分子生物学研究技术.docx

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分子生物学研究技术

分子生物学研究技术

Module1:

分子生物学研究技术

cDNA文库

cDNA文库，代表了生物体某一器官或组织mRNA中所有的或绝大部分的遗传信息。

其构建过程总共有5个步骤（5项技术）：

1、总RNA的提取；2、mRNA的纯化；3、cDNA的合成；4、cDNA文库构建；5、基因文库筛选。

详细：

1、总RNA的提取：

目前常用的提取方法是异硫氰酸胍-苯酚提取法（Trizol提取法），提取步骤：

（1）首先用液氮研磨材料成匀浆，加入Trizol试剂，进一步破碎并溶解细胞；

（2）加入氯仿抽提，离心，收集含有RNA的水相；（3）用异丙醇沉淀，初步纯化RNA，获得样品用于下一步mRNA的纯化；（PS：

实验中还常将含有RNA的细胞破碎物液通过硅胶膜纯化柱后，再通过低盐浓度下从硅胶膜上直接洗脱RNA，获得纯度较高的总RNA）；

总RNA的浓度、纯度测定：

通过分光光度计测其OD260和OD280值，OD260为1时相当于RNA

不同内切酶所识别的接头序列，保证所获得的cDNA具有方向性）

4、cDNA文库的构建：

由于cDNA的长度一般为0.5~8Kb，所以常用质粒载体和噬菌体类的载体便能用于承载cDNA。

基本过程：

将合成的cDNA连接到特定的载体上，然后将载体转入宿主细胞（一般为大肠杆菌），然后筛选阳性克隆，最终获得cDNA文库。

PS：

一般而言，cDNA文库的载体选择要根据文库的用途来确定，例如Uni-zapXR载体是一种噬菌粒载体，具备噬菌体的高效性和质粒载体系统可利用蓝白斑筛选的便利，可容纳0~10kbDNA片段插入。

5、基因文库筛选：

是指通过某种特殊方法从基因文库中鉴定出含有所需要的重组DNA分子的特定克隆的过程。

目前主要的筛选方法有：

核酸杂交法、PCR筛选法和免疫筛选法。

核酸杂交法（最常用的筛选方法之一）：

（1）将圆形硝酸纤维素膜放在含有琼脂培养基的培养皿表面，将待筛选的菌落从其生长的平板上转移到硝酸纤维素膜上，后进行适当的温育（同时保留原菌板作为对照。

）

（2）取出已长有菌落的硝酸纤维素膜，用碱液处理，裂解细菌并使DNA变性；（3）接着用蛋白酶K处理硝酸纤维素膜上的蛋白质，形成菌落DNA印迹；（4）80℃烘烤滤膜，将DNA固定在膜上；（5）将滤膜与放射性同位素标记的DNA或RNA探针杂交，通过放射自显影显示杂交结果。

（X射线底片上显黑色斑点的就是试验中寻找的目的克隆）（6）通过比对显影的结果，可在对应的原菌板上获得相对应的克隆。

PCR筛选法：

使用前提，已知足够的序列信息并获得基因特异性引物。

基本过程：

（a）将整个文库（以质粒或菌落的形式均可）保存到多孔培养板上；（b）用设计好的目的基因探针对每个样孔进行PCR筛选，鉴定出阳性孔；（c）把每个阳性孔中的克隆在稀释到次级多孔板中进行PCR筛选。

重复以上程序，直到鉴定出于目的基因对应的单个克隆为止。

免疫筛选法：

基本步骤与核酸杂交检测类似，主要过程：

先将菌落或噬菌斑影印到硝酸纤维素膜上，再原位溶解菌落释放抗原蛋白，后用抗体与固定了抗原的膜杂交，抗原抗体结合后，再用标记好的二抗与之反应，最后通过对标记物的检测便可找到阳性克隆。

基因组DNA文库的构建

基因组DNA文库：

是指把某种生物的基因组DNA切成适当大小，分别与载体结合后导入微生物细胞，所形成的所有DNA序列的克隆汇总。

应用：

1、分离特定的基因片段；2、分析特定的基因结构；3、研究基因表达调控；4、构建全基因组物理图谱和全基因组序列测定。

主要过程：

1、提取样品DNA，将所提取的DNA制备成大小适合的随机DNA片段

2、体外将这些DNA片段与适当的载体连接成重组子

3、将重组子转化到大肠杆菌或其他受体细胞

4、从转化克隆群中筛选出含有靶基因的阳性克隆。

基因组文库的基本要求：

必须具有一定的代表性和随机性，以保证能从文库中筛选到某个特定基因。

提高基因组文库代表性的策略：

1、用机械切割法或限制性内切核酸酶切割法随机断裂DNA，保证克隆的随机性；2、增加文库重组克隆的数目，以提高覆盖基因组的倍数。

实例：

一般常用限制性内切酶部分消化法和ƛ噬菌体载体来构建基因文库，具体：

①提取真核基因组DNA，用可识别4个核苷酸的限制性内切核酸酶Sau3A部分消化基因组DNA，②消化的产物经过琼脂糖凝胶电泳或蔗糖梯度离心，收集15~20kb范围的片段；④同时用BamHI消化噬菌体载体（Sau3A和BamHI是同尾酶，前者产生的片段可插入后者切割的缺口）；⑤用T4连接酶将载体与DNA片段相连接，形成重组子；⑥体外包装后用重组噬菌体侵染大肠杆菌受体细胞；产生噬菌斑，组成包含该真核生物基因组绝大部分序列的DNA文库。

酵母杂交系统

1、酵母单杂交系统：

原理：

将已知的特定顺式作用元件构建到最基本启动子（minimalpromoter，Pmin）的上游，把报告基因连接到Pmin下游；然后将编码待测转录因子cDNA与已知酵母转录激活域（AD）融合表达载体导入酵母细胞，该基因产物如果能够与顺式作用元件相结合，就能激活Pmin启动子使报告基因表达。

作用：

（1）用于确定某个DNA分子与某个蛋白质分子之间是否存在相互作用；

（2）用于分离编码结合于特定顺式调控元件或其他DNA位点的功能蛋白编码基因；（3）验证反式转录调控因子的DNA结合域；（4）准确定位参与特定蛋白质结合的核苷酸序列。

2、酵母双杂交系统：

原理：

利用酵母细胞转录调控因子具有组件式结构的特征，即该种蛋白由两种相互独立的结构域组成（DNA结合结构域-BD；转录激活结构域-AD），转录因子要发挥功能需要两种蛋白相连接。

实验基本过程：

首先运用基因重组技术把编码已知蛋白的DNA序列连接到带有酵母转录调控因子BD编码区的表达载体上；然后，导入酵母细胞中使之表达带有DNA结合域的杂合蛋白，与报告基因上游的启动调控区域结合作为“诱饵”来捕获与已知蛋白相互作用的基因产物；再然后，将已知的编码AD的DNA分别与带筛选的cDNA文库中不同插入片段相连接，获得AD“猎物”载体去转化含有“诱饵”的酵母细胞；一旦，酵母细胞中表达的“猎物”蛋白与“诱饵”蛋白相互作用，不同转录调控因子的AD和BD就会被牵引靠拢，进而激活报告基因的表达。

蛋白质相互作用技术

1、等离子表面共振技术（SPR）

原理：

该技术是将诱饵蛋白结合于葡聚糖表面，将葡聚糖层固定于纳米级厚度的金属膜表面，当有蛋白混合物进过时，如果有蛋白同诱饵蛋白发生相互作用，那么两者的结合将会使金属膜表面的折射率上升，从而导致共振角度改变；而共振角度改变与该处蛋白质浓度成正比关系，由此检测蛋白质之间的相互作用。

优点：

不需要标记物和染料，安全、灵敏、快速还可做定量分析。

缺点：

需要专门的等离子表面共振检测仪器。

2、免疫共沉淀技术（co-immunoprecipitation，CoIP）

基本原理：

该技术核心是通过抗体来特异性识别候选蛋白。

基本过程：

首先，将靶蛋白的抗体通过亲和反应连接到固体基质上，再将可能与靶蛋白发生相互作用的大筛选蛋白加入反应体系中，用低离心力沉淀或微膜过滤法在固定基质和抗体的共同作用下将蛋白复合物沉淀到试管底部或微膜上。

如果靶蛋白与带筛选蛋白发生了相互作用，则这个带筛选蛋白就会通过靶蛋白与抗体和固体基质相互作用而被分离出来。

3、GST及GAD融合蛋白沉降技术

基本原理：

该技术是利用GST对谷胱甘肽偶联的琼脂糖球珠的亲和性，从混合蛋白质样品中纯化得到相互作用的蛋白质。

应用：

1、确定探针蛋白与未知蛋白间的相互作用；2、确定探针蛋白与某个已知蛋白之间的相互作用。

基本过程：

将GST与探针蛋白相结合，然后与谷胱甘肽-琼脂糖球珠、待测蛋白混合物一起在4℃条件下反应；离心，收集沉淀物；之后用SDS-PAGE分析。

4、荧光共振能量转移法（FRET）—细胞内蛋白质相互作用研究方法

常用探针：

荧光蛋白、传统有机染料和镧系染料。

研究蛋白质间相互作用时，FRET一般与荧光成像技术联用，将蛋白标记上探针，当蛋白质之间不发生相互作用时，其相对距离较大，无荧光共振能量转移现象，而有蛋白质相互作用时，由于相对距离小，则会出现荧光共振能量转移现象，该过程可直接根据成像照片色彩变化观察并记录。

5、噬菌体展示技术

噬菌体展示技术是将基因表达产物与亲和选择相结合的技术，其基本原理是将编码“诱饵”蛋白的DNA片段插入噬菌体基因组，并使之与噬菌体外壳蛋白编码基因相融合。

重组的噬菌体在侵染大肠杆菌后，复制形成大量带有杂合外壳蛋白的噬菌体颗粒，这样便可直接用于捕获靶蛋白库中与“诱饵”蛋白相互作用的蛋白质。

DNA-蛋白质相互作用研究技术

染色质免疫共沉淀（chromatinimmunoprecipitation，ChIP）—研究活体细胞内染色质DNA与蛋白质相互作用

主要实验流程：

1、在活细胞状态下固定蛋白质-DNA复合物，并通过超声波或酶处理将其随机切断为一定长度的染色质小片段；2、然后通过抗原抗体的特异性识别反应，沉淀该复合物，从而富集与目的蛋白质相结合的DNA片段；3、最后通过对目的片段的纯化及PCR检测，获得该蛋白与DNA相互作用的信息（DNA序列特征、位置、结合时间、亲和程度以及基因表达的影响）

凝胶滞缓实验（electrophoreticmobilityshiftassay，EMSA）—体外分析DNA与蛋白质的相互作用

基本原理：

蛋白质与DNA结合后将大大增加相对分子质量，而凝胶电泳中DNA朝正电极移动的距离与其相对分子质量的对数成正比，因此，与蛋白质形成复合物的DNA会由于受阻滞而跑得慢。

EMSA实验中：

用放射性同位素标记待检测的DNA片段，然后与细胞提取物共温育，然再添加到非变性的聚丙烯酰氨凝胶中电泳。

通常用32P标记DNA片段，电泳结束后，如果细胞提取物中不存在与DNA相互作用的蛋白质，那么所有放射性标记都会出现在凝胶底部；反之，由于结合蛋白质而受阻滞的原因，放射性标记的DNA条带会出现在凝胶的不同部位。

三种研究基因功能的研究方法

基因定点突变技术（site-directedmutagenesis）、基因敲除技术和RNAi技术是当前研究基因功能的三种主要研究方法（技术），基本原理：

主要通过全部或部分一直基因的表达，再通过观察靶基因缺失后生物体的表型变化，从而确定所研究基因的功能。

（1）基因定点突变技术：

当前基因定点突变技术主要采用基于PCR技术的两种方法：

重叠延伸技术和大引物诱变法。

其中（a）重叠延伸技术主要过程：

1、首先将模板DNA分别与引物1（正向诱变引物FM和反向诱变引物R2）和引物2（正向引物F2和反向诱变引物RM）退火；2、通过PCR1和PCR2扩增出两种靶基因片段；3、FM-R2和RM-F2片段在重叠区发生退火，用DNA聚合酶补平缺口，形成全场双链DNA后进行PCR3扩增；4、最后，用引物F2和R2通过PCR4扩增出带有突变位点的全长DNA片段。

（b）大引物诱变法基本过程：

1、首先通过正向突变引物（M）和反向引物（R1），通过PCR1扩增模板DNA产生双链大引物；2、将大引物与野生型DNA分子混合后退火并使之复性，在第二轮PCR中加入正向引物（F2），与PCR1中产生的第一条互补链配对，扩增产生带有突变的双链DNA；3、获取定点PCR产物后，进行DNA序列分析以验证突变位点。

（PS：

PCR介导的定点突变方法具有的优势：

1、突变体回收效率高，以至于不需要再进行突变体筛；2、能用双链DNA作为模板，可以在任何位点引入突变；3、可在同一试管中完成所有的反应；4、快速简便，无需在M13载体上进行分子克隆。

）

（2）基因敲除技术：

原理：

通过外源DNA与染色体DNA之间的同源重组，来进行精确的定点修饰和基因改在。

基因敲除分类：

完全基因敲除、条件型基因敲除；基本操作过程：

（a）完全基因敲除，通过同源重组法完全消除细胞或者动物个体中靶基因的活性：

实验中一般采用取代型或插入型载体在ES细胞中根据正-负筛选（P-N-S）原理进行完全基因敲除实验。

正向选择基因neo通常被插入载体靶基因DNA功能最关键的外显子中，或通过同源重组置换靶基因的功能区。

（neo基因有双重作用，一方面形成把位点的插入突变，同时可以作为正向选择的标记；负向选择基因HSV-tk（疱疹病毒熊腺嘧啶激酶基因）则被置于目的基因片段外侧，含有该基因的重组细胞无法在培养基上生长。

）由于遗传重组的自然发生概率极低，即使采用双向选择法（上述）也难保证一次筛选出真正发生同源重组的胚胎干细胞，之后还需要用PCR及southern印迹法等分子筛选技术验证目的基因被敲除了的细胞系。

（b）条件基因敲除：

通过定位重组系统实现特定时间和空间的基因敲除：

条件基因敲除常应用Cre/LoxP和FLP/FRT系统开展；大致过程：

构建条件型基因敲除时，常将正向选择标记neo置于靶基因的内含子中，并在靶基因重要的功能域两侧内含子中插入方向相同的LoxP位点；当实验需要消除靶基因活性时，只需要与带有Cre重组酶基因的ES细胞杂交，Cre重组酶就能把两个LoxP位点中间的DNA偏段切除，导致靶基因失活（PS：

标记基因两侧也常常带有LoxP序列，因为许多时候即使标记基因位于内含子中也会阻断靶基因的转录，一旦发生这种情况，可以用Cre重组酶表达质粒转染中靶ES细胞，通过LoxP位点重组将neo抗性基因敲除。

）

高等动物基因敲除技术：

主要技术路线包括构建重组基因载体，用电穿孔、显微注射等方法将重组DNA导入胚胎干细胞纯系中（使外源DNA与胚胎干细胞基因组中相应部分发生同源重组）；主要全基因敲除实验流程（以碱性磷酸酶（IAP）基因敲除为例）：

（1）利用Neo基因替换目的基因，得到碱性磷酸酶基因敲除的ES细胞；

（2）用显微注射或电穿孔法将IAP基因敲除的ES细胞注入早期胚胎的囊腔中；（3）诱导胚胎分化，获得嵌合体后再与野生纯合体回交，最终可获得由ES细胞分化产生的IAP基因敲除小鼠。

条件型基因敲除主要实验过程（肝组织S6基因为例）：

（1）首先构建带有S6基因的LoxP打靶载体的ES细胞；

（2）经过杂交筛选获得纯合体小鼠；（3）再与带有肝组织特异性、受INF-α诱导的Mx-Cre转基因小鼠杂交；（4）删除neo基因和外显子3~5后变得到肝组织特异性敲除S6基因的小鼠。

十七、基因工程操作全过程（目的基因获取、构建表达载体、转基因操作、阳性克隆的筛选与鉴定）

植物基因敲除技术：

植物基因敲除常采用T-DNA插入失活技术；原理：

利用根瘤农杆菌T-DNA介导转化，将一段带有报告基因的DNA序列标签整合到基因组DNA上，如果这段DNA插入到目的基因内部或附近，就会影响该基因的表达从而使该基因“失活”。

（PS：

T-DNA无专一性位点，在植物基因组中发生随机整合，所以理论上只要突变株数量足够大，就可能获得任何一个功能基因都发生突变的基因敲除植物库）

植物基因敲除突变体筛选：

由于基因内部或附近插入了一段一直序列的DNA，可据此设计引物用PCR的方法将被破坏的靶基因分离出来；若将靶基因两端引物LP、RP及插入载体上的引物LB加入同一反应提体系中进行PCR，理论上能得到三条类型的条带：

在野生型植株中只有LP和RP引物配对扩增出来的靶基因条带；纯合型基因敲除植株，只有靶基因一端的引物可以与LB引物配对完成PCR扩增；如果是杂合型基因敲除植株，PCR扩增或会出现两种条带。

（3）RNAi干涉技术：

原理：

利用双链小RNA高效、特异性降解细胞内同源mRNA从而阻断靶基因表达，使细胞出现靶基因缺失的表型。

RNAi的作用机制：

前体miRNA被释放到细胞质后，经过Dicer（一种具有RNAaseⅢ活性的核酸酶）加工成双链miRNA，较长的双链RNA（30bp以上）首先被Dicer降解成21~35个核苷酸的小分子干扰核糖核苷酸（siRNA）；siRNA中反义链指导合成RNA诱导沉默复合体蛋白（RISC），再有RISC介导切割目的mRNA中与siRNA反义链互补的区域（部分同源性-翻译受阻；高度同源性-直接降解），从而实现干扰靶基因表达的功能。

PS：

少量的siRNA信号也可能被迅速放大的原因：

siRNA可作为特殊引物，在依赖RNA的RNA聚合酶的作用下，以目的mRNA为模板合成dsRNA，dsRNA可被降解成siRNA后进入上述循环。

PS2：

哺乳动物，较长的dsRNA会导致非特异性基因沉默，短的siRNA才能有效引发特异性基因沉默；非哺乳动物可直接利用较长的dsRNA诱导RNAi而无需合成siRNA。

基因克隆技术

克隆在分子生物学上的定义：

将外源DNA插入具有复制能力的载体DNA中，使之得以永久保存和复制的过程。

主要有5种方法（技术）：

RACE技术、cDNA差示分析法、Gateway大规模克隆技术、基因图位克隆法、热不对称多聚酶链式反应（用于克隆T-DNA）。

（1）RACE技术：

RACE，即cDNA末端快速扩增法，是一项在已知cDNA序列的基础上克隆5’端或3’端缺失序列的技术。

主要操作步骤：

a、获得高质量总RNA（含有大量完整mRNA、tRNA、rRNA、和部分不完整的mRNA）；b、去磷酸化作用（带帽子结构的mRNA不受影响）；

c、去掉mRNA的5’端帽子结构，加上特异性RNA寡聚接头并用RNA连接酶相连接；

d、以特异性寡dT为引物，在反转录酶的作用下，反转录合成第一条cDNA（包含了寡接头的互补序列）；

e、分别以第一条cDNA链为模板进行REAC反应：

（1）5’REAC以5’端RNA寡聚接头的部分序列和基因特异的3’端反向引物进行PCR扩增，获得基因的5’端序列。

（2）3’REAC以5’端基因特异的引物和3’端寡dT下游部分序列为引物进行PCR扩增，获得基因的3’端序列。

（PS:

如果只对3’端序列感兴趣，可直接从倒数第二步开始进行3’REAC）

f、将纯化后的PCR产物克隆到载体DNA中，进行序列分析。

（PS：

REAC技术还被用于获得5’和3’端非转录序列，研究起始转录位点的不均一性，研究启动子区的不保守性）

十八、由cDNA证明基因含有内含子、确定内含子比例

（2）cDNA差示分析法（RDA）？

？

？

作为染色体步移技术和定位克隆技术等方法的补充，RAD充分发挥了PCR以指数形式扩增双链DNA模板，而仅以线性形式扩增单链模板的特性，通过降低cDNA群体的复杂性和更换cDNA两端接头等方法，特异性扩增目的基因片段。

（3）Gateway大规模克隆技术？

？

？

该技术利用ƛ噬菌体进行位点特异性DNA片段重组，实现不需要传统酶切连接过程的基因快速克隆和载体间平行转移，为大规模克隆基因组注释的可读框提供了保障。

该技术主要包括TOPO反应和LR反应两步：

TOPO反应将目的基因PCR产物连入Entry载体；LR反应被用于将目的片段从Entry载体中重组入表达载体。

（4）基因图位克隆法（map-basedcloning）—分离位置性状基因

基本过程：

首先，通过构建遗传连锁图，将目的基因定位到某个染色体的特定位点，并在位点两侧确定紧密连锁的RFLP或RAPD分子标记；

其次，通过对许多不同生态型个体的大量限制性内切核酸酶和杂交探针的分析，找出与目的基因距离最近的分子标记，通过染色体步移技术将位于这两个标记之间的基因片段分离克隆出来；

最后，再根据基因功能互作原理鉴定目的基因。

（5）热不对称多聚酶链式反应—用于克隆T-DNA

作用：

TAIL-PCR常用于扩增T-DNA插入位点侧翼序列，从而获得转基因植物插入位点特异性分子证据。

主要过程：

该方法使用一套巢式特异性引物（T-DNA边界引物，TR）和一个短的随机简并引物（AD）。

第一轮反应（PCR1）是TAIL-PCR的重要环节，先进行5个高严谨性的循环，特异性引物TR1与模板退火，只能发生单引物循环，T-DNA上游侧翼序列得到线性扩增；再者，大幅度降低退火温度，使AD及TR1均与模板DNA相结合，指数扩增一个循环；此后，两个高严谨、一个低严谨循环交替进行，共15个循环（结果，特异性序列（两端分别有TR1和AD序列）和非特异性序列1（只有TR1）大大超过非特异性序列2（两端均为AD））；第二轮反应（PCR2）以特异性引物TR2和AD配对，进行12个TAIL-PCR循环，特异性序列再次被优先扩增，非特异性序列1也大大降低，此时没有明显的背景片段。

第三轮反应（PCR3）是真正意义上的PCR，用TR3为特异性引物与AD配对，共2个循环，进一步扩增特异性序列。

多聚酶链式反应（PCR）

基本原理：

将双链DNA分子在临近沸点的温度下加热分离成两条单链，之后在DNA聚合酶的作用下以单链DNA为模板利用反应体系中的四种脱氧核糖核苷酸合成新的DNA互补链。

（反应体系：

模板DNA、PCR引物、dNTPs、DNA聚合酶、Mg2+、缓冲液）

反应的基本过程：

双链模板DNA首先在高温下解开成长单链，之后断链引物迅速与模板特定序列结合产生双链区，DNA聚合酶从引物处开始复制合成其互补链，迅速产生与目标序列完全相同的复制品。

整个过程：

DNA解链（变性）—引物与DNA模板结合（退火）—DNA合成（延伸）。

几项常用的PCR技术：

1、实时定量PCR（realtimequantitativePCR），一项利用带荧光检测的PCR仪对整个PCR过程中扩增DNA的累积速率绘制动态变化图，从而消除了在测定终端产物丰度时有较大变异系数问题的PCR技术。

基本原理：

荧光探针实现混合在PCR溶液中，只有与DNA结合后才能够激发出荧光。

随着新合成的DNA片段的增加，结合到DNA片段上的荧光探针数量也在增加，被激发的荧光也相应增加—所以荧光强度直接反映了被扩增的靶基因总量。

PS：

常用的荧光探针：

1、SYBRGreen1，非特异性，520nm，只能与双链DNA结合。

重亚硫酸盐测序技术—DNA甲基化检测

主要过程：

1、将待测DNA样品用限制性内切酶处理或超声波破碎等方法打断成500~1000bp碎片；

2、再用重亚硫酸盐处理使DNA中未发生甲基化的胞嘧啶发生脱氨作用转变成尿嘧啶（被甲基化的胞嘧啶由于甲基化保护而不受影响）；

3、PCR扩增后该尿嘧啶被测序仪读取为胸腺嘧啶；

4、最后参考原始序列即可判断源C位点是否发生甲基化。

注意事项：

1、重亚硫酸盐测序分析时必须对同一目标片段进行多次测序（通常为11次），以免产生同源测序（siblingsequencing，是指实验中所挑取的克隆来源于同一原始DNA模板分子，形成了完全相同的没有代表性的甲基化模型）；

2、由于重亚硫酸盐测序引物常有简并位点，造成PCR扩增过程中引物对不同甲基化程度DNA模板分子的亲和力不同，使亲和力高的模板分子在PCR产物中占高比例，所以经常需要用其他方法做平行试验。

其他检测甲基化的方法：

1、甲基化敏感限制性内切核酸酶法（MS-RE）；2、甲基化特异性PCR（MS-PCR）；3、DNA微阵列法；4、甲基化敏感性斑点分析法（MS-DBA）。

其他相关知识概念：

1、DNA甲基化（DNAmethylation）：

具体指生物体在DNA甲基转移酶的催化下，以S-腺苷甲硫氨酸为甲基供体将甲基转移到特定的碱基上的过程。

（DNA甲基化会抑制基因的表达）

2、细胞中DNA甲基化的3种状态：

1、持续的低甲基化状态，如管家基因；2、去甲基化状态，如一些发育阶段特异表达的基因；3、高度甲基化，如女性一条失活的X染色体。

3、CpG岛（CpGisland）：

指在基因组的某些区域中，CpG序列密度达均值的5倍以上所形成的鸟嘌呤和胞嘧啶的富集区。

通常位于基因启动子区或第一个外显子区。

核酸的分离与纯化

1、凝胶电泳

基本原理：

在生理条件下，核酸分子中的磷酸基团是呈离子化状态，DNA和RNA多核苷酸链实际上是呈多聚阴离子状态，所以将DNA或RNA放入电场中，它们会由负极向正极移动，且