会吐丝的蜜蜂.docx
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会吐丝的蜜蜂.docx
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会吐丝的蜜蜂
会吐丝的蜜蜂
摘要:
蚕运用自身体内发达的丝腺体造丝系统,能够造出光滑洁白的丝,蚕丝的应用越来越广泛,能够制成护肤品、蚕丝被、人造血管、丝素膜(人工皮肤)、蚕丝食品等等,那么,利用基因工程、动物细胞工程将蚕、蜘蛛的吐丝基因“安装”在蜜蜂身上,使蜜蜂既能够采集蜂蜜又能够吐丝,不仅增加蜜蜂的使用价值,而且给养殖户增加经济实用价值。
关键词:
蚕蜜蜂基因工程动物细胞工程
SpinningBee
(yeminyu,113grade,yanchenguniversitybiologyacademy,2013/12/10)
[Abstract]Asilkwormcanuseitsownstrongsilkglandsystemtomakesmoothandwhitesilk,inaddition,silkisbeenusedmoreandmorewidely.Itcanbemadeascosmetics,bedding,bloodtube,manmadeskin,silkfoodandsoon.Therefore,ifweuseGeneticengineeringandAnimalengineeringtoloadsilkglandsystemtobees,then,beesnotonlycancollecthoney,butalsocanspinsilk.Ifso,thevalueofbeesisimprovedandtheprofitfrombeesishopeful.
[Keywords]:
silkwormbeeGeneticengineeringAnimalengineering
正文:
蚕丝,是熟蚕结茧时分泌丝液凝固而成的连续长纤维,也称“天然丝”。
蚕丝是多孔性蛋白质纤维,具有良好的吸湿、散湿性能和含气、透气性能。
四肢物柔和舒适,具有独特的"丝鸣"特征。
它与羊毛一样,是人类最早利用的动物纤维之一,根据食物的不同,又分桑蚕、柞蚕、木薯蚕、樟蚕、柳蚕和天蚕等。
蚕丝纤维由两根呈三角形或半椭圆形的丝素外包丝胶组成,横截面呈椭圆形。
蚕丝纤维为蛋白质纤维,丝胶和丝素是其主要组成部分,其中丝素约占3/4,丝胶约占1/4。
丝胶和丝素由18种氨基酸组成,约含97%的纯蛋白质。
丝胶是水溶性较好的的球状蛋白质,将蚕丝溶解于热水中脱胶精练,就是利用了丝胶的这一特性。
由于丝胶和丝素的氨基酸组成不同,丝素为纤蛋白,丝胶为球蛋白。
桑蚕所吐之丝全长可达1000米以上。
蚕丝手触柔软而有弹性,蚕强伸力高,蚕耐热性好,绝缘性能好,染色性能良好,对酸的抵抗力比棉花强、比羊毛弱,丝素能吸附某些金属…
蚕丝不仅是丝绸织造最主要的原料,而且还可用于制成人造血管。
桑蚕丝人造血管在体内不会引起过敏或致癌作用,还可以与活体血肉相连,长成与真血管一样的外壁和内膜。
蚕丝还可开发成许多高科技副产品。
将桑蚕丝脱胶、溶解、透析提纯后,可制成“丝素膜”。
该膜专门用于烧伤创面覆面,有助于创面愈合,也称为“人工皮肤”。
由于桑蚕丝中含有对人体极具营养价值的18种氨基酸,人们根据蚕丝的这种特性,开发出以丝素为主要原料的化妆品系列。
天然蚕丝5大功效:
功效持久的保湿能力、自然抗皱,促进胶原蛋白的分泌、强效增白、抗UV作用、抗发炎、痘疱能力。
桑蚕丝还可以制成蚕丝蛋白供人们食用。
如今,在日本市场上已有加入了经裂解的蚕丝粉末的食品,如蛋糕、饼干、面条、果冻、冰淇淋、饮料、片剂、糖果等,受到了消费者的欢迎。
此类食品含有18种氨基酸,脂肪、碳水化合物等含量较少,因而被视为一种健康的绿色食品。
目前我国也正在开发研制这种丝质食品。
相信在不久的将来,我们也可以享用国人自己生产的丝质食品了。
工业领域上加工成微粒的丝粉,除用于化妆品或保健食品的添加剂外,还可制成含丝粉的绢纸或食品保鲜用的包装材料和具有抗菌性的丝质材料。
丝素膜除用于加工隐形眼镜片外,还可将细至0.3μm的丝粉与树脂混合,开发出被称为¨丝皮革"的新产品。
将丝粉调入某些涂料中制成的高级涂料,用来喷涂家具用品,能增加器物的外观高雅与触感良好的效果,广泛用于各种室内装璜。
蚕之所以能够吐丝,是在蚕虫的身体内,有一套结构完整、构造复杂的叫做丝腺体的造丝系统。
丝腺体连接著头部下面叫做挤压器的吐丝泡,由这两个基本部件组成一台“天然纺织机”。
一只老熟幼虫的身体内,有两列细胞组成的丝腺体,它要比身体长5倍,并且与贮藏丝液的袋状囊相通。
头上的挤压器与周围的肌肉连接著,蚕儿吐丝时,头上的肌肉不停地伸缩,将丝腺体中的丝液抽压出来,丝液与空气接触后,便形成细长的丝。
因此,本论文主要是将蚕的吐丝基因“安装”到蜜蜂体内。
实验方法:
基因工程、动物细胞工程
实验步骤:
1.细胞培养基本步骤:
1.1把冻存管从液氮中取出来,立即投入37℃水浴锅中,轻微摇动。
液体都融化后(大概1-1.5分钟),拿出来喷点酒精放到超净工作台里。
1.2把上述细胞悬液吸到装10ml培养基的15ml的离心管中(用培养基把冻存管洗一遍,把粘在壁上的细胞都洗下来),1000转离心5分钟。
1.3把上清液倒掉,加1ml培养基把细胞悬浮起来。
吸到装有10ml培养基的10cm培养皿中前后左右轻轻摇动,使培养皿中的细胞均匀分布。
标好细胞种类和日期、培养人名字等,放到CO2培养箱中培养,细胞贴壁后换培养基。
3天换一次培养基。
1.4培养皿中的细胞覆盖率达到80%-90%时要传代。
把原有培养基吸掉。
加适当的胰蛋白酶(能覆盖细胞就行),消化1-2分钟。
细胞都变圆后加如入等体积的含血清的培养基终止消化。
用移液枪吹打细胞,把细胞都悬浮起来。
1.5把细胞吸到15ml的离心管中,1000转离心5分钟。
1.6倒掉上清液,加1-2ml培养基,把细胞都吹起来。
1.7根据细胞种类把细胞传到几个培养皿中。
一般,癌细胞分5个,正常细胞传3个。
继续培养。
【注:
培养基:
培养基(Medium)是供微生物、植物和动物组织生长和维持用的人工配制的养料,一般都含有碳水化合物、含氮物质、无机盐(包括微量元素)以及维生素和水等。
培养基由于配制的原料不同,使用要求不同,而贮存保管方面也稍有不同。
一般培养基在受热、吸潮后,易被细菌污染或分解变质,因此一般培养基必须防潮、避光、阴凉处保存。
对一些需严格灭菌的培养基(如组织培养基),较长时间的贮存,必须放在2~6℃的冰箱内。
由于液体培养基不易长期保管,现在均改制成粉末。
牛肉膏琼脂培养基:
牛肉膏0.3g,蛋白胨1.0g,氯化钠0.5g,琼脂1.5g,水100ml
在烧杯内加水100毫升,放入牛肉膏、蛋白胨和氯化钠,用蜡笔在烧杯外作上记号后,放在火上加热。
待烧杯内各组分溶解后,加入琼脂,不断搅拌以免粘底。
等琼脂完全溶解后补足失水,用10%盐酸或10%的氢氧化钠调整pH值到7.2~7.6,分装在各个试管里,加棉花塞动物细胞培养基。
RPMI1640培养基是一个全营养型培养基,广泛应用于哺乳动物细胞和杂交瘤细胞的培养,如人骨髓瘤细胞、鼠杂交瘤细胞、人白细胞以及B细胞和T细胞。
最初设计用于悬浮细胞培养和人白血病细胞的单层细胞培养,用高压蒸汽灭菌:
1.05千克每平方厘米、121摄氏度维持15~30分钟。
天然细胞培养基:
天然培养基是指来自动物体液或利用组织分离提取的一类培养基,如血浆、血清、淋巴液、鸡胚浸出液等。
组织培养技术建立早期,体外培养细胞都是利用天然培养基。
但是由于天然培养基制作过程复杂、批间差异大,因此逐渐为合成培养基所替代。
目前广泛使用的天然培养基是血清,另外各种组织提取液、促进细胞贴壁的胶原类物质在培养某些特殊细胞也是必不可少。
血清种类:
目前用于组织培养的血清主要是牛血清,培养某些特殊细胞也用人血清、马血清等。
选择用牛血清培养细胞的原因:
来源充足、制备技术成熟、经过长时间的应用考验人们对其有比较深入的理解。
牛血清对绝大多数哺乳动物细胞都是适合的,但并不排除在培养某种细胞时使用其他动物血清更合适。
牛血清是细胞培养中用量最大的天然培养基,含有丰富的细胞生长必须的营养成份,具有极为重要的功能。
牛血清分为小牛血清、新牛血清、胎牛血清。
胎牛血清应取自剖腹产的胎牛;新牛血清取自出生24小时之内的新生牛;小牛血清取自出生10-30天的小牛。
显然,胎牛血清是品质最高的,因为胎牛还未接触外界,血清中所含的抗体、补体等对细胞有害的成分最少。
血清的主要成分血清是由血浆去除纤维蛋白而形成的一种很复杂的混合物,其组成成份虽大部分已知,但还有一部分尚不清楚,且血清组成及含量常随供血动物的性别、年龄、生理条件和营养条件不同而异。
血清中含有各种血浆蛋白、多肽、脂肪、碳水化合物、生长因子、激素、无机物等,这些物质对促进细胞生长或抑制生长活性是达到生理平衡的。
血清主要作用:
提供基本营养物质:
氨基酸、维生素、无机物、脂类物质、核酸衍生物等,是细胞生长必须的物质;
提供激素和各种生长因子:
胰岛素、肾上腺皮质激素(氢化可的松、地塞米松)、类固醇激素(雌二醇、睾酮、孕酮)等。
生长因子如成纤维细胞生长因子、表皮生长因子、血小板生长因子等;
提供结合蛋白:
结合蛋白作用是携带重要地低分子量物质,如白蛋白携带维生素、脂肪、以及激素等,转铁蛋白携带铁。
结合蛋白在细胞代谢过程中起重要作用;
提供促接触和伸展因子使细胞贴壁免受机械损伤。
对培养中的细胞起到某些保护作用:
有一些细胞,如内皮细胞、骨髓样细胞可以释放蛋白酶,血清中含有抗蛋白酶成分,起到中和作用。
这种作用是偶然发现的,现在则有目的的使用血清来终止胰蛋白酶的消化作用。
因为胰蛋白酶已经被广泛用于贴壁细胞的消化传代。
血清蛋白形成了血清的粘度,可以保护细胞免受机械损伤,特别是在悬浮培养搅拌时,粘度起到重要作用。
血清还含有一些微量元素和离子,他们在代谢解毒中起重要作用,如SeO3,硒等。
血清培养基主要问题:
血清的成份可能有几百种之多,目前对其准确的成份、含量及其作用机制仍不清楚,尤其是对其中一些多肽类生长因子、激素和脂类等尚未充分认识,这给研究工作带来许多困难;
血清都是批量生产,各批量之间差异很大,而且血清保存期至多一年,因此,要保证每批血清的相似性极为困难,从而使实验的标准化和连续性受到限制;
对大多数细胞,在体内状态,血清不是它们接触的生理学液体,只是在损伤愈合以及血液凝固过程中才接触血清,因此使用血清有可能改变某种细胞在体内的正常状态,血清可能促进某些细胞的生长(成纤维细胞)同时抑制另一类细胞生长(表皮细胞);
血清含一些对细胞产生毒性的物质,如多胺氧化酶,能与来自高度繁殖细胞的多胺反应(如精胺、亚精胺)形成有细胞毒性作用的聚精胺。
补体、抗体、细菌毒素等都会影响细胞生长,甚至造成细胞死亡;
动物个体不同,血清产地、批号不同,每批质量差异甚大,其成分不能保持一致;
取材中可能带入支原体、病毒,对细胞产生潜在影响,可能导致实验失败或实验结果不可靠性;
大规模生产中,血清来源越来越困难,价格昂贵,是构成动物细胞培养对生产成本的主要部分之一。
血清的质量标准
血清质量高低取决于两方面因素:
一是取材对象,二是取材过程。
用于取材的动物应健康无病并且在指定的出生天数之内,取材过程应严格按照操作规程执行,制备出的血清要经过严格的质量鉴定。
WHO公布的《用动物细胞体外培养生产生物制品规程》中的要求:
牛血清必须来自有文件证明无牛海绵状脑病的牛群或国家。
并应具备适当的监测系统;
有些国家还要求牛血清来自未用过反刍动物蛋白饲料的牛群;
证明所用牛血清中不含对所生产疫苗病毒的抑制物;
血清要通过滤膜过滤除菌,保证无菌;
无细菌、霉菌、支原体和病毒的污染,有些国家要求无细菌噬菌体污染。
对细胞有良好的支持繁殖作用。
我国在对牛血清的质量2000年版《中国生物制品主要原辅料质控标准》中提出比较严格的标准要求。
包括蛋白质含量,细菌、真菌、支原体、牛病毒、大肠杆菌噬菌体、细菌内毒素,支持细胞增殖检查。
2.基因工程基本步骤:
2.1提取目的基因——将需要的基因从供体生物的细胞内提取出来。
目的基因获取方法:
①鸟枪法②分子杂交法③逆转录法④人工合成法
本实验的目的基因是蚕基因组中能够合成丝的基因,提取出来并进行PCR扩增。
PCR原料:
DNA模板:
模板包含要用来扩增的靶基因区域,适当提高模板浓度,可减少循环次数,从而减少突变的发生和非特异性产物的形成;但过高的模板浓度会降低反应效率。
上游引物和下游引物:
是人工合成的短的单链DNA片段(寡核苷酸),经常由18-30个碱基组成,用来确定扩增区域的起止位点从而确定扩增的DNA片段大小;物与要扩增的双链DNA的两端精确互补,在退火中可以与DNA模板链特异性地结合。
当引物与模板链结合后,DNA聚合酶就开始从引物链的结合位点催化合成新的DNA链。
引物的量不能太多,过多的引物导致非特异性扩增的发生和引物二聚体的形成。
聚合酶:
聚合酶从引物结合位点开始沿DNA链移动,阅读DNA编码信息,填充正确的匹配核苷酸,催化DNA新链的合成;来源于生活在热泉中的一种细菌Thermusaquaticus的Taq聚合酶是目前使用最广泛的聚合酶。
由于Taq酶没有3'-5'外切酶活性,在复制DNA的过程中可能会随机的引入错误的碱基。
对于一般的PCR实验来讲,错误的产生不影响实验的结果;但特定的实验,如扩增的序列是用在测序或蛋白表达等用途时最好使用有较读活性的高保真酶,如Tli或Pfu。
由于Taq酶相比其它酶要求的反应条件简单,扩增效率较高,因此可同其它酶混合起来以提高扩增长片段时的保真性。
单独使用高保真酶扩增的产物如果与具有黏性末端的载体相连前,通常利用Taq酶在产物的3'末端增加一个多余的A碱基。
四种dNTP(dATP,dCTP,dGTP和dTTP):
是合成DNA新链的原料。
dNTP的量与合成产物的大小有关,越长的片段需要越多的dNTP,但过多的dNTP能增加复制的错误率并可能抑制Taq酶活性。
缓冲液:
为维持DNA聚合酶的活性提供必要的pH值和离子浓度。
Mg离子:
Mg离子对于维持聚合酶的活性是必须的,它通过稳定引物-模板相互作用而影响退火进程;同时也能稳定聚合酶同引物-模板形成的复制复合物,因此可以增加非特异性退火,进而形成非特异性产物。
许多成分如EDTA和dNTP可以结合一部分Mg离子,所以Mg离子准确的用量需要实验来确定。
一般来讲,低浓度的Mg离子增加复制的可信度,而高量的Mg离子降低特异性、引入突变。
一般反应可通过变化温度、模板质和量而规避提高Mg量的操作。
添加剂:
1.7-deaza-dGTP,Glycerol(5-10%),formamide(1-5%)orDMSO(2-10%):
当模板GC含量高时,加入7-deaza-dGTP或DMSO可以降低互补碱基间的氢键从而降低反应需要的有效退火温度和变性温度。
这些添加剂也会改变聚合酶的耐热性,Glycerol可保护聚合酶,防止热失活;而formamide可降低酶的耐热性。
2.0.5-2MBetaine:
当模板GC含量高时或扩增长片段时,加入后可降低变性温度到92-93℃,并使退火温度下降2-3℃,Betaine经常跟5%的DMSO一起使用。
3.TMAC(tetramethylammoniumchloride),TEAC(tetraethylammoniumchloride),andTMANO(trimethlamineN-oxide);
4.BSA:
可以提高PCR反应效率。
5.TritonX-100:
可防止聚合酶的相互缔合或者黏附在反应管壁上
图形原理:
2.2目的基因与运载体结合
用与提取目的基因相同的限制酶切割质粒使之出现一个切口,将目的基因插入切口处,让目的基因的黏性末端与切口上的黏性末端互补配对后,在DNA连接酶的作用下连接形成重组DNA分子
步骤:
(1)用一定的限制酶切割质粒,使其出现一个有粘性末端的切口。
(2)用同种限制酶切断目的基因,产生相同的粘性末端。
(3)将切下的目的基因片段,插入到质粒的切口处,再加入适量的DNA连接酶,使质粒与目的基因结合成重组质粒
酶切反应体系:
酶1酶1
酶2
H2O目的基因
Buffer+BSA牛血清白蛋白
DNA酶2
载体
如何防止载体自连,用酶把-OH或者-P切掉一个3’----------------5’-P
5’----------------3’-OH
2.3将目的基因导入受体细胞
①导入方法:
借鉴细菌或病毒侵染细胞的途径。
②导入过程:
运载体为质粒,受体细胞为细菌,一般是将细菌用 CaCl2处理,以增大细菌细胞壁的通透性,使含有目的 基因的重组质粒进入受体细胞。
本实验的受体细胞为蜜蜂的生殖细胞。
2.3.1转化:
DNA和感受态细胞都置于37度恒温水浴锅中,然后将DNA转移到感受态细胞悬液中,反复吹打,使其均匀接触
2.3.2将混悬液放在冰水浴中>=40分钟,使DNA跟细胞表面受体结合,轻轻的将混悬液置于37度的水浴锅45秒
2.3.3平稳快速的转入冰水浴中2分钟(原理:
热胀冷缩)
2.3.4取出,加入900ul的37℃预热的LB培养基,混匀,即为转化子
2.3.5放入37度的培养箱1小时,让菌恢复生长苏醒过来
提前一天进行抗生素(抑制繁殖)平板,培养基灭菌,培养皿灭菌后,加入抗生素(青霉素),分布均匀,冷却至60度以下,适当摇瓶,摇着冷却,混匀后,涂平板(涂平板效果:
菌落在平板上均匀分布,以保证培养基在上面,使水分不损失,推棒每个部分5次以上,之后,培养在37℃中,8到10个小时),冰箱冷冻1分钟,37度培养箱1小时,烘干水,离心,3000-4000r/min1min,去上清
2.3.6挑选部分的菌落,至少5个(随机)单菌落,进行扩大培养,以便于鉴定
2.3.7将菌作为PCR模板进行扩增(菌落PCR)
2.3.8进行菌种保藏,在液体培养基上
2.3.9再将菌种送到公司测序,若是碱基突变、引起氨基酸变化等,就需要重新开始做。
2.4目的基因的检测和表达
前三步的处理十分繁锁,为保证目的基因得到有效利用,通常用大量的受体细胞来接受不多的目的基因。
这样,处理的受体细胞中真正摄入了目的基因的很少,必须将它从中检测出来。
结论:
应用细胞培养技术和基因工程能够使蜜蜂有吐丝功能,增加蜜蜂的实用价值,提高蜜蜂的养殖效益。
参考文献:
1、细胞培养技术的应用研究进展-饲料博览-2013年第1期(4)
2、小鼠血管内皮细胞的培养、鉴定及巨噬细胞移动抑制因子对其促增殖作用的研究-解放军医药杂志-2013年第1期
薛庆善、肖渝平、林娟,体外培养的原理与技术;科学出版社
4、王延华、李力燕,组织细胞化学理论与技术,北京;科学出版社,2009。
5、细胞工程(第二版)
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- 吐丝 蜜蜂