酵素活性测定分析.docx
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酵素活性测定分析
基礎生物分子工程實驗
指導老師:
李振綱教授
楊佩芬學姊
簡良榮學長
組員:
A9306042曾楷翔A9306052高鴻哲
A9306074張家健A9306082余亭緯
目錄
細菌細胞的測定………………………………………………………………………p.2
生長曲線…………………………………………………………………………………p.2
Micropipet使用………………………………………………………………………......p.2
分光光度計使用…………………………………………………………………………p.3
培養基製作、劃菌、勾菌…………………………………………………………………p.4
生長曲線測定……………………………………………………………………………p.4
DNA分離與分析……………………………………………………………….…......p.7
質體DNA分離(鹼溶裂法)…………………………………………………….………...p.7
洋菜膠電泳分析…………………………………………………………………………p.7
蛋白質之分離、純化與分析…………………………………………….…..p.10
離子交換層析分離…………………………………………………………...………p.10
金屬層析分離…………………………………………………………………...…….p.10
蛋白質電泳………………………………………………………………….……….....p.10
酵素活性測定分析………………………………………………………….…….....p.13
酵素活性之維持………………………………………………………………………..p.13
反應流程………………………………………………………………………………..p.15
參考資料………………………………………………………………...…..p.19
細菌細胞的測定
生長曲線
一、目的
1.利用培養基的添加碳源不同,探討大腸桿菌E.coli在不同碳源環境下的菌株生長情形。
2.了解細胞如何產生代謝乳糖的機制
二、原理
1.當溶液內養分面臨不足時,細胞會開始想辦法利用其他的來源加以轉化成養分吸
收,同時也因為養分的不足而造成生長緩慢(甚至出現停滯)
2.當養分充足的時候,細胞只會吸收養分,而避免產生轉化的作用,產生不必要的反
應。
反應速率圖如下
三、實驗步驟
(1)Micropipet使用:
1.依據吸取溶液體積選擇Pipet型號。
2.設定體積時,若由低旋到高值,則需超過設定值三分之一的刻度;若由高旋至低值,則直接旋至設定值。
且在轉時避免超過設定值之最大與最小值。
3.套上適當Tip並以下圖方式吸取溶液,盡可能將Tip與液面垂直,且小心緩慢地操作。
4.釋放溶液時,將Tip接觸管壁,慢慢壓下按鈕至第一段,過1~2秒再壓下第二段。
注意事項:
a.勿將Pipet浸入溶液。
b.吸取酸液或具腐蝕性溶液後,請將微量吸管拆解開,各部位零件以蒸餾水沖洗乾淨,擦乾後再正確組合回復原狀。
c.微量吸管的任何部份切勿用火燒烤,亦不可吸取溫度高於70℃的溶液,避免蒸氣侵入腐蝕活塞。
d.吸取黏度高溶液,請先將微量吸管頭尖端以刀片或剪刀將出口切大,並先行預潤後再吸取。
e.套有微量吸管頭的微量吸管,無論微量吸管頭中是否有溶液,均不可平放,需直立架好。
f.用完Pipet後,將其調回量取範圍最大值,以避免彈簧彈性疲乏。
(2)分光光度計使用:
A.基本操作
1.開機並設定儀器(若欲測定波長均在340nm以上,則需記得將Deuterium光源關閉)。
2.將空白試樣放入儀器中歸零,再放入樣品量取
B.牛血清蛋白濃度測定
1.取1mg牛血清蛋白溶於10mL蒸餾水,當標準液。
2.將標準液稀釋成不同倍率,作吸收度測定(與水比較)。
3.取吸收度在0.2~0.8的樣品(至少要五點)作檢量線
4.若標準偏差在0.999左右則Pipet及分光光度計應有一定技術水準。
(3)培養基製作、劃菌、勾菌:
A.培養基製作(LB):
1.配製1%Bactotryptone、0.5%Bactoyeastextract、1%NaCl,並以5NNaOH調至pH7.0。
(%為重量百分比)
2.用濕式滅菌法滅菌30分鐘。
3.待冷卻至50度左右,便在無菌操作台視需要決定是否加入抗生素(A液)。
4.若在步驟
(1)中加入Agar,便可利用倒在培養皿來作LB-plate。
B.劃菌落:
1.以滅菌牙籤(或鉑銥圓環)沾取菌落,並在上法所作之plate以下圖方式劃出橫線。
2.將培養皿倒置,並在其上標示記號及日期,於適當環境培養。
C.勾菌:
1.無菌操作下,取一適當試管(已滅菌過),一手打開試管蓋,加熱管口後,以Pipet吸取3mLA液於試管。
2.將已沾菌落的竹籤伸到溶液內攪一攪,再將管口過火後,把蓋子蓋回。
3.將試管放置於適當環境培養。
D.注意事項:
1.只要沾過菌的器具或培養基,均需滅菌。
桌面或地面沾到菌液均要以漂白水擦拭過或者以高壓滅菌槽滅菌。
2.本實驗以E.coli為例,而酵母菌或E.coli的最佳培養環境為37度。
因此隨著培養菌種的不同,需應調整環境。
(4)生長曲線測定:
1.取兩個滅菌過的三角瓶,各用吸量管吸30mLLB培養基(1%Tryptone、0.5%Yeastextract、1%
NaCl)。
而兩個均加入glucose(0.5%),其中一個多加lactose(1%)以標籤標明。
2.取培養過的E.coli菌液1mL各加入此兩瓶中。
將兩瓶拿去適當環境培養(37℃,170rpm)
3.以LB培養基作blank,將兩瓶每隔1小時測一次光學密度OD600(包含為培養前作為0時。
且吸收度超過0.8時,需稀釋至0.8以下,再借由稀釋倍率來求得光學密度)至到達生長曲線
之停滯期時停止。
四、實驗結果
五、討論
此實驗是未完成的,因為做的時間太少,理論上要做到Lactose的生長曲線會繼續在成長,如下圖理論上應該是這種曲線
在同時存在glucose和lactose的培養基下,菌株會先利用單醣形式的glucose,lactose因為是雙糖不容易被分解掉,所以菌珠比較喜歡用單糖,所以glucose一旦被用完,lactose可以利用promoter表現我們要的蛋白質β-galactosidase,表現出來後lactose一來可以誘導,也可以因為它誘導出β-galactosidase這個酵素,被分解成Glucose和galactose,所以這兩個會變成單糖,因此比較好被分解,所以會有兩段的生長趨勢。
DNA分離與分析
一、原理
質體DNA分離(鹼溶裂法)︰
將細胞懸浮後,利用鹼處理破壞DNA中鹼基對的氫鍵,使質體DNA及染色體DNA打開形成單股結構,再加入酸中和,染色體DNA因分子過於龐大,急速中和反應使得鹼基匆忙配對,形成雜亂無序的巨大分子,加入鹽類使溶解度降低產生沉澱,離心後,質體DNA會留在上清液中,可加入酒精或異丙醇使上清液沉澱即可得所需質體DNA。
藥品
功能
TEbuffe
懸浮細胞
NaOH
使DNA變性
SDS
溶解細胞
醋酸
中和鹼性
鉀鹽
與DNA形成錯合物,有利沉澱
酒精
沉澱質體DNA,去除鹽類
異丙醇
沉澱質體DNA
洋菜膠電泳分析︰
DNA含有磷酸根,在中性及鹼性環境下帶負電,通電後會往正極移動,洋菜膠體中有許多孔隙,濃度越高,孔隙越小;在電場中,不同大小的DNA片段在洋菜膠體的孔隙內往正極移動,體積越大者,移動時所受的阻力越大,其移動越慢,而體積較小者,則移動較快,因此藉由洋菜膠體電泳的過程可將不同大小的DNA分開。
二、試劑藥品
鹼溶裂法
TEbuffer:
25mMTris-HCI,10mMEDTA,pH8
Lysisbuffer:
0.2NNaOH,1%SDS
Neutralizationbuffer:
5Mpotassiumacetate
洋菜膠電泳
洋菜膠(agarose,lowEEO)
1xTAE電泳緩衝液
10x追蹤染劑:
0.25%bromophenolblue,0.25%xylenecyanol,0.1MEDTA,50%glycerol
SYBRgreenstocksolution(100X)
DNAmarker:
包含12個片段100,200,300,400,500,600,700,800,900,1000,1200,1500(bp)
三、操作步驟
製備8-well1.2%agarosegel配製:
1.秤取agarose0.3g,加入1xTAE25mL,微波加熱後注入鑄膠器中
DNA分離:
1.依前述法培養E.coli(含pEGFP-C1)
2.以高速離心6000rpm,1min,收取細胞
3.加入200μLTEbuffer,震盪使細胞懸浮
4.加入200μLLysisbuffer,輕輕翻轉數次
5.加入200μLNeutralizationbuffer,輕輕翻轉數次
6.高速離心12000rpm,10min,取上清液於微量離心管
7.加入500μL異丙醇(IPA),高速離心12000rpm,10min後移除上清液
8.加入500μL乙醇98%,高速離心12000rpm,10min移除上清液
9.將質體DNA靜置烘乾,加入20μLTEbuffer即是純化後質體DNA
洋菜膠電泳分析︰
1.待測樣品溶液分別加入2μLSYBRgreen及2μLloadingdye靜置30min
2.將調配好樣品溶液依序注入well進行電泳
3.以電壓100V進行電泳,待染劑行進至膠體2/3處,關閉電源,取出膠片
4.以UVtransilluminator觀察色帶位置並紀錄結果
5.與標準品分子量比較,估計各DNA片段之分子量
四、實驗結果
Lane1:
A標準品溶液100,200,300,400,500,600,700,800,900,1000,1200,1500(bp)
Lane2:
B樣品溶液(含質體pEGFP-C1)
Lane3:
C樣品溶液(含質體pEGFP-C1)
pEGFP理論大小:
5473bp
(由於操作時間不足,使得色帶分佈較差)
五、結果討論
1.為何C組注入口有殘留?
Ans:
可能是因為我們是利用簡易的鹼溶裂法萃取質體DNA,所以在純化過程中可能會因為固液分離時,抽取到染色體或蛋白質等雜質,致使在電泳分析時會因為分子大小差距甚大,使得大分子雜質在樣品注入槽中殘留。
六、結論
這次選用的標準品分子量100~1500(bp)與待測質體pEGFP-C1理論大小5473(bp)不符,導致無法正確判斷樣品所含DNA分子大小,且因為質體DNA具有三種不同的構形,而標準品分子只具有線性型態存在,所以不能準確判斷質體DNA的大小,但由實驗結果可確定實驗操作中有分離出DNA,並且此DNA大於1500(bp),因此下次電泳操作應改變標準品的DNA色帶分佈。
蛋白質之分離、純化與分析
一、原理
(I)離子交換層析分離
各種蛋白質的帶電性強弱不同,與離子交換介質間吸引力的大小會有差異,可以進行分離。
蛋
白質的帶電性,會因環境的pH不同而有改變。
PI等電點
當pH值介於等電點時protein為電中性,當pH值小於PI則protein帶負電,當Ph值大於PI則
protein帶正電,利用此一特性可依其分子帶電性的差異來分離。
離子層析分為陰及陽離子交換
層析分離,其中差異是在前者之固定相為帶正電後者為負電,則分別會吸附帶負電及正電之蛋
白質。
(II)金屬層析分離
許多蛋白質或酵素分子上帶有金屬離子,則此蛋白質可能會吸附該金屬。
若把某金屬固定到固
定相上,怎此固定相會專一性的吸附需要此金屬的蛋白質。
基因操作時,經常在表現蛋白質的
端點,加上一段含有6個his的片段;則此表現蛋白質,可以吸附到含有鎳的固定相上,洗去
雜質後可用imidazzole流洗出來。
(III)蛋白質電泳
蛋白質分子是由胺基酸組成,而胺基酸帶有可解離的胺基(-N+H3)和羧基(-COO-),是典型的兩性
電解質,在一定的pH條件下會解離而帶電。
帶電的性質和多少取決於蛋白質分子的性質及溶
液的pH值、離子強度。
在某一pH條件下,蛋白質分子所帶的正電荷恰巧等於負電荷數,即靜
電荷等於零,此時蛋白質質點在電場中不移動,溶液的這一pH值稱為該蛋白質的等電點(pI)。
如果溶液的pH值大於pI,則蛋白質分子會解離出氫離而帶負電,此時蛋白質分子在電場中正
極移動。
如果溶液的pH值小於pI,則蛋白質分子結合一部份氫離子而帶正電,此時蛋白質分
子在電場中向負極移動。
而流動率與所帶電荷成正比,而與分子量成反比;但若分子量一樣,但形狀愈不規則,或體積越鬆
散者泳動率越小。
(SDS是界面活性劑,可使蛋白質變性,並在分子表面均勻佈上一層負電荷。
)
二、實驗藥品
(I)離子交換層析分離
1.WashBuffer:
50mMNa2HPO4pH7.0
2.ImidazzoleBuffer:
50mMNa2HPO4pH7.0
3.DEAE-cellulose
(II)金屬層析分離
1.WashBuffer:
50mMNa2HPO4pH8.0NaCl20mM
2.ImidazzoleBuffer:
50mMNa2HPO4pH8.0NaCl250mM
3.金屬螯合親和層析膠體
(III)蛋白質電泳藥品
30%acrylanidemix
1.5MTris(pH8.0)
10%Ammoniumpersulfate
10%SDS
TEMED
三、實驗步驟
(I)離子交換層析分離
1.震盪作為固定相之DEAE-cellulose膠體使之懸浮,小心倒入管柱中,讓膠體慢慢沉降
2.在沉降過程中隨時加入WashBuffer,勿使膠體乾掉。
3.待膠體完全沉降後,高度約在0.5cm左右。
膠柱以WashBuffer一直流洗,流速可以不考慮。
4.將預測液同上述膠體過濾法,當預測液全部沒入膠體後,收集流出液
5.以WashBuffer流洗10ml後,去除膠體上方的緩衝液,但勿使膠體乾掉。
6.最後以ImidazzoleBuffer溶離預測物,流洗約1ml。
7.收集上步驟之衝提液,以進行SDS-PAGE電泳分析。
(II)金屬螯合層析分離
1.固定相金屬螯合親和層析膠體1ml裝填於管柱中,成為一淡藍色膠柱。
2.以WashBuffer5.0ml流洗,加入欲測液2.5ml。
3.再次以WashBuffer5.0ml流洗,最後以ImidazzoleBuffer1.0ml流洗下欲分析物並收集液。
4.收集衝提液,以進行SDS-PAGE電泳分析。
(III)跑蛋白質電泳
1依表配置分離膠體
2.將配置好膠體注入膠槽中,以Isopropanol壓平液面,挿入齒模靜置20min
3.將Isopropanol倒出,依表配置焦集膠體並注入,插入齒模以形成樣品槽
4.將樣品加入3Xloadingdye置於95℃恆溫器中加熱10min(蛋白質標準液只需加熱5min)
5.待加熱樣品冷卻後,依序注入樣品槽,以110V進行電泳分析
6.待染料色帶跑至膠片底部即可關掉電源
7.將膠片取出,置於Stainindbuffer中染色5min
8.將染色後膠片取出,以自來水洗清殘餘染色劑,倒入20mLDestainingbuffer脫色
9.以照相系統存取結果並討論
四、實驗結果
A標準溶液(含6個片段94.7;66.2;45;29;20.1;14.4kd)
B樣品溶液(含VHb)使用金屬螯合層析分離
C樣品溶液(含VHb)使用離子交換層析分離
D樣品溶液(同B)
E樣品溶液(同C)
F標準溶液(同A)
VHb理論大小:
20.1kb
五、結果討論
為何色帶呈現扭曲?
Ans:
可能是當初在製作膠體時,容器底下氣泡未排除乾淨,於是在膠體凝結時,氣泡移動導致膠體分佈不均。
六、結論
蛋白質電泳是利用待測樣品的帶電性不同,藉由膠體的孔隙,使不同大小的蛋白質通過所需時間的時間不同,藉此分析蛋白質的種類;以金屬螯合層析的結果可知分離出的蛋白質分子量主要約為20.1kd,以及少許低於20.1kd的蛋白質存在,有可能是雜質;而離子交換層析所得的結果,在20.1kd附近完全無滯留,可能由於在做離子層析時pH值調整為7,使得PI點為7之蛋白質(VHb)不帶電,導致分離失敗;應在做離子層析分離時,將pH值調整為7以上,使蛋白質帶負電,應可分離出目標蛋白質(VHb)。
酵素活性測定分析
一、實驗目的
1.學習如何正確使用分光光度計
2.學習應用beer’slaw原理
2.測定金屬離子純化酵素三階段,並比較其活性
二、原理
酵素活性之維持
A酵素的安定性不同
酵素在細胞中合成後,有的分泌到細胞外,有的運送到細胞器官中貯存或應用。
前者(分泌性酵素)因為要在細胞外的惡劣環境中生存,因此較為堅韌,不易受到破壞;反之,細胞內的酵素,都以較濃的濃度集中在保護良好的胞器內或胞膜上,一但抽離細胞暴露在氧氣中,可能很容易失去活性。
不同的蛋白質,會有不同的處理方法。
例如,胞膜上的酵素就相當麻煩,在安定性與活性分析上,就有相當的不同;其純化方法,也與水溶性酵素有很大差異。
B.酵素失活的原因
可歸類成如下的物理性或化學性原因。
(1)蛋白質變性:
離開細胞的生理環境後,蛋白質可能遇到極端的pH條件、不適的溫度或變性劑(如SDS或尿素),均會使蛋白質的構形破壞。
(2)酵素活性區破壞:
在抽取過程中,若失去cofactor,或者活性區的關鍵胺基酸被修飾,均可造成。
最常見的影響是氧化,尤其是cysteine上的-SH基很容易被氧化。
一般加入EDTA除去可活化氧分子的二價離子;或加入抗氧化劑,以自身氧化防止-SH基氧化。
(3)蛋白脢水解:
細胞內有許多蛋白脢,細胞被打破後即釋放到酵素溶液中,很快水解酵素。
可用蛋白脢的抑制劑防止之,但蛋白脢有數大類,各有不同類的抑制劑;一般使用PMSF(phenylmethylsulfonylfluoride)是Ser型蛋白脢的抑制劑,但也抑制部分其它類型者;PMSF在水溶液中很快就會降解。
(4)酵素抑制劑:
在自然界中或以人工合成,發現許多酵素有抑制劑,可以專一性地抑制酵素活性;有可逆性的,也有不可逆的,通常不可逆抑制劑的效果都很強烈。
凡是可以水解蛋白質上胜汰鍵的酵素,均統稱為蛋白脢。
蛋白脢的種類非常多,我們大致歸納為四大類,均依其催化特性來命名。
例如metalprotease是因為分子中含一金屬離子,此金屬離子不但可維持酵素的正確分子構形,也可以參與催化反應;Ser及Cysprotease是因為催化區上含有一個Ser或Cys胺基酸為主要的催化機團;而Aspprotease也是因為分子上需要有兩個Asp基團,以便抓住水解所需的水分子。
每一類蛋白脢家族內,其成員的催化機制都相同,但催化目標的專一性不同;例如Ser家族內的trypsin嗜好水解鹼性胺基酸,而chymotrypsin喜歡較大的芳香基團。
c.如何保持活性
若酵素不太穩定,活性不易保持,請參考下列處理方式:
(1)儘快進行純化及各項分析,隨時保持在4℃或冰浴中。
(2)讓酵素保存在硫酸銨固体沉澱中,要比溶液狀態安定得多。
(3)勿讓高純度的酵素,保存在稀濃度溶液中,否則要加BSA當安定劑。
(4)勿隨意凍結或解凍酵素液,可加防凍劑(如甘油或醣類)以液態保存。
(5)冷凍乾燥雖可長期保存酵素,但有些酵素活性可能會因而下降。
(6)若容易受微生物污染,可經無菌過濾後保存(當然也會損失一些酵素)。
酵素活性單位
活性單位(activityunit)是酵素活性高低的指標。
一個活性單位的定義,是在固定溫及pH下,每分鐘可催化1mmole基質的活性。
但很多情況下,為了操作或計算的方便,直接用測定產物所得的吸光值,除以單位時間來表示活性,因此活性單位的定義可能不同。
有關酵素活性及其基本背景,請複習生物化學中的酵素章節;你在大學所念到的酵素知識,在研究所還是完全適用。
反應流程
D型安基酸氧化酶只會反應D型安基酸,所以它不會反應L型的安基酸,會產生NH3跟α-ketoacid還有H2O2,因為α-ketoacid我們不行及時偵測,可是H2O2一反應出來可以馬上跟我們的呈色劑(紅色框框)產生反應,這兩個紅框裡我們必須用peroxidase來進行催化,就會產生有顏色的出來(藍框框)。
三、實驗藥品
H2O、Potassinmphosphatebuffer,pH8.0、D-alanine、o-phenylenediamine/o-dianisidine、
Horseraddishperoxidase、Enzyme(DAOase)
四、實驗步驟
1.取純化後之酵素及粗菌液至於冰水浴中待用
酵素為DAOase
將原菌液利用利用超音波打破菌體,為粗菌液,在利用離子純化液及金屬層析純化液分為purified、throughout,並加以編號
超音波打破時要注意不可轉太久,以免過熱導致蛋白質不能使用
2.分別依序加入
Reagent
Stock
Final
Volume
H2O
675
L
Potassinmphosphatebuffer,pH8.0
1M
0.1M
100
L
D-alanine
0.3M
0.03M
100
L
o-phenylenediamine/o-dianisidine
0.3%
0.03%
100
L
Horseraddishperoxidase
0.25U/
L
5U
20
L
Enzyme(DAOase)
10
L
DAOase加入後動作要快,否則反應已過最高峰,則會有誤差,活化的目的將不會明顯的呈現出來
3.將分光光度計開啟,並點選Timecoursemeasurement,在選擇Measurement之parameter將參數依下列更改Photometricmode=abs;Response=quick;wavelength=453nm;Endtime=300sec;Datapitch=0.2sec;Display=auto
4.利用分光光度計之動力學參數來偵測OD453之隨時間變化。
5.分別分析粗菌液、離子交換純化液及金屬層析純化液之間之活性差異。
計算:
beer’slaw
A:
吸收度
:
莫耳吸收光度b:
輻射路徑長度c:
濃度
比活性(U/ml)=
=
Vt(總體積)=1005
LVs(樣品體積)=0.01
L
12.6:
Millmolarex
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