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光学显微标本的制作技术

【实验目的】

了解光学显微镜切片制作技术的基本方法步骤。

【实验原理】

采用光学显微镜研究一般生物体的内部结构,在自然状态下是无法观察清楚的,多数动、植物材料都必须经过某种处理,将组织分离成单个细胞或薄片,光线才能通过细胞。

为了适应这个需要,就产生了光学显微镜制片技术。

光学显微镜的制片技术方法可分为两大类:

一类是非切片法,另一类是切片法。

非切片法,是用物理或化学的方法,使细胞彼此分离,如有分离法、涂布法、压碎法等。

非切片法的操作比较简单,能保侍细胞的完整,但是细胞之间的正常位置往往被更动,无法反映细胞之间的正常联系。

它可以与切片法配合使用,各取其长处。

切片法,是利用锐利的刃具将组织切成极薄的片层,材料须经过一系列特殊的处理,如固定、脱水、包埋、切片、染色等,过程十分繁复。

在制作过程中,还要经过一系列的物理和化学的处理,这些处理方法可根据各种不同材料的性质要求进行合理选择。

切片法虽然工序繁琐,技术复杂,但是,它最能保持细胞间的正常的相互关系,能较好和较长时间地保留细胞的原貌,所以仍然是光学显微镜的主要制片方法。

【实验仪器、材料和试剂】

（一）仪器:

石蜡切片机、恒温蜡箱、载玻片、盖玻片

（二）材料:

洋葱根或小鼠肝

（三）试剂:

乙醚、无水乙醇、甲醛、冰醋酸、苦味酸、重铬酸钾、锇酸、正丁醇、二甲苯、石蜡、甘油、鸡蛋、纱布、加拿大树胶、麝香草酚

【方法与步骤】

光学显微镜切片制作技术最简单的切片法是徒手切片,但是由于组织块往往十分柔软,

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切削很困难,而且无法得到十分菲薄的切片,因此必须先用某些特殊物质渗入组织块的内部起支持作用,并将整个组织块包住,然后再用精密的切片机制作切片,才能获得良好的效果。

这种方法称为包埋法,包埋的物质称为包埋剂。

常用的包埋剂有石蜡、火棉胶、炭蜡、明胶等,水和塑料也可作为包埋剂。

根据包埋剂的不同,分别有石蜡切片、火棉胶切片、冰冻切片等,它们各有长处,可以根据需要选用,但是使用得最多的还是石蜡切片技术。

石蜡作为包埋剂,有其独特的优点,例如:

石蜡能切出极薄的蜡片（2~10μm）;切片时能连成蜡带,便于制作连续切片;操作较容易,组织块可以包埋在石蜡中长期保存。

然而石蜡切片的制作过程较长,步骤很多,一步不慎往往导致前功尽弃,而且这些处理引起组织块或多或少地收缩,切片时受湿度影响比较大,这些不足之处必须在制片过程中认真对待,尽量减小它的不良影响。

石蜡切片的制作过程主要包括:

取材,固定,脱水,透明,透蜡,包埋,切片,贴片,染色,透明,封藏等步骤。

1.取材

材料的好坏直接影响到切片的质量,无论取哪一种动植物材料,以下几点是必须注意的。

（1）植物材料选择时须尽可能不损伤植物体或所需要的部分;动物材料取用时常对动物施以麻醉,常用的麻醉剂有氯仿和乙醚,或将动物杀死后迅速取出所需要的组织。

（2）取材必须新鲜,这一点对于从事细胞生物学研究尤为重要,应该尽可能割取生活着的组织块,并随即投入固定液。

（3）切取材料时刀要锐利,避免因挤压细胞使其受到损伤。

（4）切取的材料应该小而薄,便于固定剂迅速渗入内部。

一般厚度不超过2mm,大小不超过5×5mm2。

2.固定

组织和细胞离开机体后,在一定时间内仍然延续着生命活动,会引起病理变化直至归于死亡。

为了使标本能反映它生前的正常状态,必须尽早地用某些化学药品迅速地杀死组织和细胞,阻抑上述变化,并将结构成分转化为不溶性物质,防止某些结构的溶化和消失。

这种处理就是固定。

除了上述作用外,固定剂会使组织适当硬化以便于随后的处理,还会改变细胞内部的折射系数并使某些部分易于染色。

固定剂的作用对象主要是蛋白质,至于其他成分如脂肪和糖,在一般制作时不加考虑,如要观察这些物质,可用特殊的方法将其固定下来。

固定剂的作用表现在对材料体积的改变、硬化的程度、穿透的速度以及对染色的影响等方面。

这些作用的好坏、大小,都依所固定的材料性质而定,同样一种固定液对某一材料来说是良好的,但对另外一些组织可能就不很适用。

良好的固定剂必须具备的特征是:

穿透组织的速度快。

能将细胞中的内含物凝固成不溶解物质,不使组织膨胀或收缩以保持原形,硬化组织的程度适中,增加细胞内含物的折光度,增加媒染和染色能力,具有保存剂作用。

固定剂有简单固定剂和混合固定剂的划分。

简单固定剂即单一的固定剂,常用的有乙醇、甲醛、冰醋酸、升汞、苦味酸、铬酸、重铬酸钾和锇酸。

其中,苦味酸、升汞、铬酸既能凝固细胞清蛋白,又能凝固核蛋白;乙醇只能凝固清蛋白,而醋酸只能凝固核蛋白;甲醛、饿酸和重铬酸钾对这两种蛋白质都不凝固。

简单固定剂的局限性较大,如将其适当混合,制成复合固定剂可以取得更好的效果。

常用的混合固定剂有:

Bouin液（70份苦味酸饱和水溶液+25份4%甲醛+5份冰醋酸）、Zenker液（升汞5g+重铬酸钾2.5g+硫酸钠1.0g+5ml冰醋酸+100ml蒸镏水）、Carnoy改良液（3份无水乙醇+1份冰醋酸）等。

固定剂的种类甚多,我们必须依据各种固定剂的性能及制片的不同要求来加以选择。

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固定时,须注意以下几点:

（1）固定剂应有足够的量,一般为组织块体积的10~15倍。

（2）如所固定的材料外表有不易穿透的物质,可将材料先在含乙醇的溶液中固定几分钟,再移入水溶性的固定液。

（3）材料固定后如不立即下沉,可将其中气泡抽出。

（4）固定时间依材料大小、固定剂种类而异,可从1小时到几十小时,有时中间需要更新固定剂。

某些固定剂对组织的硬化作用较强,作用时间应严加控制,不能过长。

（5）一般固定剂都以新配制的为好,用过的不能再用。

有些混合固定剂由甲、乙两液合并者,一定要在使用前才混合。

（6）固定完毕,根据所用固定剂的不同,用水或乙醇冲掉残留的固定剂,以免固定剂形成沉淀,影响以后组织块的染色。

3.脱水

生物组织中含有大量的水分,它和石蜡是不能相溶的,致使在包埋时石蜡无法渗入组织内部,因此须使用脱水剂将水分除尽,这就是脱水的作用。

脱水剂必须能与水以任何比例相混合。

脱水剂有两类:

一类是非石蜡溶剂,如乙醇、丙酮等,脱水后必须再经过透明,才能透蜡包埋;另一类是兼石蜡溶剂,如正丁醇,脱水后即可直接透蜡。

常用的脱水剂是乙醇,因为它价格便宜,易于得到。

为了避免剧烈的扩散引起的组织的强烈收缩,脱水步骤应从低到高以一定的浓度梯度来进行,一般组织从30%乙醇开始,经过50%、70%、80%、95%、100%至完全脱水;对于一些柔软的组织应从15%开始。

脱水时间依据组织的类型和大小而定,一般各级乙醇中放置45min到1h,如果中间须停顿,应使材料停留在70%乙醇中,因为低浓度乙醇易使组织变软、解体,高浓度乙醇有脆化组织作用,放置时间不能过长,另外,脱水必须在有盖瓶中进行,以防止高浓度乙醇吸收空气中水分导致浓度降低而使脱水不彻底。

需要保存的材料可脱水至70%乙醇时停留其中,如需长期保存,可加入等量的甘油。

丙酮也是很好的脱水剂,其作用和用法与乙醇相同,不过其脱水力和收缩力都比乙醇强。

甘油常用于藻类、菌类及柔弱材料的脱水。

二氧六环为无色的石蜡溶剂,对组织没有收缩及硬化等不良后果,但其蒸气有毒,使用时须小心。

正丁醇可与水及乙醇混合,亦为石蜡溶剂,其优点是很少引起组织块的收缩与变脆。

叔丁醇的性质、作用和用法同于正丁醇,但因其价格昂贵而很少使用。

4.透明

组织块用非石蜡溶剂脱水后必须经过透明。

透明剂能同时与脱水剂和石蜡混合,它取代了脱水剂后,石蜡便能顺利地渗入组织。

透明剂的种类很多,较常用的是二甲苯、甲苯、苯、氯仿、香柏油和苯胺油等。

二甲苯作用较快,透明力强,但组织块在其中停留过久,容易收缩变脆变硬,同时若脱水不净,就会引起不良后果,在应用时必须特别小心。

通常将组织块先经纯乙醇与二甲苯的等体积混合液,再进入纯二甲苯,这样可减少上述的缺点。

透明时间应由组织大小而定,—般各级停留时间在30min至2h,在纯二甲苯中应更换2次,总时间则以不超过3h为宜。

材料经过透明,会显示出前一步脱水的效果如何,若脱水彻底,组织则显现透明状态,如组织中有白色云雾状,说明脱水不净,须返工处理,但返工的效果往往不好。

使用二甲苯透明时,应避免其挥发和吸收空气中的水分,并保持其无水状态。

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甲苯的一般性质与二甲苯相似。

用法亦同,唯沸点较低,透明较慢,但不会使组织变脆。

苯的用法同于二甲苯,对组织的收缩作用小,但须警惕其爆炸和吸入而引起中毒。

氯仿适于大块组织的透明。

5.透蜡和包埋

包埋用的石蜡,熔点在50~60℃之间,应根据材料本身的硬度、切片的厚薄和当时的气温条件来选用。

一般动物材料最常用的石蜡熔点为52~56℃,植物材料的用54~58℃的;切片薄的用58~60℃的,切片厚的则用52~54℃的;室温10~19℃时选用52~54℃的石蜡可顺利切片,冬季可用熔点46~48℃的石蜡,夏季可选56~58℃的。

石蜡的优劣与切片的成败密切相关。

鉴别石蜡质量的方法是:

将石蜡熔化后倒入纸盒使其凝结且无气泡和裂痕,30~35℃放置24h且无气泡和不透明的晶状小点出现,蜡块裂面不呈颗粒状,切成薄片不碎成细粒。

这种石蜡即为品质优良。

含有杂质的新蜡或用过的废蜡可清洁后再用,方法是将石蜡放入锅内,加热到开始冒白烟,然后用小火继续加热30min（注意别超过发火点）,使其去除水分和挥发性杂质,并在温箱中过滤以去除灰尘等颗粒。

透蜡须在恒温箱中进行,恒温箱的温度调节至高于石蜡熔点3度,使经过透明的组织块依次用石蜡与二甲苯的等量混合液、纯石蜡处理。

纯石蜡应处理2~3次,透蜡的时间依材料性质而定,一般每次需15~30min。

透明的关键是控制温度的恒定,切忌忽高忽低,温度过低石蜡凝固无法渗透,温度过高使组

织收缩发脆。

包埋是使浸透蜡的组织块包裹在石蜡中。

具体做法是;先准备好纸盒（具体折法见图1-3及说明）,将熔蜡倒入盒内,迅速用预温的镊子夹取组织块平放在纸盒底部,切面朝下,再轻轻提起纸盒,平放在冷水中,待表面石蜡凝固后立即将纸盒按入水中,使其迅速冷却凝固,30min后取出。

包埋用蜡的温度应略高于透蜡温度,保证组织块与周围石蜡完全融为一体。

石蜡的迅速冷却也很重要,否则包埋块中将会产生结晶。

以后切片时引起碎裂。

6.切片

（1）石蜡块的固着与整修

在包埋以后,就可进行切片。

包埋好的石蜡块装上切片机进行切片前还须进行固着和整修。

固着:

一般旋转式切片机上都附有可固着石蜡块的金属小盘,这也可用同样大小的台木替代。

用加热的蜡铲将包埋块粘贴于固着物上,并使组织块朝外,便于以后迅速切出所需的片子。

整修:

用加热的蜡铲或刀片将固着的包埋块四周修平,使上下两面修成平行面,常保留组织周围附着宽2~3mm的石蜡,而修好的蜡块呈长方形。

还可削去一角以便于在蜡带上识别切片。

（2）切片机和切片刀

切片机是用来作各种组织切片的一种专门设计的精密机械,常用的是旋转式切片机,它的夹物部分是上下移动前后推进的,而夹刀部分则固定不动。

主要部件是安装切片刀的刀台、安装包埋块的标本台和控制切片厚度的微动装置。

切片时切片刀固定不动,转动转轮,标本台上下运动并按调好的切片厚度向前推进一定的距离,组织块上下运动一次,便在刀片上得到一张合乎厚度要求的切片。

切片刀与切片的质量直接相关。

切片前必须磨刀,方法是:

将切片刀装上刀柄、刀背夹、滴少许石蜡油在平滑的磨刀石上,将刀贴着磨刀石以背向刀口方向磨,使用完毕后应及时用二甲苯将石蜡油擦净。

（3）切片方法

切片前,将刀口置放大镜下观察,选择刀口平整无缺刻的部分来进行切削。

将所要切的包埋块固定在标本台上,使包埋块外切面与标本夹截面平行,并让包埋块稍露出一截。

将刀台推至外缘后松开刀片夹的螺旋,上好刀片,使切片刀平面与组织切面间呈15°左右的夹角,包埋块上下边与刀口平行。

在微动装置上调节切片要求的厚度,调节时应