免鱼Vibrio ponticus的分离鉴定毕业作品.docx
- 文档编号:470103
- 上传时间:2022-10-10
- 格式:DOCX
- 页数:15
- 大小:212.43KB
免鱼Vibrio ponticus的分离鉴定毕业作品.docx
《免鱼Vibrio ponticus的分离鉴定毕业作品.docx》由会员分享,可在线阅读,更多相关《免鱼Vibrio ponticus的分离鉴定毕业作品.docx(15页珍藏版)》请在冰豆网上搜索。
免鱼Vibrioponticus的分离鉴定毕业作品
毕-设
业-计
(20__届)
鮸鱼Vibrioponticus的分离鉴定
所在学院
专业班级水产养殖学
学生姓名学号
指导教师职称
完成日期年月
1引言1
2.1材料1
2.2病原菌的分离2
2.3菌体形态观察及常规生理生化鉴定2
2.4病原菌的回归感染2
2.5药物敏感性实验2
2.6细菌基因组序列扩增,测序和分析2
2.6.1细菌基因组DNA提取2
2.6.2PCR扩增2
2.6.3扩增产物的检测和克隆2
2.6.4序列分析2
3结果和分析2
3.1形态观察及常规生理生化鉴定2
3.2病原菌的回归感染4
3.3药物敏感性实验4
3.4细菌基因组序列扩增、测序和分析5
4讨论5
5总结7
致谢7
参考文献8
摘要:
该论文主要是鉴定一株分离自鮸鱼的菌株。
主要采用了TCBS平板分离优势菌,形态学观察,生理生化特征测定,回归感染试验,计算LD50,药敏试验测定,16SrRNA序列分析鉴定细菌等鉴定此分离物。
通过上述鉴定,该菌株Miiuycroaker–Y090909为革兰氏阴性,直杆,在25℃下TCBS琼脂上培养菌落呈黄色的。
菌株能在无气条件下发酵葡萄糖,氧化酶和过氧化氢酶阳性。
它们生长需钠离子,不能再不添加NaCl的培养基上生长。
能8%浓度NaCl下生长,不能再10%浓度NaCl下生长。
16SrRNA序列表明与Vibrioponticus形成一簇,亲缘关系最近。
本文主要就鮸鱼Vibrioponticus病菌的生理生化、药敏实验及16SrRNA序列做了简单研究,希望能对将来的研究有参考价值。
关键词:
Vibrioponticus;鮸鱼;常规生理生化鉴定;药物敏感性实验;16SrRNA测序和分析
Abstract:
Toidentifyandcharacterizationofastrainfromthespleenofmiiuycroaker.Inthisstudy,weusedconventionalbiochemicalidentification,experimentalinfection,drugsensitivitytests,16SrRNAsequencingandanalysis,etc.ThisexperimentusedTCBSplatetoisolatethedominantbacteria.ThemorphologyisGram-negativeandstraightrod.ThecolonieswereyellowonTCBSin25℃.OxidaseandCatalasewerepositve.Itcangrowontheplatewith8%NaCl,butnotgrowontheplatewith10%NaCl.16SrRNAsequencesanalysisrevealedthatitwasgroupedwithVibrioponticus.TheisolatesfromthespleenofmiiuycroakerisVibrioponticus.Inthispaper,theresultsfromtheexperimentswillbeofthereferencevalueforfutureresearch.
Keywords:
Vibrioponticus;MiichthysmiiuyBasilewsky;conventionalbiochemicalidentification;experimentalinfection;16SrRNAsequencingandanalysis
1引言
鮸鱼(MiichthysmiiuyBasilewsky),一作米鱼,形似鲈鱼,但肉质略粗糙,体色发暗,灰褐并带有紫绿色,腹部灰白。
背鳍鳍棘上缘黑色,鳍条部中央有一纵行黑色条纹。
胸鳍腋部上方有一晴斑。
其余各鳍灰黑色。
鮸鱼体形为两侧扁平向后延长状,背、腹部浅弧形。
鮸鱼分布于北太平洋西部,包括中国的渤海、黄海及东海,朝鲜和日本南部。
中国沿海主要产鮸鱼的渔场有:
广东潮汕鱼场福建平潭岛和兄弟岛,浙江岱山和舟山群岛,江苏大沙渔场,山东沿海和渤海,尤以东海的舟山群岛产量最大,是宁波一带的海渔特产之一。
鮸鱼的主要捕捞方法为底拖网或延绳钓,冬春之际产量较高。
每年农历6-8月为舟山群岛鮸鱼的渔汛期,渔汛期鮸鱼以春季生殖洄游和冬季越冬洄游为主,7月为旺汛。
每逢大潮汛,渔船竞相出海作业,晨出晚归,捕获甚丰。
鮸鱼肉味鲜美,为海产经济鱼类之一,也是经济价值较高的鱼类。
除鲜食外,肉是作鱼丸、敲鱼面的上等原料,在温州颇有盛名;全鱼还可制作罐头或加工成鮸鱼鲞;鱼鳔可制鱼胶,有较高的药用价值,具养血、补肾、润肺健脾和消炎作用;鱼鳞可制鳞胶;内脏、骨可制鱼粉、鱼油;耳石有清热去瘀、利尿的作用。
鮸鱼还是我]国的出口鱼类品种,每年通过浙江、上海、江苏、辽宁等出口口岸大量输往日本、香港、澳门等国家和地区。
鮸鱼性甘、咸、平,有养血、止血、补肾固精、润肺健脾和消炎功效。
对治疗再生障碍性贫血,吐血,肾虚遗精,疮疖、痛肿、无名肿毒、乳腺炎等有效。
鮸鱼的耳石有清热去瘀、利尿的作用;鮸鱼鳔俗称“鮸鱼胶”或“鳘肚”,具有养血、补肾、润肺健脾和消炎作用;采用鮸鱼鳔,与当归、红枣适量煎汤,长期坚持食用,对再生障碍性贫血有一定疗效。
鮸鱼鳔的与等量的酒和水了炖食,可治疗男子遗精和女子白带了。
随着鮸鱼养殖规模的不断扩大,由于养殖密度过高,养殖区域水质恶化严重,以及鮸鱼经过多代人工繁殖造成性状退化,导致机体抵抗力下降等原因,病害频繁发生且日趋严重。
近年流行的病害主要是细菌性疾病(弧菌病、肠炎病、烂鳃病等)、寄生虫病(纤毛虫、指环虫等)、水霉病等。
其中由弧菌属细菌引起的疾病,危害最为严重,每年都给养殖从业者造成了极大的经济损失。
弧菌病是一种常见的水产动物疾病,在世界各地具有较高的死亡率。
弧菌属有近20个种,包括副溶血性弧菌,霍乱弧菌,创伤弧菌和鳗弧菌。
一些新的海洋病原弧菌属,已在近几年被报告。
我们可以确定在不久的未来,随着流行病学研究的不断发展,更多病菌很可能将更多的被发现和鉴定。
鮸鱼弧菌病的病原主要为哈氏弧菌(Vibrioharveyi)。
弧菌属的多种弧菌均能引起养殖鱼类弧菌病,症状表现为多种多样:
溃疡、烂尾、腹水、烂眼等,其中溃疡和烂尾是最常见的症状[1-3]。
这是一种病程短、范围广、死亡率高的疾病,流行时间为6-10月,7-8月为高峰期,一般死亡率为30%-40%最高可达80%以上。
在典型的发病网箱内,从出现少量病鱼到大部分发病死亡历时约7d。
致病菌的准确快速鉴定是鱼病防治的基础,如何快速准确检测养殖鮸鱼弧菌病,已成为当前鮸鱼养殖业十分重要而突出的问题。
Vibrioponticus是弧菌属的一员,2004年发现的一个新种。
目前关于此类鮸鱼弧菌病的研究主要是对该菌的分离鉴定以及该菌的致病性还有一些基本的培养特性,其他方面如免疫学、病理学等方面很少涉及。
然而作为新发现的海洋致病菌,对其的研究有着极其重要的经济价值和生态价值。
本文主要通过传统方法及16SrRNA序列分析的方法鉴定分离自鮸鱼的细菌,分别从生理生化、药敏实验和16SrRNA序列分析等方面鉴定该菌株为V.ponticus。
2实验方法
2.1主要试剂和仪器
离心机和超低温冰柜均购自德国Thermo公司,恒温振荡器购自江苏省华利达试验设备公司,电热恒温培养箱购自日本EYELA公司,高压蒸汽灭菌锅购自日本ALP公司,PCR仪购自美国BIO-RAD公司;普通营养琼脂和TCBS培养基、药敏纸片(链霉素、新生霉素、氯霉素、四环素、青霉素G、先锋霉素V、头咆哌酮、羧苄青霉素和氨苄青霉素共10种)(杭州天河微生物试剂有限公司)和细菌微量生化反应管(乳糖、木糖、肌醇、V-P试验、MR试验、靛基质试验、蔗糖、鸟氨酸脱羧酶、赖氨酸脱羧酶等共38种)均购置杭州天河微生物试剂有限公司;T4DNA连接酶、pMD19-T载体和ExTaq聚合酶等均购自Takara公司。
2.2病原菌的分离
样品:
选取症状典型的濒死病鱼。
无菌条件下取病鱼体表溃疡、肝、脾、肾等部位作为材料,用普通营养琼脂和TCBS平板做细菌分离,置28°C培养24h。
结果从被检材料中分离到纯度一致的菌株,命名为Miiuycroaker–Y090909,纯培养后-70°C保存备用。
2.3菌体形态观察及常规生理生化鉴定
用普通光镜观察分离细菌的形态。
参照《常见细菌系统鉴定手册》和《伯杰氏细菌学鉴定手册》方法对其进行生理生化特征测定。
取分离的纯培养菌,接种于普通液体培养基中,并放置于28℃的摇床中培养24h,使用细菌微量生化反应管测定鸟氨酸脱羧酶、赖氨酸脱羧酶、精氨酸双水解酶、β-半乳糖苷(ONPG)、氧化酶、接触酶、乳糖、木糖、蔗糖、半乳糖、鼠李糖、甘露糖、麦芽糖、阿拉伯糖、蜜二糖、葡萄糖、甘露醇、肌醇、山梨醇、丙二盐酸、明胶、硫化氢、尿素、七叶苷、水杨素、葡萄糖(产气)、葡萄糖磷酸盐(V-P试验)、蛋白胨水(靛基质)、葡萄糖磷酸盐(M-R试验)、葡萄糖酸盐、西蒙氏枸橼酸盐的生理生化特性测定,以及分离病原菌在无盐胨水、3%氯化钠胨水、6%氯化钠胨水、8%氯化钠胨水、10%氯化钠胨水的生长状况。
2.4病原菌的回归感染
选择无外伤、游动活泼,重量在200g左右的健康鮸鱼作为供试鱼,将鮸鱼置于塑料桶中暂养1周,稳定后随机分组进行试验,每4尾鱼为1组。
试验用水为天然海水,水温为20(±1)℃。
分别取0.1mL菌悬液,对试验组鱼进行腹腔注射感染,同时给对照组鱼腹腔注射无菌生理盐水0.1mL。
试验期间连续充气,每天换水1次,投饵1次。
人工感染后连续观察7d,连续观察鱼的体色、活动力、摄食、发病症状和死亡情况。
用酒精棉球对病鱼的体表消毒,对濒死病鱼进行病理变化检验,然后在无菌条件下取下肌肉、肾、肝和脾等部位的组织小块划线接种于TCBS培养基平板,在28℃下恒温倒置培养24h。
挑取平板中形态特征一致的优势菌,接种于TCBS培养及平板,在28℃下恒温倒置培养24h,观察菌落形态。
2.5药物敏感性实验
用药敏纸片法在普通营养琼脂平板上测定鮸鱼病原菌对药物的敏感性。
在28℃恒温培养24h后,测量抑菌圈直径大小。
再根据纸片法药敏试验抑菌圈直径判断标准得出对各种抗菌药物的敏感性。
2.6细菌基因组序列扩增、测序和分析
2.6.1细菌基因组DNA提取:
采用Wilson描述的方法提取鮸鱼病原菌的基因组DNA作为模板。
2.6.2PCR扩增:
16SrRNA基因PCR扩增所需要的两个引物为16S(+):
5'-AGAGTTTGATCATGGCTCAG-3'、16S(-):
5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3'。
在20μL的PCR反应体系中含有:
引物各0.2μL,模板DNA1μL,2.5U/μL的TaqDNA聚合酶0.2μL,4×dNTP混合物0.4μL,1×PCR缓冲液2μL,无菌蒸馏水14.4μL,1.5mmol/LMgCl21.6μL。
PCR反应条件为:
94℃预变性3min,接着94℃变性30s、55℃复性1min和72℃延伸2min如此30个循环后,72℃温育6min。
2.6.3扩增产物的检测和克隆:
琼脂糖凝胶检测PCR产物,预期大小的扩增条带回收后克隆至pMD19-T载体,序列测定由上海英
- 配套讲稿:
如PPT文件的首页显示word图标,表示该PPT已包含配套word讲稿。双击word图标可打开word文档。
- 特殊限制:
部分文档作品中含有的国旗、国徽等图片,仅作为作品整体效果示例展示,禁止商用。设计者仅对作品中独创性部分享有著作权。
- 关 键 词:
- 免鱼Vibrio ponticus的分离鉴定毕业作品 Vibrio ponticus 分离 鉴定 毕业 作品
![提示](https://static.bdocx.com/images/bang_tan.gif)