常用实验方法和所需试剂的配制.docx
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常用实验方法和所需试剂的配制
(一)Western-blot实验
1.Westernblot主要实验试剂
溴酚蓝(BromphenolBlue)
丽春红(PonceauS)
考马斯亮蓝(CoomassiebrilliantblueR-250)
吐温-20(Tween-20)
β-巯基乙醇(β-Mercaptoethanol)
十二烷基硫酸钠(SDS)
过硫酸铵(APS)
TEMED
聚丙烯酰胺凝胶单体贮备溶液
4×浓缩胶缓冲液
4×浓缩胶缓冲液
甘氨酸
Tris碱
脱脂奶粉
牛血清白蛋白(BSA)
硝酸纤维素膜(NC膜)
蛋白质Marker和预染Marker
通用蛋白裂解/提取试剂
BCA法蛋白定量试剂盒
Bradford法蛋白定量试剂盒
兔源性抗抗体
辣根过氧化物酶标记羊抗兔IgG
ECL超敏发光液
定影液、显影液、X光胶片曝光盒
其他试剂(乙醇、甲醇、冰醋酸、二甲苯、戊二醛等)
2.Western-blot主要实验试剂的配制方法
(1)10%SDS溶液:
SDS粉末1g,加双蒸水10mL使其溶解,室温保存。
(2)10%APS:
APS20mg,加双蒸水200μL,混匀,现配现用。
(3)10×电极缓冲液(PH8.3):
SDS粉末10g、Tris碱30.4g、甘氨酸144g,双蒸水定溶至1000mL,4℃保存,用时10倍稀释。
(4)考马斯亮蓝固定液:
乙醇500mL、冰醋酸10mL、双蒸水定溶至1000mL。
(5)考马斯亮蓝脱色溶液:
95%乙醇250mL、冰醋酸80mL,双蒸水定溶至1000mL。
(6)考马斯亮蓝染色溶液:
0.29g考马斯亮蓝,溶解于250mL脱色液中,过滤后室温保存。
(7)转移缓冲液:
甘氨酸2.93g、Tris碱5.812g、甲醇200mL、去离子水定溶至1000mL,4℃保存。
(8)10×TBS溶液:
Nacl87.75g、Tris碱12.1g,用双蒸水溶至1000mL,4℃保存,用时10倍稀释。
(9)TBST溶液:
1×TBS溶液1000mL、Tween-20溶液1mL,混匀。
(9)丽春红溶液:
100g丽春红,5mL冰醋酸,双蒸水定溶至100mL,室温保存。
(11)5×上样缓冲液:
1mol/LTris-HCl(pH6.8)0.6mL、甘油2.5mL、10%SDS溶液2mL、β-巯基乙醇(使用前加)0.5mL、1%溴酚蓝溶液1mL,去离子水定溶至10mL,4℃保存。
(12)12%分离胶:
聚丙烯酰胺单体贮备液3.2mL、4×分离胶缓冲液0.5mL、10%SDS溶液80μL、10%APS溶液25μL、TEMED原液10μL、双蒸水溶至8mL。
(13)5%浓缩胶:
聚丙烯酰胺单体贮备液0.68mL、4×浓缩胶贮备液0.25mL、10%SDS溶液40μL、10%APS溶液15μL、TEMED原液5μL、双蒸水溶至4mL。
(14)NC膜封闭液:
脱脂奶粉1g,TBST溶液20mL中溶解,4℃保存。
(15)抗体稀释液:
TBST溶液20mL、小牛血清白蛋白1g,混匀,4℃保存。
(16)StripingBuffer:
β-巯基乙醇35μL、10%SDS溶液1mL、0.5MTris溶液(pH6.7)625μL,去离子水定溶至5mL,室温保存。
3.Western-blot实验步骤
(1)总蛋白的提取(采用北京普利莱公司蛋白质抽提试剂盒抽提)
电子天平精确称取组织50mg(±2mg),放入含有1mL细胞裂解液和适量的PMSF(终浓度为1mmoL/mL)的预冷玻璃匀浆器内,冰上匀浆。
取0.5mL匀浆液移入新的2mLEP管内,加1mL蛋白抽提试剂并混匀,静置10min后(偶有颠倒混匀),12000g4℃离心10min。
弃去上清保留蛋白质膜,加2%SDS溶液500μL,100℃水浴10min,4℃放置2小时使蛋白质膜充分溶解。
(2)总蛋白浓度的测定(BCA法)
配制统一的蛋白质标准品:
以牛血清白蛋白(bovineserumalbumin,BSA)的标准品溶液(浓度为1mg/mL)制作蛋白质标准曲线。
分别吸取BSA标准品溶液0、100、200、400、800、1200、1600和2000μL,各自加入0.01MPBS溶液补足到2000μL,配成梯度浓度的标准品溶液,分装后-20℃备用。
配制BCA工作液:
按50:
1的比例将BCA试剂盒内的A试剂与B试剂进行混合,配成BCA工作液。
室温保存,1d内使用。
样品处理:
取各样品10μL,加0.01MPBS溶液490μL,配成待测样品。
加样:
先于酶标板上样孔内加入200μLBCA工作液,再分别加入倍比稀释的标准品及待测样品各20μL,酶标仪上震荡3min,充分混匀。
测定:
将酶标板置于恒温水浴箱中,37℃孵育30min。
用MRK3型酶标仪测定562nm波长下各孔吸光度值(opticaldensity,OD),采用Softmax5.2软件计算各样本蛋白质浓度。
(3)样品浓度的配平和制备
配平:
按测定的各样品蛋白质浓度,用2%SDS溶液配平各样品总蛋白浓度。
根据预实验结果,将组织的总蛋白浓度调为1mg/mL。
制备:
将配平后的样品与5×上样缓冲液按4:
1的比例混合。
100℃水浴10min,部分4℃保存用于电泳,部分-20℃保存备用。
(4)样品内蛋白含量的检测
凝胶的配制:
配制12%分离胶和5%浓缩胶(配制方法见附录)。
上样:
分别用Eppendorf微量移液器吸取蛋白质Marker或样品各10μL,将枪尖的插入加样孔的底部,缓慢地将样品或Marker加入加样孔,避免有气泡产生。
电泳:
浓缩胶:
电压100V、电流400mA,电泳20min;分离胶:
120V,400mA,电泳50min,待溴酚蓝到达凝胶底部,关闭电源。
蛋白质转膜:
恒压转移,转膜参数:
电压100V,电流350mA,转移23min。
结束后,将硝酸纤维素膜(nitrocellulose,NC膜)于丽春红染液中染色10min,可见清晰的红色条带,表明转膜成功。
去离子水冲洗,根据蛋白质Marker的位置将含有目的蛋白的膜条带上下各0.5cm)裁下。
封闭:
把NC膜置于封闭液内室温封闭4h(摇床上进行),TBST液洗膜2min×3次。
免疫反应:
将封闭好的膜置于一抗溶液中4℃孵育过夜,TBST溶液洗3min×5次后,NC膜再于辣根过氧化物酶标记羊抗兔IgG溶液中孵4℃育1h,用TBST溶液洗膜3min×5次。
以上步骤均在摇床上进行。
曝光:
将ECL超敏发光液中的A液和B液按1:
1比例混合后滴于NC膜上,暗室内曝光30s,X-光片在显影液中显影2min,定影液中定影5min。
分析结果:
将NC膜上肌动蛋白染色条带结果扫描后输入电脑,IPP5.0图像分析系统分析结果。
(二)免疫组化(荧光)染色实验
1.免疫组化(荧光)染色主要实验试剂
防脱片剂
一抗抗体
免疫组化试剂盒(SP或SABC)
DAB试剂盒
罗丹明标记的羊抗兔IgG
组织自身荧光淬灭剂
其他试剂(乙醇、甲醇、冰醋酸、二甲苯、戊二醛等)均为国产分析纯
2.常用试剂的配制
(1)0.01MPBS溶液:
中衫公司的PBS粉末一包,加蒸馏水2000mL,混匀,室温保存。
(2)4%多聚甲醛溶液:
500ml0.01MPBS液加40g多聚甲醛在2000ml的烧杯内加热至60℃,边搅拌边加热,至溶液呈澄清,另加500ml0.01MPBS液至1000ml。
冷却后过滤,4℃冰箱保存备用。
(3)苏木素:
(4)伊红:
3.HE染色方法
(1)二甲苯
脱蜡10min
(2)二甲苯
、
脱蜡各5min
(3)无水乙醇洗1min×2次
(4)95%酒精1min
(5)90%酒精1min
(6)85%酒精1min
(7)自来水洗2min
(8)苏木素染色1~5min
(9)自来水洗1min
(10)1%盐酸酒精分化20s
(11)自来水洗1min
(12)稀氨水(1%)反蓝30s
(13)自来水洗或蒸馏水洗1min
(14)伊红染色20s~5min
(15)自来水洗30s
(16)85%酒精脱水20s
(17)90%酒精30s
(18)95%酒精1min
(19)95%酒精1min
(20)无水乙醇2min
(21)无水乙醇2min
(22)二甲苯
、
、
透明各5min
(23)中性树胶封片
4.免疫组化染色
(1)制作切片:
组织切片的制作、切片脱蜡、脱水过程按HE染色步骤进行;
(2)抗原修复:
0.01M的枸橼酸缓冲液内、中火微波修复15min,冷却至室温后,PBS溶液洗3min×3次;
(3)封闭:
封闭液室温封闭30min,弃去封闭液,不洗;
(4)免疫反应:
滴加一抗抗体,4℃孵育过夜(保湿盒内进行),PBS溶液洗切片3min×5次后,滴加二抗,室温4℃孵育30min,PBS溶液洗切片3min×5次;滴加DAB试剂、显色。
显微镜观察切片,蒸馏水终止显色反应。
脱水、透明、封片。
(5)观察:
每张切片随机选5个视野,扫描记录,并采用IPP5.0图像分析软件分析图像。
5.免疫荧光染色
(1)制作切片:
组织切片的制作、切片脱蜡、脱水过程按HE染色步骤进行;
(2)抗原修复:
0.01M的枸橼酸缓冲液内、中火微波修复15min,冷却至室温后,PBS溶液洗3min×3次;
(3)封闭:
封闭液室温封闭30min,弃去封闭液,不洗;
(4)免疫反应:
滴加一抗抗体,4℃孵育过夜(保湿盒内进行),PBS溶液洗切片3min×5次后,滴加罗丹明标记IgG,室温避光4℃孵育30min,PBS溶液洗切片3min×5次;滴加组织自发荧光淬灭剂,室温孵育30min,PBS溶液洗3min×3次;滴加抗荧光淬灭封片剂封片,4℃避光保存。
(5)观察:
荧光显微镜观察切片,每张切片随机选5个视野,扫描记录,并采用IPP5.0图像分析软件分析图像。
(三)RT-PCR实验
1.RT-PCR主要实验试剂
TRIzolReagent
DEPC
OneStepRNAPCRKit(AMV)
DNAMarker
琼脂糖
Tris
MOPS
MGP试剂
去离子甲酞胺
去离子甲醛
其他试剂(乙醇、甲醇、冰醋酸、二甲苯、戊二醛等)均为国产分析纯
2.常用试剂的配制
(1)DEPC水(v/v):
在1000ml去离子水中加入DEPC1ml,37℃充分振荡过夜,高压灭菌。
浸泡实验器具的DEPC水:
在1000m去离子水中加入DEPC1ml,充分振荡后即可使用。
(2)75%乙醇(DEPC水配制):
无水乙醉375ml,加入DEPC水定容至500ml。
(3)0.5MEDAT(pH8.0):
EDAT-2Na186.1g,加DEPC水至800ml,充分搅拌。
用NaOH约20g调pH至8.0,用DEPC水定容至1000ml。
高温高压灭菌后分装,室温保存。
(4)1×Tri-HCl(pH8.0):
Tris121.1g,加DEPC水800ml搅拌溶解后,用浓HCl约42ml调pH至8.0,用DEPC水定容至1000ml。
高温高压灭菌后分装,室温保存"
(5)10×TE(pH8.0):
100mMTris-HCI(pH8.0),1mMEDAT(pH8.0),加800mlDEPC
水混合均匀后定容至IL。
高温高压灭菌后分装,室温保存。
(6)EB染液(200μg/μl)I:
澳化乙锭2.0mg,,加DEPC水至10ml,充分搅拌数小时完全溶解后室温避光保存。
(7)1MM乙酸钠:
68g乙酸钠,加DEPC水400ml,搅拌,用DEPC水定容至500ml。
(8)10×MOPS电泳缓冲液:
41.8gMOPS溶解于700ml灭菌的DEPC水中,用2M的NaOH调整到pH7.0,加20ml乙酸钠和20mlMEDAT(pH8.0),用DEPC水调整到1L,避光保存。
(9)10×甲醛变性琼脂糖凝胶:
加1.5g琼脂糖到72ml灭菌去离子水中,煮沸溶解琼脂糖,将溶液冷却到55℃同时加入10ml10xMOPS电泳缓冲液和18ml去离子甲醛后灌胶。
(10)10×甲醛凝胶缓冲液:
甘油5ml,25mg固体澳酚蓝,25mg二甲苯青FF,10mMEDAT(PH8.0)5ml定容至10m。
(11)1.5%琼脂糖凝胶:
琼脂糖1.5g,加入100mll×TBE电泳缓冲液P(H8.3)后在微波炉内加热溶解,冷却至55℃左右加入EB染液(终浓度0.5μg/μl)充分混匀后灌胶。
(12)5×TBE电泳缓冲液(pH8.3):
54gTris碱,27.59硼酸,20ml0.5MEDAT(pH8.0),定容至1L。
(13)6×凝胶载样缓冲液:
0.25%嗅酚蓝(m/v)、0.25%二甲苯青(m/V),30%甘油水溶液,4℃保存。
3.RNA提取方法
(1)组织取出后立刻至于液氮中。
(2)脑组织称取后在液氮存在下研磨3次成粉末状(需要磨成非常细的粉末,否则抽提效率会降低)。
(3)待液氮挥发干,立即加入TRIzol,每100mg组织加1mlTRIzol,用加样枪吹吸,使样品充分裂解,移入1.5mlEP管中,静止5min,以使核酸蛋白复合体完全分离。
(4)在EP管中加200μL氯仿,剧烈振荡15秒,静置5min。
(5)将EP管在4℃12000g,离心15min,离心后混合物分离成一个较低的红色苯酚-氯仿的有机相,一个中间相和一个无色的上层的水相。
(6)用移液器小心吸出上层水相(不要吸取中间白色的中间层)300ml,加入另一EP管中。
(7)加入500μL预冷过的异丙醇,振荡混匀。
-20℃沉淀过夜。
(8)4℃12000g,离心15min,此时在EP管中常常能看到白色沉淀,小自移出
上清。
(9)沉淀中加入lml预冷过的75%乙醇,振荡混匀后4℃7500g,离心5min。
(10)重复用75%乙醇洗涤RNA沉淀一次。
(11)去上清,RNA沉淀于空气干燥5-10min,,加入DEPC水充分济解(难溶时可在55-60℃孵育10min助溶。
4.RNA定量检测
(1)提取适量总RNA用1×xTE稀释200倍,以1xTE作为空白对照。
(2)分别测定在260nm和280nm处的吸光值,纯RNA的OD260/OD280比值应接近2.0(比值最好在1.7-2.0之间)。
(3)在260nm处的吸光度,1OD=40μg/mlNRA。
浓度计算公式如下:
A260光密度值×40×稀释倍数/1000=μg/μlRNA。
5、琼脂糖变性凝胶电泳质检RNA
(1)在EP管内建立变性反应:
对照组总RNA(约5μg)2.0μl
10×MOPS电泳缓冲液2.0μl
去离子甲醛4.0μl
去离子甲酰胺10.0μl
澳化乙锭(200μg/μl)1.0μl
(2)将EP管置于水浴恒温器中65℃温育5min,取出立刻置丁冰上10min,然后离心5s,将所有液体沉淀到EP管内底部。
(3)加2.0μl10×甲醛凝胶缓冲液并重新置于冰上。
(4)将1.5%甲醛变性琼脂糖凝胶放入水平电泳槽内,加入足量1×MOPS电泳缓冲液覆盖凝胶约lmm,加RNA样品到凝胶加样孔中。
(5)5V/cm电压下电泳,直到溴酚蓝移出约8厘米,由于电泳过程中电泳缓冲液的pH值会发生变化,需每小时人工转变缓冲液。
(6)紫外线下观察,拍照。
提取质量较好RNA电泳结果为5s、18s和28s三条带清晰,没有明显的降解,28sRNA条带是18sRNA条带亮度的两倍。
6、RT-PCR反应
(1)按照试剂盒说明书加入试剂。
(2)RT-PCR反应。
(3)反应结束后,取PCR反应液各5μl进行1.5%琼脂糖凝胶(含EB)电泳。
(4)5V/em电压下电泳40min。
(5)紫外线下观察,拍照。
(四)ElISA实验
1.RT-PCR主要实验试剂
2.ElISA操作步骤
(1)取右心血液,在4℃下2000r/min离心10min,取上层血清。
(2)取出ELISA试剂盒平衡至室温。
(3)取出反应板每孔分别加入20μl标准品、20μl血清于反应板孔中。
(4)每孔加入100μlZeroBuffer,轻轻混匀30秒,室温温育30min。
(5)洗板:
甩尽板内液体,用蒸馏水或者洗涤液洗涤反应板,并去除水滴(在厚叠吸水纸上拍干),这样反复洗涤5次。
(6)每孔加入150ul酶联物(Reagent),轻轻混匀10秒,室温温育30min。
(7)洗板:
与步骤5相同。
(8)每孔加入IO0μlTMB显色液,轻轻混匀10秒钟,置暗处室温温育20min。
(9)每孔加入50μl终止液(stopsolution),轻轻混匀30s;确定兰色变为黄色(重要),30min内在45Onm处读OD值。
(10)以OD值为纵坐标,以标准品浓度为横坐标,绘制标准曲线。
根据豚鼠血清样品的OD值可在标准曲线上查出其浓度。
(五)原位杂交实验
1.原位杂交实验所需试剂
TriS
曲拉通X-100
吐温-20
DEPC
mRNA原位杂交试剂盒及专用盖玻片
原位杂交寡核昔酸探针
2.原位杂交所需试剂的配制方法
(1)DEPC水:
在1000ml去离子水中加入DEPC1ml,37℃下充分振荡过夜,高温高压灭菌,浸泡实验器具的DEPC水:
在1000ml去离子水中加入DEPC1ml而,充分振荡后即可使用。
(2)组织细胞打孔液:
DEPC处理的构椽酸缓冲液(0.01mol)99.5ml,加入曲拉通X-1000.5ml,混匀即可。
(3)DEPC处理的PBS缓冲液:
1000mlPBS缓冲液(0.01mol)中加入DEPC1ml,
荡过夜,高温高压灭菌。
(4)0.1molTBS:
8.5gNaCI、l.2gTris用DEPC处理的去离子水定容至I000ml,混匀,用乙酸调pH至7.5。
(5)过氧化氢封闭液:
市售30%的过氧化氢10ml,加DEPC处理的PBS缓冲液定容至100ml,此液现用现配。
(6)4%多聚甲醛:
4g多聚甲醛溶于DEPC处理的双蒸水100ml中,50℃加热搅拌,滴加IN氢氧化钠直至白色的多聚甲醛完全溶解,3号定性滤纸过滤备用。
(7)20×SSC缓冲液的配制:
氯化钠175.3g、柠檬酸三钠88.2g加DEPC处理的去离子水混合均匀后定容至1L。
2×SSC、0.2×SSC依次稀释10倍。
3.原位杂交实验步骤
(1)取组织,于DEPC处理的4%多聚甲醛中固定2h,15%蔗糖(4℃)脱水1天,冰冻切片12μm。
(2)原位杂交合成探针(8μg/ml,地高辛标记)
(3)切片丙酮中浸泡10min,DEPC处理的PBS(0.01M,pH7.4)冲洗3min。
(4)置打孔液中室温10分钟,以改变组织细胞的通透性使探针快速顺利地穿透细胞膜,0.01MPBS冲洗3次,每次3min。
(5)加过氧化氢封闭液室温20分钟,以封闭内源性过氧化氢酶,0.01MPBS冲洗3min。
(6)滴加复合消化工作液覆盖组织表面,4℃20min,0.01MPBS冲洗3次,0.2×
SSC冲洗一次(室温3min)。
(7)滴加预杂交工作液(25μl/张)覆盖组织,37℃孵育盒孵育过夜。
(8)预杂交后,揭去盖玻片,以0.2×SSC37℃洗3次,每次5min。
以上步骤所
用洗液均经DEPC处理。
(9)滴加杂交工作液(25μl/张)覆盖组织,37℃孵育盒孵育6h。
(10)揭去盖玻片以2×SSC37℃洗3次,每次5min;0.2×SSC37℃洗3次,每次5min;0.lmolTBS37℃洗4次,每次5分钟。
(11)滴加小鼠抗地高辛生物素标记的抗体工作液,37℃孵育30min,0.0lMPBS
冲洗3次,每次5min。
(12)滴加高敏过氧化物酶链亲和素复合工作液,37℃孵育30min,0.0lMPBS冲洗3次,每次5min。
(13)DAB显色,光镜下观察,当细胞浆内阳性颜色与细胞外背景色对比度反差明显时,蒸馏水洗终止反应。
胞浆显棕黄色颗粒为阳性反应。
80%酒精-90%酒精-无水乙醇-二甲苯脱水,每步4分钟,中性树胶封片,4℃保存。
或(13)滴加高敏荧光链亲和素复合物(FITC)工作液,4℃湿盒孵育2h。
0.01MPBS冲洗,5min×3次。
甘油封片。
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