计数法:
每g样品的菌数=同一稀释度几次重复的菌落平均数×10×稀释倍数
尽管使用不同的培养基,但细菌、放线菌和真菌都可能在同一个培养基上生长,所以必须用显微镜做进一步的观察。
明显有菌丝的一般是真菌,真菌的菌丝为丝状分枝,比较粗大;而放线菌菌丝呈放射状,比较细。
细菌有球状和杆状,有些细菌也形成细小的菌丝。
酵母菌的菌落与细菌的菌落很相似,但在显微镜下容易分辨。
酵母菌个体比较大,一般有圆形、椭圆形、卵形、柠檬形或黄瓜形,有些还有瘤状的芽。
在两级稀释度中,选细菌和放线菌的菌落数为30~200个、真菌菌落数为20~40个的培养皿各5个,取其平均值计算出每组的菌落数。
如果菌落很多,可将其分成2~4等份进行计数。
微生物生物量可以通过微生物细胞个体大小和密度计算得到。
8.计算
土壤微生物数量(cfu·g-1)=MD/W
式中M为菌落平均数:
D为稀释倍数;W为土壤烘干质量(g)。
背景知识:
微生物
微生物(microorganism简称microbe是包括细菌、病毒、真菌以及一些小型的原生动物、显微藻类等在的一大类生物群体,它个体微小,却与人类生活关系密切。
涵盖了有益有害的众多种类,广泛涉及健康、食品、医药、工农业、环保等诸多领域。
微生物的定义
现代定义:
微生物是一切肉眼看不见货看不清的微小生物的总称。
形体微小,结构简单,通常要用光学显微镜和电子显微镜才能看清楚的生物,统称为微生物。
(但有些微生物是可以看见的,像属于真菌的蘑菇、灵芝等。
)
1特点:
个体微小,一般<0.1mm。
构造简单,有单细胞的,简单多细胞的,非细胞的。
进化地位低。
2分类:
原核类:
三菌,三体。
三菌:
细菌、蓝细菌、放线菌 三体:
支原体、衣原体、立克次氏体。
真核类:
真菌,原生动物,显微藻类。
非细胞类:
病毒,亚病毒(类病毒,拟病毒,朊病毒)。
3五大共性:
体积小,面积大; 吸收多,转化快;生长旺,繁殖快;适应强,易变异; 分布广,种类多
微生物的类群
种类
原核:
细菌、放线菌、螺旋体、支原体、立克次氏体、衣原体。
真核:
真菌、藻类、原生动物。
非细胞类:
病毒和亚病毒。
一般地,在中国大陆地区的教科书中,均将微生物划分为以下8大类:
细菌、病毒、真菌、放线菌、立克次体、支原体、衣原体、螺旋体。
1细菌:
(1)定义:
一类细胞细短,结构简单,胞壁坚韧,多以二分裂方式繁殖和水生性强的原核生物
(2)分布:
温暖,潮湿和富含有机质的地方
(3)结构:
主要是单细胞的原核生物,有球形,杆形,螺旋形
基本结构:
细胞膜细胞壁细胞质核质。
特殊结构:
荚膜、鞭毛、菌毛、芽胞
(4)繁殖:
主要以二分裂方式进行繁殖的
(5)菌落:
单个细菌用肉眼是看不见的,当单个或少数细菌在固体培养基啊行大量繁殖时,便会形成一个肉眼可见的,具有一定形态结构的子细胞群落.
菌落是菌种鉴定的重要依据.不同种类的细菌菌落的大小,形状光泽度颜色硬度透明度都不同.
2放线菌
(1)定义:
一类主要成菌丝状生长和以孢子繁殖的陆生性较强的原核生物
(2)分布:
含水量较低,有机物较丰富的,呈微碱性的土壤中
(3)形态构造:
主要由菌丝组成,包括基菌丝和气生菌丝(部分气生菌丝可以成熟分化为孢子丝,产生孢子)
(4)繁殖:
通过形成无性孢子的形式进行无性繁殖
(5)菌落:
在固体培养基上:
干燥,不透明,表面呈致密的丝绒状,彩色干粉
真菌
真菌(Fungus)是一种真核生物。
最常见的真菌是各类蕈类,另外真菌也包括霉菌和酵母。
现在已经发现了七万多种真菌,估计只是所有存在的一小半。
大多真菌原先被分入动物或植物,现在成为自己的界,分为四门
真菌通常又分为三类,即酵母菌、霉菌和蕈菌(大型真菌),它们归属于不同的亚门。
真菌的细胞既不含叶绿体,也没有质体,是典型异养生物。
它们从动物、植物的活体、死体和它们的排泄物,以及断枝、落叶和土壤腐殖质中、来吸收和分解其中的有机物,作为自己的营养。
真菌的异养方式有寄生和腐生。
真菌常为丝状和多细胞的有机体,其营养体除大型菌外,分化很小。
高等大型菌有定型的子实体。
除少数例外,真菌都有明显的细胞壁,通常不能运动,以孢子的方式进行繁殖。
真菌菌落:
大小:
大。
形状:
绒毛状,絮状,蛛网状。
颜色:
五颜六色(孢子的颜色)
真菌:
念球菌、粘菌等。
细菌的菌落特征与繁殖
细菌在固体培养基上分裂繁殖时,许多细胞堆集在一起,形成肉眼可见的群体称为菌落。
不同种类的细菌其菌落形态互不相同,表现在大小、形状、边缘、隆起、光泽、质地和颜色等方面。
细菌菌落大小不一,小的不到1毫米,大的可以铺满整个培养皿;菌落形状有圆形、不规则形、卷发状、假根状等;菌落的隆起形状有扩展、台状、低凸、乳头状等;有的菌落有光泽、有的没有;有的菌落较粘,有的则较脆;菌落一般呈灰色,少数为白色、黄色、红色、绿色和棕色等。
大小:
小。
形状:
光滑,粘稠或粗糙干燥。
颜色:
多为白色。
细菌一般进行无性繁殖,表现为细胞的横分裂,称为裂殖。
裂殖结果形成两个大小相同的子细胞。
在最适宜的条件下,20~30分钟就能分裂1次,并可继续分裂若干次。
当继续分裂时,常因养料供应不足或温度变化以及其它种种原因而停止分裂或死亡。
放线菌的菌落特征与繁殖
放线菌的菌落质地致密,表面呈紧密的绒状,或坚实、干燥而多皱。
由于基菌丝长在培养基,所以菌落与培养基结合较紧,不容易被挑起,或者被挑起后不容易破碎。
当孢子丝形成大量孢子布满菌落表面时,使菌落呈絮状、粉末状或颗粒状,而与细菌菌落判然有别。
此外,如用放大镜仔细观察,可以看见菌落周围有放射状菌丝。
放线菌主要通过形成无性孢子的方式进行繁殖。
其孢子丝成熟时,分化形成许多孢子,称为分生孢子。
分生孢子常具色素,呈白、灰、黄、橙黄、红、蓝、绿等颜色。
孢子丝形成孢子的方式有凝聚分裂和横隔分裂两种。
大多数放线菌按凝聚分裂方式形成孢子,其过程是在孢子丝从顶端到基部,细胞质分段围绕核质,逐渐凝聚成一串大小相似的小段,然后每一小段外面产生新的孢子壁而形成孢子,最后孢子丝壁破裂,将孢子释放出来。
少数放线菌按横隔分裂方式形成孢子,其过程是在孢子丝产生许多距离均等的横隔,然后在横隔处断裂形成孢子。
另外有些放线菌可在菌丝上形成孢子囊,在孢子囊形成孢囊孢子,但这样的种类很少。
土壤稀释液的配制:
悬液制备
准确称取待测土样品10g,放入装有90mL无菌水并放有小玻璃珠的250mL三角瓶中,用手或置摇床上振荡20min,使微生物细胞分散,静置20~30s,即成10-1稀释液;
再用1mL无菌吸管,吸取10-1稀释液1mL,移入装有9mL无菌水的试管中,吹吸3次,让菌液混合均匀,即成10-2稀释液;
再换一支无菌吸管,吸取10-2稀释液1mL,移入装有9mL无菌水的试管中,也吹吸3次,即成10-3稀释液;
以此类推,连续稀释,制成10-4,10-5,10-6,10-7,10-8,10-9,10-10等一系列稀释菌液
注意事项:
1、培养基提前一天倒入培养皿,室温存放一天,另培养基表明干燥。
2、做无菌水接种对照,检测污染情况。
3、吸取10-6,10-8和10-10稀释液100ul,均匀涂布。
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