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细胞色素P450研究进展
1.1细胞色素P450研究进展
1.1.1细胞色素P450
细胞色素P450(cytochromeP450或CYP,简称P450)是一个古老的以血红素为辅基的B族细胞色素蛋白酶基因超家族,广泛存在于细菌、真菌、植物以及动物等各种生物体内[1],通常与质体、线粒体、内质网、高尔基体等细胞器膜结合。
还原态P450与CO结合后在450nm处能检测到最大吸收峰,故命名为P450。
因其能使疏水性分子插入一个氧原子而变得更具有亲水性或者活性,因此又称之为单加氧酶(mixed-functionoxidase,简称MFO)[2]。
P450酶系作为自然界中生物催化剂,它所催化的反应类型多样,最典型的反应是把分子氧还原为水的同时,将其中一个氧原子转移至底物形成产物,催化反应为[3]:
RH+O2+NADPH+H+ROH+H2O+NADP+
1958年,在大鼠肝微粒体中第一次发现P450。
D.SFrear于1969年首次在棉花(GossypiumhirsutumL.)中发现了它的存在[4]。
此后,大量的研究表明在拟南芥(ArabidopsisthalianaL.)[5]、小麦(TriticumaestivumL.)[6]、苜蓿(MedicagosativaL.)[7]、蓖麻(RicinuscommunisL.)[8]等许多植物中也均有P450存在。
P450酶系在植物中参与多种代谢反应,发挥重要的催化作用。
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1.1.2细胞色素P450结构特征
在细胞色素P450超基因家族中,不同成员之间在氨基酸序列上具有高度的变异性,但其空间结构上却保持较高的相似性,P450蛋白三级结构主要由C端的α-螺旋结构和N端的β-折叠结构组成[1,2]。
与半胱氨酸相连接的血红素(heme)结合位点是诸多结构域中最为保守的活性中心,其主要螺旋k、螺旋I、螺旋C和“曲”(meander)等重要的保守区域组成[3],如表1所示。
保守区域Conserveddomains
特征序列Signaturesequences
区域特征Conservedcharacteristic
血红素结合域Hemebindingdomain
FxxGxRxCxG/A
是鉴定P450的主要特征,位于血红素近表面,含高度保守的半胱氨酸(cys),提供亚铁血红素的第5个配体,亚铁血红素接受电子被还原后同CO结合,在450nm附近形成特征吸收峰。
螺旋CHelixC
WxxxR
是位于细胞色素P450N端的保守序列,其中,色氨酸(Trp)和精氨酸(Arg)残基与血红素辅基丙酸负离子作用,与血红素形成电子拉链。
螺旋IHelixI
(A/G)Gx(D/E)T(T/S)
含有高度保守的苏氨酸(Thr),位于活性中心吡咯环B的上方,推测与氧分子或底物分子的结合有关。
螺旋KHelixK
ExxR
位于血红素近侧,谷氨酸(Glu)和精氨酸(Arg)完全保守,可能具有稳定核心结构的作用。
曲meander
FxPE/DRF
位于蛋白质近表面,没有特征性的二级结构,但该结构域三级结构相当保守
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1.1.3细胞色素P450的分类与命名
随着越来越多的P450基因被识别和鉴定,为了方便研究和应用,Nerbert等[1]在1987年提出根据基因编码的氨基酸序列的相似度来划分细胞色素P450的家族和亚家族,后逐渐形成了一套统一的命名系统:
以英文缩写CYP代表细胞色素P450,CYP后第一个数字为家族编号,其后的大写英文字母为亚家族编号,字母后的数字表示单个基因[2]。
对某一新发现的P450基因进行命名时,看其与已知P450的氨基酸序列的一致性,若二者大于40%,则它们属于同一个家族,否则该基因就属于一个新的P450家族;若大于40%而小于55%,则属于同一P450家族的两个不同的亚家族;若大于55%,则属于同一亚家族。
同源性不小于97%的归为等位基因[3]。
植物P450可分为10个簇(clans),和47个家族。
最大的一个簇被称为A-type植物P450集团,又称为71clan,其余9个簇被称为non-A-type植物P450集团[4],如表2所示。
簇(Clan)
家族(family)
A-type
CYP71Clan
CYP71、CYP73、CYP75、CYP76、CYP77、CYP78、CYP79、CYP81、CYP82、CYP83、CYP84、CYP89、CYP92、CYP93、CYP98、CYP701、CYP703、CYP712、CYP736
CYP51Clan
CYP51
CYP72Clan
CYP72、CYP714、CYP715、CYP721、CYP734、CYP735
non-A-type
CYP74Clan
CYP74
CYP85Clan
CYP85、CYP87、CYP88、CYP90、CYP707、CYP716、CYP718、CYP720、CYP722、CYP724、CYP728、CYP733、
CYP86Clan
CYP86、CYP94、CYP96、CYP704、
CYP97Clan
CYP97
CYP710Clan
CYP710
CYP711Clan
CYP711
CYP727Clan
CYP727
[1]NebertDW,AdesnikM,CoonMJ,EstabrookRW,GonzalezFJ,GuengerichFP,GunsalusIC,JohnsonEF,KemperB,LevinW(1987)TheP450genesuperfamily:
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1.1.4植物细胞色素P450参与的生物合成途径
植物细胞色素P450酶系具有广泛的催化活性,在植物体内催化多种次级代谢反应,主要参与萜类、苯丙烷类、生物碱,脂肪酸、植物激素和生菁糖苷类等的合成和代谢反应;以及对杀草剂、杀虫剂、环境毒素等毒害化学物质等进行修饰,转化为非毒性物质,或为了抵抗外界的侵害而催化某些无毒性物质成为毒性化合物[1,2]。
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1.1.4.1萜类
萜类是自然界中一大类天然化合物,包括类胡萝卜素、赤霉素、脱落酸、甾体、醌类及植物防御物质等。
研究发现,P45O参与了许多萜类物质的生物合成。
单萜类化合物生物合成中,P450均可对柠烯、蒎烯、刺柏烯、樟脑、托品醇、松香二烯等进行羟基化修饰[3]。
植物双萜类衍生物赤霉素(GA)的生物合成途径中由内根-贝壳杉烯生成GA12-醛的过程中有连续5个步骤都由P450催化的[4]。
紫杉醇生物合成的19个酶促反应中有将近一半步骤由P450酶催化完成[5]。
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1.1.4.2苯丙烷类
在苯丙烷生物合成途径中,已报道的P450参与的催化反应超过16个,主要参与羟基化、脱烷基、环化以及芳基转移等[6]。
苯丙烷类合成途径的最初的3个反应步骤——从苯丙氨酸到4-香豆辅酶A开始,经PAL催化生成反式肉桂酸,然后由CYP450中的肉桂酸-4-羟化酶(Cinnamate4-hydroxylase,C4H)催化生成对羟基肉桂酸(对香豆酸)。
对香豆酸通过4-香豆酰辅酶A连接酶(4CL)转变为4-香豆酰辅酶A,随后进入木质素、类黄酮及呋喃香豆素等下游代谢途径。
C4H是第一个被鉴定和克隆的植物细胞色素P450单加氧酶[7],迄今为止,已有许多植物的C4H基因被分离[8,9]。
与其他CYP450相比,C4H在植株的各个组织器官中均具有很高活性。
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1.1.4.3芥子油苷和IAA的生物合成
近年来,芥子油苷和生长素的生物合成途径的探究是植物细胞色素P450研究取得的显著成果之一。
芥子油苷是来源于氨基酸的植物天然产物,主要存在于十字花科植物中。
当植物组织受损伤时,芥子油苷水解为某些腈和硫氰酸等一系列有毒物质进行自身防御,同时,芥子油苷及其降解产物可用作抗癌药物。
芥子油苷的生物合成主要有细胞色素P450中的CYP79和CYP83两个家族参与。
其中CYP79家族催化氨基酸羟基化生成相应的乙醛肟,而CYP83家族催化乙醛肟到芥子油苷的合成途径[10]。
生长素(吲哚-3-乙酸,IAA)作为促进植物生长的激素,影响植物根的发生、细胞的伸长和分裂、维管组织的分化以及植株向地性和向光性行为等。
研究表明,植物可通过色氨酸依赖途径(Trp-dependentpathway)和非色氨酸依赖途径(Trp-independentpathway)等两种方式进行IAA的生物合成。
进一步研究表明,生长素的生物合成途径与吲哚族芥子油苷的代谢存在交叉,在色氨酸依赖途径中,色氨酸被CYP79B2和CYP79B3酶催化形成吲哚-3-乙醛肟(IAOx),而吲哚-3-乙醛肟是IAA和吲哚族芥子油苷生物合成的共同初始底物,可进一步形成生长素或吲哚族芥子油苷[11]。
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此外,P450还在脂肪酸,生物碱,生氰糖苷以及植物防御次生性物质的生物合成过程中起重要催化作用。
如P450参与脂肪酸的羟基化和环氧化[12];P450酶系中的小檗宁合酶(BS)能催化两个分子N-甲基乌药碱氧化形成二聚体生物碱——小檗宁[13];4个CYP71家族基因参与了2,4-二羟基-1,4-苯并噁嗪-3-酮(DBIOA)的生物合成[14]。
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