抗氧化活性测定方式.docx
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抗氧化活性测定方式.docx
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抗氧化活性测定方式
总黄酮测定方式
仪器与设备:
1.恒温混匀仪BG-200(杭州朗基科学仪器)
2.移液枪(p1000,p200)
3.分析天平(SHIMADZUPHILIPPINESMANUFACTURINGINC.AUY220日本岛津)
4.15×150mm玻璃试管
5.具塞玻璃试管,10mL
6.容量瓶,1000,100,10mL
7.紫外-可见分光光度计(UV-1800日本岛津)
试剂:
1.硼氢化钠(成都市科隆化工试剂厂,NaBH4,FW,粉末,分析纯,≥%)避光干燥保留。
2.三氯化铝(天津博迪化工股分,AlCl3·6H2O,FW165,分析纯,晶体,≥%)
3.四氯苯醌,AladdinIndustrialCorporation中国上海,≥98%,分析纯)
4.乙醇(EtOH)(成都市科隆化工试剂厂,,无水乙醇,≥%,分析纯)
5.四氢呋喃(THF)(广东广华科技股分,FW,≥%,分析纯)
6.冰乙酸(成都市科隆化工试剂厂,,%,分析纯)
7.盐酸(成都市科隆化工试剂厂,%-37%w/v,12M,分析纯)
8.槲皮素(国药集团化学试剂,,≥98%,生化试剂BR)
9.香兰素(天津博迪化工股分,,≥%,分析纯)
试剂配制:
1.,,,,,,,,mM槲皮素溶液,溶剂为四氢呋喃:
乙醇(THF:
EtOH)=1:
1。
配制10mM槲皮素标准溶液:
准确称取mg槲皮素,用上述溶剂定溶至50mL容量瓶。
2.mMNaBH4乙醇溶液:
称取mgNaBH4,无水乙醇溶解,定容100mL容量瓶。
(不宜长期保留;松开盖子以防炸裂)
3.mMAlCl36H2O乙醇溶液(含有1%H2O)
称取gAlCl36H2O,1mL水溶解,加入适量无水乙醇,后定容100mL容量瓶(贮存防潮)。
4.mM四氯苯醌四氢呋喃溶液
称取mg四氯苯醌,四氢呋喃(THF)溶解定容100mL.
5.M冰乙酸溶液
称取冰乙酸,蒸馏水定容100mL.
6.16%(w/v,1052mM)香兰素甲醇溶液
称取g香兰素,甲醇定容100mL.
操作步骤:
1.用移液管准确移取、、、、、、、、配置好的10Mm槲皮素标液于10mL容量瓶,用THF/EtOH(1:
1,v/v)溶液定容。
用移液枪移取槲皮素各浓度梯度标液1mL或花椒叶各相浸膏稀释样液(5mg/mL)1mL于玻璃试管中(样液必需现配先用),空白采纳THF/EtOH(1:
1,v/v)溶液1mL。
2.含有1mL样液或1mL槲皮素标液的试管中,加mLmMNaBH4溶液,mLmMAlCl3溶液,后在室温下于红外转子摇床内摇30min.再加mLmMNaBH4溶液,摇30min。
3.加mL冰的(4ºC)M冰乙酸溶。
避光,试管内溶液晃匀后,摇晃15min。
4.加入1mLmM四氯乙醌,后于红外转子摇床内,95ºC反映60min。
5.反映完全后,自来水冷却。
6.甲醇转出,至少两次,定容具塞试管于4mL刻度线处。
7.加入1mL16%香兰素甲醇溶液,2mL12MHCl浓盐酸,混匀后室温(20-25ºC)下避光保留15min。
8.于490nm下测定吸光度值,每一个样液重复三次。
9.数据处置。
总黄酮含量表示为:
mmol槲皮素/g样品或浸膏。
数据为三组重复的mean±SD。
数据处置:
1.标准曲线:
黄酮测定标曲制作原始数据:
槲皮素标准液浓度mM
Abs1
Abs2
0
1
2
4
5
6
8
10
黄酮测定标曲制作原始数据的系统性描述
槲皮素浓度mM
Mean
Std.Deviation
Std.Error
95%置信区间
Minimum
Maximum
LowerBound
UpperBound
0
1
2
4
5
6
8
10
回归方程及标准曲线:
用表格内红色数据绘制,绘制时需减去空白溶液的吸光度值,以吸光度为纵坐标,浓度为横坐标,绘制标准曲线。
y=+;R2=,X:
浓度mM
2.计算公式:
大红袍花椒叶不同极性溶液萃取浸膏黄酮含量测定原始数据:
A
B
C
D
E
F
标液校正
空白
Abs1
Abs2
Abs3
黄酮含量(mmol槲皮素/g)=C2V2/C1V1
C2=(Y-)/mM
V2=显色液的整体积。
7mL。
C1=样品液的初始浓度。
如花椒叶为5mg/mL。
V1=加到显色管初始浓度样品溶液体积。
7mL。
例如:
选取上面表格内A1Abs值减去空白对照吸光度平均值,得,带入黄酮测定回归方程y=+得:
C2=,计算的黄酮含量=mmol槲皮素/g。
最后的数据均为三次重复的平均值±标准误差。
酸性染料比色法测定花椒总生物碱的含量
仪器与材料
紫外一可见分光光度计(UV-1800日本岛津);
白屈菜红碱标准品(上海融禾医药科技进展,FW,白色结晶粉末,≥%),溴甲酚绿(天津博迪化工股分,FW,分析纯),
磷酸二氢钠(天津博迪化工股分,NaH2PO4·2H2O,,分析纯)
磷酸氢二钠(天津博迪化工股分,Na2HPO4·12H2O,FW,分析纯)
试剂配制:
(1)pH值为7.6的缓冲溶液的配制:
0.2mol/LNaH2PO4(13.0mL)和0.2moL/LNa2HPO4(87.0
mL),酸度计校正为7.6。
(2)溴甲酚绿溶液的配制
称取0.05g溴甲酚绿加入磷酸缓冲液(pH值=7.6),定容至100mL,制得溴甲酚绿缓冲液。
(3)标准溶液的配制
称取5mg白屈菜红碱样品加入无水乙醇,定容至20mL,制得白屈菜红碱标准溶液(0.25mg/mL)。
操作步骤:
标准曲线的绘制方式
别离吸取1,2,3,4,5mL对照品溶液,置于20mL试管中,加水补至5mL。
测按时,各吸取标液1mL(空白采纳1mL无水乙醇),依次加入溴甲酚绿磷酸缓冲液1mL和5mL氯仿溶液,振摇1min后,倒入分液漏斗中静置60min,分取氯仿层,在425nm波长下测吸光度值,以生物碱含量(单位:
mg/ML)为横坐标,吸光度值为纵坐标,做标准曲线。
花椒生物碱含量测定:
取花椒叶样液1mL,依照上述标曲方式,依次周密加入溴甲酚绿磷酸缓冲液1mL和5mL氯仿溶液,振摇1min后,倒入分液漏斗中静置1h,分取氯仿层,在425nm波长下测吸光度值。
将测得的吸光度值代人标准曲线。
数据处置:
标准曲线:
生物碱测定标曲制作原始数据:
白屈菜红碱浓度mg/mL
Abs1
Abs2
Abs3
0
生物碱测定标曲制作原始数据的系统性描述
白屈菜红碱浓度mg/mL
Mean
Std.Deviation
Std.Error
95%置信区间
Minimum
Maximum
LowerBound
UpperBound
0
回归方程及标准曲线:
用表格内红色数据绘制,绘制时需减去空白溶液的吸光度值,以吸光度为纵坐标,浓度为横坐标,绘制标准曲线。
y=+;R²=
计算公式:
大红袍花椒叶6种洗脱相浸膏生物碱含量测定原始数据:
A
B
C
D
E
F
空白
1Abs
2Abs
3Abs
生物碱含量(mmol白屈菜红碱/g)=C2V2/C1V1/
C2=(Y-/(mg/mL)
V2=显色液的整体积(氯仿层)。
10mL。
C1=样品液的初始浓度。
如花椒叶为mL。
V1=加到显色管初始浓度样品溶液体积。
1mL。
例如:
选取上面表格内A1Abs值减去空白对照吸光度平均值,得,带入生物碱测定回归方程y=+得:
C2=mg/mL,计算得生物碱含量=mmol白屈菜红碱/g。
最后的数据均为三次重复的平均值±标准误差。
花椒叶中总酚含量测定方式
前言:
大红袍花椒叶预处置,适当粉碎,称取5g花椒叶粉末,80%冰丙酮100mL,4℃,提取30min,真空抽滤,搜集滤液,残渣再次用80%冰丙酮100mL,4℃,提取30min,抽滤,归并滤液,薄膜蒸发仪旋蒸至粘稠状,80%乙醇溶解,定容100mL容量瓶,-20℃冰箱保留备用。
材料:
∙试管
∙50mL容量瓶
∙50mL烧杯
∙125mL三角瓶
∙250mL圆底烧瓶
∙紫外一可见分光光度计(UV-1800日本岛津)
∙移液管Pipette
∙蒸馏水
∙福林酚(SigmaF-9252,2MAcid)
∙没食子酸·一水,科帮生物)
∙无水碳酸钠(天津博迪化工股分,FW)
操作步骤:
1.福林酚试剂(FCR):
Sigma,F-9252,Lot#:
50K5416,不需稀释。
2.7%碳酸钠溶液(Na2CO3,FW=
称取7g无水碳酸钠,溶解于约25mL蒸馏水中,然后转移到100mL容量瓶中,再用蒸馏水定容至刻度线。
3.将冰冻的样品放到37℃水浴锅中解冻。
4.预备没食子酸母液及标液
母液
:
称取没食子酸(一水),即25mg没食子酸,再用蒸馏水定容到25mL容量瓶中。
母液
:
吸取5mL母液必然容到50mL容量瓶中。
设置没食子酸的浓度梯度为、、、、、、、、、mL。
没食子酸梯度标液配制
标液浓度(μg/mL)
没食子酸母液
(mL)
蒸馏水加入量(mL)
标液浓度(μg/mL)
没食子酸母液
(mL)
蒸馏水加入量(mL)
5.别离吸取200ul的样液(必要时可稀释)或没食子酸标液(空白采纳蒸馏水)于试管中。
做三个重复。
6.每一个试管中加入800ul蒸馏水,摇匀。
7.再加入200ul福林酚试剂,摇匀,静置6min。
8.别离加入2000ul7%碳酸钠溶液,摇匀。
9.最后加入1600ul蒸馏水,混匀,室温,避光90min,并打开分光光度计预热中。
10.扫描最大吸收波长,在该波长下测定其吸光度。
本次实验多酚含量测定在772nm处测定吸光度值。
得出标曲的线性方程,计算样品没食子酸当量(mmol/g)。
11.多酚测定标曲制作:
数据处置:
标准曲线:
总多酚测定标曲制作原始数据:
没食子酸浓度ug/mL
Abs1
Abs2
Abs3
0
20
40
60
80
100
200
250
300
总多酚测定标曲制作原始数据的系统性描述
没食子酸浓度ug/mL
Mean
Std.Deviation
Std.Error
95%置信区间
Minimum
Maximum
LowerBound
UpperBound
0
20
40
60
80
100
200
250
300
回归方程及标准曲线:
用表格内红色数据绘制,绘制时需减去空白溶液的吸光度值,以吸光度为纵坐标,浓度为横坐标,绘制标准曲线。
y=+;R²=
计算公式:
大红袍花椒叶6种洗脱相浸膏总多酚含量测定原始数据:
A
B
C
D
E
F
标液校正
空白
Abs1
Abs2
Abs3
-
多酚含量(mmol没食子酸/g)=C2V2/C1V1/
C2=(Y-)/mM
V2=显色液的整体积。
。
C1=样品液的初始浓度。
如花椒叶为mL。
V1=加到显色管初始浓度样品溶液体积。
。
例如:
选取上面表格内A1Abs值减去空白对照吸光度平均值,得,带入多酚测定回归方程y=+,得:
C2=mg/mL,计算的多酚含量=mmol没食子酸/g。
最后的数据均为三次重复的平均值±标准误差。
.:
样品
黄酮测定样液浓度
多酚测定样液浓度
生物碱测定样液浓度
样液稀释用溶剂
A
乙醇相
5mg/mL
mL
mL
无水乙醇
B
石油醚相
5mg/mL
mL
mL
无水乙醇
C
氯仿相
5mg/mL
mL
mL
无水乙醇
D
乙酸乙酯相
5mg/mL
mL
5mg/mL
无水乙醇
E
丙酮相
5mg/mL
mL
5mg/mL
50%乙醇
F
甲醇相
5mg/mL
mL
5mg/mL
50%乙醇
大红袍花椒叶六种洗脱相成份测定
黄酮含量mmol槲皮素/g
多酚含量mmol没食子酸/g
生物碱含量mmol白屈菜红碱/g
A
±
±
±
B
±
±
±
C
±
±
±
D
±
±
±
E
±
±
±
F
±
±
±
i数据均为三次重复的平均值±标准误差,同一列中,相同字母表示两种洗脱相成份不同不显著。
ABTS法
原理:
ABTS法最先由Miller等人开辟,用于测定生物样品的抗氧化能力。
该方式是以ABTS[2,2'-azi-no-bis(3-ethylbenzthiazoline-6-sulfpnicacid),即2,2’-联氮-双-(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)。
这种水溶性的自由基引发剂为显色剂。
ABTS经活性氧氧化后生成稳固的蓝绿色阳离子自由基ABTS•+,向其中加入被测物质,若是该物质中存在抗氧化成份,那么该物质会与ABTS•+发生反映而使反映体系褪色,然后在ABTS•+这种自由基的最大吸光波长下(一样选择734nm)检测吸光度的转变,与含Trolox(6-Hydroxy-2,5,7,8-tetramethylchroman-2-carboxylicAcid),一种类似于VE的水溶性物质的对照标准体系比较,换算出被测物质总的抗氧化能力,结果多表示为每g测试物质相当的抗氧化能力所需要的Trolox的微摩尔数,因此也把该方式称为TEAC(Troloxequivalentantioxidantcapacity)法,也有研究者提出用抗坏血酸作为对照标准,将该方式称为VCEAC或AEAC法。
ABTS•+清除率(%)=(Acontrol−Atest)*100/Acontrol
Acontrol:
对照管吸光值Atest:
待测样品吸光值
仪器设备:
●50mL锥形瓶
●50mL量筒
●10mL容量瓶
●50mL容量瓶
●100mL容量瓶
●1000mL容量瓶
●分析天平(SHIMADZUPHILIPPINESMANUFACTURINGINC.AUY220)
●移液枪(吉尔森,100-1000μl)
●封口膜
●真空泵
●抽滤瓶
●布氏漏斗
●定量滤纸
●旋转蒸发仪
●紫外-可见分光光度计(UV-1800日本岛津)
试剂:
●蒸馏水
●丙酮(C3H6O,成都市科龙化工试剂厂,分子量:
g/mol,含量≥%,分析纯AR)
●乙醇(C2H6O,成都市科龙化工试剂厂,分子量:
g/mol,含量≥%,分析纯AR)
●氯化钠(NaCl,西安化学试剂厂,分子量:
g/mol,含量≥%)
●氯化钾(KCl,天津博迪化工股分,分子量:
g/mol,含量≥%)
●磷酸氢二钠(Na2HPO4•12H2O,天津博迪化工股分,分子量:
mol,含量≥%)
●磷酸二氢钾(KH2PO4,天津博迪化工股分,分子量:
g/mol,含量≥%)
●浓盐酸(HCl,成都市科隆化工试剂厂,分析纯AR,%-37%w/v,12M)
●ABTS(C18H24N6O6S4,sigma,分子量mol,含量≥%,500元)
●过硫酸钾(K2S2O8,津博迪化工股分,分子量:
g/mol,含量≥%)
●水溶性维生素E(Trolox):
溶液配制:
1.10Mm(mol/L)PBS缓冲液:
称取8gNaCl,KCl,Na2HPO4•12H2O,,溶于900ml双蒸水中,用盐酸调pH值至,加水定容至1L,常温保留备用。
2.7mM(mol/L)ABTS溶液:
称取,用蒸馏水定容到10ml容量瓶。
3.LK2S2O8溶液:
称取K2S2O8,用蒸馏水定容到10ml容量瓶。
4.ABTS•+反映液:
将7mmol/LABTS溶液(现配)与LK2S2O8溶液(现配)按1:
1混合,反映留宿(12h-16h)制成ABTS•+储蓄液。
为了使ABTS•+反映液在30℃,734nm下的吸光值为士。
一样先用10mmol/L的PBS缓冲液稀释40倍,然后测其吸光值,再慢慢往里加10mmol/L的PBS缓冲液稀释成所需浓度。
5.Trolox标准液:
准确称取25mgTrolox,用80%乙醇溶解定容至100mL容量瓶,即配成1000umol/L将之作为母液,依次用80%乙醇配成800、600、400、200、100、25umol/LTrolox标准液。
4℃条件下保留备用。
6.样液制备:
a.别离称取粉碎的金露梅、银露梅和小叶金露梅叶片各2g,置于50ml锥形瓶中,并加入80%的冰丙酮,混匀,用封口膜将瓶口封好。
b.将锥形瓶置于4℃冰箱中浸提30min。
c.用真空泵将提取液抽滤出来。
d.滤渣掏出置于50ml锥形瓶中,再次加入80%的冰丙酮,混匀,用封口膜将瓶口封好。
重复步骤b—c,归并提取液。
e.将每种植物提取液用旋转蒸发仪浓缩成浸膏。
f.将浸膏用80%的乙醇溶解出来,并定容至100mL容量瓶中,即制成浓度为20mg/mL的金露梅、银露梅和小叶金露梅干叶提取液,别离稀释100倍mL),贮存于-24℃冰箱中,待测。
每种植物做三次平行。
(测之前先将样液解冻,预热至37℃)。
方式步骤:
1.打开分光光度计预热1h,调波长为734nm。
2.吸取100ul稀释100倍mL)的金露梅、银露梅和小叶金露梅样液于3只试管中,编号1′、2′、3′。
并吸取100ul以上7个不同浓度梯度的Trolox标液于7只试管中,编号0---6。
每一个样(标液)做三个平行实验。
3.别离往1′、2′、3′、0、一、二、3、4、五、6号试管中加入预热至37℃的ABTS•+反映液。
37℃水浴条件下反映10min。
4.反映完毕,于734nm条件下测定吸光度。
测得结果
trolox浓度(umol/L)
吸光值
0
25
100
200
400
600
800
1000
金露梅mL)
银露梅mL)
小叶金露梅mL)
带入公式求得清除率:
trolox浓度(umol/L)
清除率(%)
平均
0
25
100
200
400
600
800
1000
金露梅(mL)
银露梅mL
小叶金露梅mL)
标准曲线
图1Trolox清除ABTS自由基标准曲线
Fig1StandardcurveofTroloxscavengeABTS•+
以μmolTE/gDW为单位,求得金露梅、银露梅和小叶金露梅trolox当量(μmol/g)。
样品名称
trolox当量(umol/g)
FRAP法
原理:
Fe3+-TPTZ可被样品中还原物质还原为二价铁形式,呈蓝色,并于593nm处具有最大吸光值。
依照吸光度大小可计算出样品抗氧化活性的强弱。
由Benzie和Strain(1996)成立的FRAP法原理简单,操作简便,不需特殊仪器,易于标准化,己用于测定不同生物样品的抗氧化活性。
而且具有快速、重复性好等优势,FRAP法所测结果反映的不是样品针对某一种特定自由基的清除活性,而是样品总的还原能力,因此一些学者以为该法测定的结果可用于反映样品的总抗氧化活性。
仪器设备:
●50mL锥形瓶
●50mL量筒
●50mL容量瓶
●100mL容量瓶
●分析天平(SHIMADZUPHILIPPINESMANUFACTURINGINC.AUY220)
●移液枪(吉尔森,100-1000μl)
●封口膜
●真空泵
●抽滤瓶
●布氏漏斗
●定量滤纸
●旋转蒸发仪
●紫外-可见分光光度计(UV-1800日本岛津)
试剂:
●蒸馏水
●丙酮(C3H6O,成都市科龙化工试剂厂,分子量:
g/mol,含量≥%,分析纯AR)
●乙醇(C2H6O,成都市科龙化工试剂厂,分子量:
g/mol,含量≥%,分析纯AR)
●浓盐酸(HCl,成都市科隆化工试剂厂,分析纯AR,%-37%w/v,12M)
●三氯化铁(FeCl3•6H2O,天津博迪化工股分,分子量:
g/mol,含
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