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生化分离原理与技术思考题答案
生物分离原理与技术知识点汇总
第一章绪论
1、各类分离纯化技术分别利用了生物分子的哪些特性来实现分离?
利用这些性质进行分离的方法有哪些?
⑴形状和大小:
凝胶过滤、超滤、透析;⑵电荷性质:
离子交换层析、电泳(除SDS);⑶极性(疏水性):
疏水层析、反相层析;⑷生物功能或特殊化学基团:
亲和层析;⑸等电点pI:
层析聚焦、等电聚焦、等电点沉淀;⑹溶解性:
盐析、有机溶剂提取、结晶;⑺密度、大小:
超离心、SDS-PAGE。
2、一个完整的分离纯化操作有哪些基本步骤?
各个阶段所用的分离方法分别侧重哪些指标?
生化分离基本步骤:
(1)选材:
来源丰富,含量相对较高,杂质尽可能少。
(2)提取(预处理):
将目的物从材料中以溶解状态释放出来,方法与存在部位及状态有关(3)分离纯化:
核心操作,须根据目的物的理化性质,生物学性质及具体条件确定。
(4)浓缩、结晶、干燥。
(5)保存。
整个过程应有快速灵敏准确的分析方法来衡量效果(收率、纯度)。
第二章生物样品的预处理
1、简述常用细胞破碎的主要方法、原理、特点、适用范围及细胞破碎今后的发展方向。
机械法:
(1)胞捣碎法。
原理:
机械运动产生剪切力,适用于动植物组织。
(2)高速匀浆法。
破碎程度较上法好,且机械剪切力对生物大分子的破坏较小,处理量大。
原理:
利用高压使细胞悬浮液通过针型阀,由于突然的减压和高速冲击撞击环使细胞破碎。
适用于:
较柔软、易分散的组织细胞。
(3)研磨法和珠磨法。
由陶瓷的研钵和研杆组成,加入少量研磨剂(如精制石英砂、玻璃粉、硅藻土。
适用于微生物与植物细胞。
(4)挤压法。
微生物细胞在高压下通过一个狭窄的孔道高速冲出,因突然减压而引起一种空穴效应,使细胞破碎。
适用于细菌(G-)。
物理法:
(1)超声破碎。
频率为20kHz以上的波,超过人耳可听范围。
其对细胞的破碎与空穴的形成有关。
一般样品浓度、声强、频率、介质的离子强度、pH、处理时间都对破碎有影响。
(2)反复冻融动物材料。
将材料深冷(-15℃~-20℃),形成水晶,破坏胞膜疏水键,增加亲水性,反复可破细胞。
适用:
动物材料。
(3)渗透压冲击法。
高渗突然低渗,反复后可造成细胞破碎,促使内含物释放。
适用:
处理胞壁较脆弱的微生物。
(4)急热骤冷法。
将材料投入沸水,维持85~90℃数分钟,冰浴中急速冷却,使胞壁结构破坏。
适用:
细菌及病毒等中对热不太敏感的物质提取。
(5)干燥法:
热空气干燥法适用于酵母,真空干燥法适用于细菌,冷冻干燥法适用于不稳定的酶。
化学法:
(1)溶剂处理法。
丙酮、氯仿、甲苯等脂溶性溶剂可溶解胞膜上脂质化合物,使细胞结构破坏。
(2)表面活性剂法。
添加如十二烷基磺酸钠、去氧胆酸钠等,通过破坏细胞膜而破碎细胞,释放目的物。
此法常需与其它方法结合应用。
酶解法:
(1)自溶法,将欲破碎细胞在一定条件(pH、T)下保温一定时间,通过细胞本身存在的酶系的作用,将细胞破坏,使胞内物质释放。
(2)外加酶法。
利用各种水解酶专一性地将细胞壁分解,使内含物释放出来。
细菌:
加溶菌酶(结合反复冻融或加EDTA)。
酵母:
采用β-葡聚糖酶。
霉菌:
添加几丁质酶。
植物材料:
加纤维素酶、半纤维素酶和果胶酶等。
发展方向:
(1)多种破碎方法相结合。
(2)与上游过程相结合。
(3)与下游过程相结合。
2、简述盐析与有机溶剂沉淀方法的原理、主要应用范围及分级范围的选择依据,比较这两种方法的优缺点和差异。
盐析。
原理:
“盐溶”低浓度中性盐离子对蛋白质分子表面极性基团及水活度的影响,增加蛋白质与溶剂相互作用力,使其溶解度增大。
“盐析”中性盐浓度增加至一定值时,水分子定向排列,活度大大减少,蛋白质表面电荷被中和,水膜被破坏,从而聚集沉淀。
盐析范围的确定:
可采用盐浓度对蛋白质沉淀量的盐析曲线测得(从回收率和纯度考虑)。
盐析的优点:
成本低,不需要特别昂贵的设备;操作简单,安全;不会引起蛋白质变性,经透析去盐后,能得到保持生物活性的纯化蛋白质。
缺点:
效果不理想,通常只是作为初步的分离纯化,还需要结合其它的纯化。
有机溶剂沉淀。
原理:
使溶液的介电常数大大降低,从而增加带电粒子自身之间的作用力,易聚集沉淀。
争夺酶、蛋白质等物质表面的水分子,破坏水化层,使分子易碰聚产生沉淀。
优点:
分辨能力比盐析高,即一种生物分子或其他溶质只在一个比较窄的有机溶剂浓度范围内沉析;沉析不用脱盐,过滤比较度范围内沉析;沉析不用脱盐,过滤比较容易。
缺点:
是某些具有生物活性的大分子容易引起变性失活,操作需在低温下进行。
3、从植物或动物材料中提取酶类,一般预处理过程中影响酶收率的主要原因是什么?
如何解决?
组织中所存在的酚类化合物使植物中提取生物大分子的过程变得复杂。
组织被破坏时,蛋白质等大分子和酚类处混合接触状态,很易发生反应。
酚类氧化产物醌类生物分离原理与技术-2-和单宁酸类会继续和蛋白质反应,使目的蛋白失去活性。
为此去除酚类化合物或避免反应是必须进行的步骤。
在提取酶、核酸、多糖等生物大分子时,其他大分子的存在会对提取产生干扰,需要有效手段去除。
预处理需要注意。
植物:
(1)温度尽可能低。
(2)提取液的量要保证“充分浸入”。
(3)加入足量酚类吸附剂。
(4)加入足量氧化酶抑制剂。
(5)搅拌转速要恰当。
(6)pH要控制在合适范围,一般5.5~7。
动物:
(1)匀浆化前的预处理(冷冻)。
(2)提取物缓冲液的选择(中性)。
(3)蛋白酶抑制剂的添加。
(4)保护剂的添加(β-巯基乙醇、EDTA、辅酶等)。
(5)提取液的澄清(高速离心、沉淀、吸附等)。
4、请说明微生物发酵液的预处理过程的主要目标是什么?
有哪些主要方法及特点。
(1)发酵液杂质的去除。
发酵成分复杂,对提取影响最大的是高价无机离子和杂蛋白,主要影响后期离子交换、萃取、膜过滤等。
①无机离子的去除:
钙离子:
加入草酸形成沉淀,酸化发酵液,草酸钙还能促使蛋白质凝固;镁离子:
加入三聚磷酸钠可与之形成可溶性络合物,可不再干扰离子交换;铁离子:
加黄血盐使其形成普鲁士蓝沉淀。
②可溶性蛋白质的去除:
盐析、等电点沉淀、加热法、有机溶剂沉淀法、吸附法、其它沉淀法。
③有色物质的去除:
常用脱色方法为吸附法,如活性炭吸附、树脂吸附等。
(2)改善发酵液的处理性能。
细菌及某些放线菌菌体细小,发酵液粘度大,往往不能直接过滤,直接用离心法实现,则能耗很大,应用微滤的方法,又容易产生膜堵塞。
需要通过一些简单手段降低发酵液粘度,改善处理性能。
方法:
降低发酵液的粘度、加热法和加水稀释法、调节pH值:
因pH直接影响发酵液中某些物质的电离度和电荷性质,通过调节pH值可以改善过滤特性。
5、请说明提取液的澄清方法有哪些,原理及选择依据。
方法:
(1)粒子聚结(增大d),25%(NH4)2SO4处理,适用动物细胞。
(2)降低提取液粘度,可用水解酶法或选择性沉淀法除去。
适于微生物细胞。
(3)其他方法:
①80%硫铵或55%丙酮,使Pr沉淀而类树胶不沉淀;②吸附法;③改善破碎方法。
6、何谓透析盐析、何谓反抽提法?
它们的特点和选择依据是什么?
透析盐析:
将Pr溶液盛于透析袋中,放入一定浓度的盐溶液中,由于渗透压的作用,袋中盐浓度连续性变化,使Pr沉淀。
特点:
避免共沉淀,分离效果好,处理量小。
反抽提法:
将包括要分离的Pr在内的多种Pr一起沉淀出来,然后选择适当的递减浓度的硫酸铵来抽提沉淀物。
特点:
得率较高。
第三章膜分离技术
1、何谓“浓度极化”和“凝胶极化”现象,怎样避免膜过滤中的“浓度极化”现象?
(1)浓度极化:
在膜分离操作中,所有溶质均被透过液传送到膜表面上,不能完全透过膜的溶质受到膜的截留作用,在膜表面附近浓度升高。
这种在膜表面附近浓度高于主体浓度的现象称为浓度极化或浓差极化。
它是一个可逆过程,只有在膜过程运行中产生存在,停止运行,浓差极化逐渐消失。
克服极化的主要措施有:
振动、搅拌、错流、切流等技术。
凝胶极化:
膜表面附近浓度升高,增大了膜两侧的渗透压差,使有效压差减小,透过通量降低。
当膜表面附近的浓度超过溶质的溶解度时,溶质会析出,形成凝胶层。
当分离含有菌体、细胞或其他固形成分的料液时,也会在膜表面形成凝胶层。
这种现象称为凝胶极化。
2、简述微滤膜的主要种类,特点和主要分离机理。
微滤膜的分类:
(1)有机微滤膜:
具有韧性,适应性强,制备简单,易成形,工艺较成熟。
常用聚乙烯、聚偏氟乙烯和聚四氟乙烯等聚烯烃类聚合物组成。
(2)无机微滤膜:
无机陶瓷膜具备化学稳定性好、机械强度大、抗污染能力强、耐高温、孔径分布窄、可高压反冲洗、再生能力强、分离效率高、不易老化等优点。
(3)复合微滤膜:
充分利用了有机与无机微滤膜的各自优点:
①将一层微滤膜的薄膜和常规过滤介质利用层压技术复合在一起;②通过不同的工艺手段实现有机与无机的黏合改性;③将微滤膜技术与生物处理法相结合的新型复合式膜生物反应器。
分离机理:
膜的过滤行为与膜及过滤对象的物理化学特性有关,对微滤而言,其分离机理主要是筛分截留。
液固分离主要作用:
(1)筛分,膜将尺寸大于孔径的颗粒截留。
(2)吸附,膜将尺寸小于孔径的颗粒吸附截留。
(3)架桥,固体颗粒在膜微孔入口处因架桥而被截留。
(4)网络,截留发生在膜内部,因膜孔的曲折而形成。
(5)静电,分离悬浮液含带电颗粒时可采用带相反电荷的微滤膜。
用孔径比待分离的颗粒尺寸大许多的微滤膜,不仅可达到较好的分离效果,还可获较高通量。
3、膜选择和使用时考虑的主要参数是什么?
影响流率的主要因素是什么?
(1)截留分子量:
指截流率达90%以上的最小被截留物质的分子量。
(以球形分子测)一般选用的膜的额定截留值应稍低于所分离或浓缩的溶质分子量。
(2)流动速率:
指在一定压力下每分钟通过单位面积膜的液体量。
(ml/cm2。
min)。
其它还有操作温度、化学耐受性、膜的吸附性能、膜的无菌处理等等。
影响流率的因素:
(1)溶质的分子性质,比重大的纤维分子扩散性差,比重较小的球形分子易扩散。
(2)溶质浓度:
一定压力下,稀比浓流率高。
(3)压力:
不同溶质应选择不同的操作压力。
(4)搅拌:
加快扩散,减少浓度极化,提高流率;对切力敏感的大分子(酶、核酸)须控制搅拌速度。
(5)温度:
升温能提高流率(不同溶质生物分离原理与技术-3-区别对待)。
(6)其它:
如溶液pH、离子强度及溶剂因素等对流率均有影响。
4、从原理上比较超滤和纳滤两种膜过滤技术,简要说明它们的主要差别。
超滤:
以特殊超滤膜为分离介质,以膜两侧的压差为推动力,将不同分子量物质选择性分离。
最小截留分子量500道尔顿。
用途:
⑴大分子物质脱盐和浓缩;⑵小分子物质纯化;⑶大分子物质分级分离;⑷生化制剂或其它制剂去热原处理纳滤技术。
纳滤是介于超滤与反渗透之间的膜分离技术,其截留分子量在200-1000的范围内,孔径为几纳米。
截留小分子有机物同时透析出盐,集浓缩与透析一体;在保证一定膜通量的情况下,纳滤所需压力比反渗透低的多,可节约动力。
5、超滤的工作模式有哪几种,各种工作模式的主要特点是什么。
超滤的工作模式有:
(1)浓缩:
在浓缩悬浮粒子或大分子过程中,产物被膜系统截留在料液罐中。
(2)透析:
在悬浮粒子或者大分子透析过滤中产物被膜截留住,低分子量溶质盐、蔗糖、醇则通过膜。
(3)纯化:
采用这一工作模式纯化溶剂和低分子量溶质,他们被回收在透过液流中,可是在截留的物质中也可能同样含有感兴趣的产物。
第四章层析分离技术
1、何谓层析的固定相、流动相、迁移率、分辨率?
固定相:
是层析的基质,可以是固体物质(如吸附剂,凝胶,离子交换剂等),也可以是液体物质(如固定在滤纸、硅胶或纤维素上的溶液),这些基质能与待分离的化合物进行可逆的吸附,溶解,交换等作用,对层析的效果起关键的作用。
流动相:
指在层析过程中,推动固定相上待分离的物质朝着一个方向移动的液体、气体或超临界体等。
柱层析中一般称为洗脱剂,薄层层析时称为展层剂。
它也是层析分离中的重要影响因素之一。
迁移率Rf:
指在一定条件下,在相同的时间内某一组分在固定相移动的距离与流动相本身移动的距离之比值。
迁移率的差异程度往往是决定几种物质采用层析方法能否分离的先决条件。
分辨率Rs:
是用来描述两种物质之间分离效果的好坏参数,其定义是两个洗脱峰峰顶对映的洗脱体积之差比上两峰在基线上峰宽的和的平均值。
2、简述吸附剂的主要类型和特点。
常用吸附剂按其化学结构可分两类:
(1)有机吸附剂,如:
活性炭、纤维素、大孔吸附树脂、聚酰胺等;
(2)无机吸附剂,如:
硅胶、氧化铝、硅酸镁、硅藻土、羟基磷灰石等。
常用吸附剂简介:
硅胶:
是一种极性吸附剂,又是一种弱酸性阳离子交换剂,其表面上的硅醇基能释放弱酸性的氢离子,遇较强碱性化合物,则可因离子交换反应而吸附碱性化合物。
应用于萜类、固醇、生物碱、酸性化合物、磷脂、脂肪、氨基酸等的吸附分离。
氧化铝:
对于分离一些碱性中草药成分,如生物碱类颇为理想;用稀硝酸或稀盐酸处理氧化铝,不仅可中和含有的碱性杂质,并可使颗粒表面带有阴离子,具离子交换剂的性质,适合于酸性成分的层析,这种氧化铝称为酸性。
氧化铝;经不同的处理还可得到中性氧化铝或碱性氧化铝,它们分别适用于不同物质的分离。
活性炭:
是使用较多的一种非极性吸附剂。
一般选用颗粒活性炭,主要用于分离水溶性成分,如氨基酸、糖类及某些甙。
活性炭的吸附作用,在水溶液中最强,在有机溶剂中则较低。
故水的洗脱能力最弱,而有机溶剂则较强。
羟基磷灰石:
羟基磷灰石具有多孔结构。
HA的吸附机理:
HA机理的主要观点是:
HA的Ca2+和生物分子表面的负电荷基团的结合,对生物分子的分离起重要作用;而HA的磷酸基团与生物分子表面的正电荷基团的结合,则起次要作用。
大孔吸附树脂:
特点:
大孔型颗粒,其孔隙、骨架结构和极性可按需要选不同的原料和合成条件而改变;借助范德华力吸附有机物质,不受无机盐干扰;解吸容易、机械强度好、可反复使用。
3、简要阐述影响吸附层析效果的主要因素。
吸附层析的分离效果,决定于吸附剂、溶剂、被分离化合物的性质及吸附条件等因素。
吸附剂的性质:
吸附剂的比表面积、颗粒度、孔径、极性对吸附的影响很大。
比表面积越大,空隙度越高,吸附容量越大;而颗粒度越小,吸附速度就越快。
一般要吸附相对分子量大的,要选择孔径大的吸附剂;吸附相对分子量小的则选择比表面积高及孔径小的。
洗脱剂(溶剂):
极性吸附剂层析时,当被分离物质为弱极性物质,一般选用弱极性溶剂为洗脱剂;被分离物质为强极性成分,则须选用极性溶剂为洗脱剂。
而对非极性吸附剂,如活性炭,则正好与上述顺序相反。
被分离物质的性质:
在指定的吸附剂与洗脱剂的条件下,各个成分的分离情况,直接与被分离物质的结构与性质有关。
吸附条件:
温度:
吸附一般是放热的,升高温度会使吸附量降低;蛋白质或酶类的吸附却往往是吸热的,升高温度会使吸附量提高,但需注意热稳定性。
pH:
溶液的pH往往会影响吸附剂或吸附物的解离情况,进而影响吸附量,一般需通过具体实验来确定。
盐的浓度:
影响比较复杂,对不同物质不同,需要考察后确定。
4、名词解释:
(1)排阻极限;
(2)分级范围;(3)死体积;(4)外水体积(V0);生物分离原理与技术-4-(5)内水体积(Vi);(6)常用的层析分离介质的名称(如SephadexG-75);(7)交换容量和有效交换容量;(8)陶南效应。
排阻极限:
是指不能进入凝胶颗粒孔穴内部的最小分子的分子量。
所有大于排阻极限的分子都不能进入凝胶颗粒内部,直接从凝胶颗粒外流出,所以它们同时被最先洗脱出来。
排阻极限代表一种凝胶能有效分离的最大分子量,大于这种凝胶的排阻极限的分子用这种凝胶不能得到分离。
分级范围:
即能为凝胶阻滞并且相互之间可以得到分离的溶质的相对分子质量范围。
死体积:
本意是指色谱柱中未被固定相占据的空隙体积,也即色谱柱内流动相的体积外水体积:
色谱柱内凝胶颗粒间隙,这部分体积称外水体积,亦称间隙体积,常用Vo表示。
内水体积:
因为凝胶为三维网状结构,颗粒内部仍有空间,液体可进入颗粒内部,这就分间隙的总和为内水体积,又称定相体积,常用Vi表示。
交联葡聚糖凝胶(Sephadex):
骨架:
葡聚糖(dextran);主链:
α-1,6-糖苷键(约95%);分支:
α-1,3-糖苷键(约5%);交联剂:
环氧氯丙烷以醚键交联;控制葡聚糖与交联剂比例可制造不同孔径凝胶。
G-X可表示型号,X从10-200,G-X,X=25、75、200,X表示10g干胶的吸水量ml。
交换容量:
指离子交换剂能结合溶液中可交换离子的能力,分为总交换容量和有效交换容量。
有效(实际)交换容量:
指在一定的实验条件下,每克干介质或每毫升湿胶吸附某种蛋白质的实际容量。
陶南效应:
离子交换剂表面pH与溶液pH是不一致的。
在阳IE表面的微环境中,H+被吸引而OH-被排斥,交换剂表面pH比周围低1个pH单位;而阴IE表面的微环境中,OH-被吸引而H+被排斥,交换剂表面pH比周围高1个pH单位。
5、凝胶过滤层析中Kd的意义是什么?
为什么它一般在0和1之间,大于1和小于0的反常情况可能是什么原因?
怎样处理?
Kd分配系数=固定相溶质的浓度/流动相溶质的浓度,A类分子只走外水体积,所以Kd=0;C类分子走所有的外水体积和内水体积,Kd=(Ve-V0)/Vi,所以Kd大于0小于1。
溶质洗脱的异常⑴Kd〈0,因装柱不好,发生沟流(短路);⑵Kd〉1,凝胶对溶质分子可能有吸附作用。
6、分子量为1千和3千的一组分子,或分子量为8万和10万一组分子能否在SephadexG-75柱中分开?
为什么?
因为sephadeG-75的分离范围为10000到50000所以两组分子都在分离范围之外,不能很好的分离。
7、伴刀豆球蛋白、血纤维蛋白、香菇多糖的分子质量能否一起用葡聚糖凝胶层析柱测定?
为什么?
凝胶过滤层析,是根据凝胶颗粒具三维网状结构,可对大小不同的分子流动产生不同的阻滞作用,但是以上三种大分子物质的结构不同,这就会影响其在凝胶中的分配比。
球状的蛋白要比血纤维的蛋白走的快,因此分离的最后效果,不仅和分子量大小有关,而且和分子的形状有关,所以不能直接用来测定三种的分子量大小。
可以先将他们变性,使其有相类似的结构,然后再测定。
8、层析系统的分辨率主要取决于什么参数,何种最重要?
以离子交换层析为例,如果优化实验条件以提高分辨率?
层析系统的分辨率主要取决于:
选择性α,效率n,和k′容量因子三个参数。
选择性较为重要。
容量因子k′又称保留因子,是层析分离中常用的组分保留值表示法,注意不要将其与离子交换剂的吸附容量(mg样品/ml胶)相混淆。
一般来说,容量因子k′的取值与蛋白质在固定相(离子交换剂)和流动相(缓冲液)中的分配性质、层析温度及固定相和流动相的体积比有关,而与柱尺寸和流速无关。
提高RS以达满意分离效果,须满足以下条件:
(1)α>1(当VR1=VR2时α=1,两峰完全重叠,分辨率为0),α的值越大,两峰相距越远,分辨率越高;
(2)N尽可能大,理论塔板数越大,柱效率越高,分辨率也越高;(3)k′≠0,若k′=0,无法实现分离,分辨率为0,需选合适层析条件,使至少一种蛋白质在离子交换剂上发生吸附,就能满足k′≠0,增加k′的值将提高分辨率RS,有利于分离。
9、装填制备合格的层析柱主要应注意哪几点?
如何检验?
如何保养?
·
(1)用缓冲液将层析柱底部死空间内的空气排空。
(2)预处理的离子交换剂放置在烧杯中,使得交换剂:
上清液(v/v)=3:
1,轻微搅拌混匀。
(3)利用玻棒引流尽可能一次性将介质倾入层析柱,注意液体应沿着柱内壁流下。
(4)当需要往柱内补加交换剂时,应将沉降表面轻轻搅起,然后再次倾入,防止两次倾注时产生界面。
(5)对装柱情况进行检查。
·
(1)柱尺寸(H/D);连续梯度:
H/D4~5;阶段式梯度:
H/D1~2;
(2)充填;(3)平衡:
2~3Vt始缓平衡,测定电导、pH是否平衡完毕:
目的:
①床体积稳定②流出液pH、I一致样品;测完后清洗。
10、离子交换剂由哪几部分组成?
何为阳离子和阴离子交换剂?
离子交换剂由水不溶性基质(支持物)和共价结合在基质上的带电功能基团组生物分离原理与技术-5-成,带电功能基团上还结合有可移动的与功能基团带相反电荷的平衡离子。
离子交换剂很大程度上决定着分离过程的分辨率,分离的规模和成本。
具有阳离子交换功能基因的离子交换剂称阳离子交换剂;具有阴离子交换功能基因的离子交换剂称阴离子交换剂。
11、弱酸性和弱碱性的离子交换剂分别适宜在哪些pH范围内使用?
为什么?
弱酸性和弱碱性的离子交换剂即对应弱阳离子交换剂和弱阴离子交换剂。
弱酸性阳离子交换剂在pH值降低时,其电离率逐渐降低,离子交换能力逐渐减弱;弱碱性阴离子交换剂在pH值升高时,其电离率逐渐降低,离子交换能力逐渐减弱。
前者因为其功能基团解离范围在酸性范围,所以只能在低于7的pH范围使用,一般3-5之间使用,后者往往在6-9范围,具体范围与所以选择的功能基团的解离情况有关。
12、已知目标蛋白是分子量约200,000,等电点为6.8,pH稳定范围在4.0~7.5的酶分子,如何选择离子交换剂并设定层析条件?
因目标蛋白的pH稳定范围在4.0~7.5之间,而且pI为6.8,故应选择pH<6.8。
pH<6。
8范围内的宽度大,一般选择pH为5.8或5.5左右(考虑陶南效应)。
同时应选择阴离子交换剂,选择强阴离子(如磷酸基团)。
CM基团在pH6左右带负电荷。
目标蛋白分子量约为200,000,因此选择G-50或者G-25均不行。
故应选择琼脂糖或者纤维素。
基于强酸基团应选择Sepharose离子交换剂,弱阳离子交换剂CM(pH3.5-6),流动相的pH5,流速1cm/min。
13、在对某样品进行离子交换层析分离后得到如下层析图谱,层析采用了NaCl浓度梯度洗脱,NaCl终浓度为1mol/L,如何根据此层析结果优化层析条件?
(*号标记的是目标蛋白)
此层析结果已经很好,目标蛋白已经和杂质很好的分离开。
并且目标蛋白洗脱位置也已经很合适。
如果想要进一步优化:
(1)通过改变梯度的形状和斜率来提高分辨率,也可以根据目的物被洗脱的盐浓度确定进行阶段洗脱的条件。
(2)梯度的高度和斜率也影响着分离的速度和效果。
(3)适当的降低洗脱过程的流速可以提高色谱的分辨率。
14、试比较亲和层析的特异性洗脱和非特异性洗脱的优缺点。
特异性洗脱非特异性洗脱优点1、一般在中性条件下进行,比较温和,不会导致蛋白质变性。
2、特异性强,可以进一步消除非特异性吸附的影响,从而得到较高的分辨率。
洗脱方式简单。
缺点价格可能会比较高,且洗脱下来的蛋白质可能很难与洗脱液分离,这时可用凝胶过滤色谱进行脱盐解吸或者透析分离。
1、但洗脱体积一般比较大,得到的待分离物质浓度较低。
2、对于与配体亲和力很强的分离物质,往往要采用很强洗脱条件才能进行分离,但可能会使待分离物质发生不可逆变性。
15、亲和层析吸附剂制备时,为何常引入“连接臂”?
当配体比较小,而待分离生物分子较大时,由于载体表面的临近效应会限制配体与生物分子结合,这是通过连接臂连接配体和载体,就不会阻止配体与生物分子结合。
连接臂的作用就是消除配体的空间位阻。
16、简述亲和层析吸附剂制备的主要方法和步骤。
⑴要求:
①L与基质结合,对L-S结合无干扰;②L为小分子有的需“
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