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中药学论文中药分析与鉴定

本科毕业论文

HPLC法同时测定复方盐酸特比萘芬压敏胶贴剂中酮康唑和盐酸特比萘芬的含量

二级学院

中药学院

专业

中药学（中药分析与鉴定方向）

班级

学生姓名

学号

指导教师

2018年4月

诚信声明

我声明，所呈交的毕业论文是本人在老师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。

据我查证，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得其他教育机构的学位或证书而使用过的材料。

我承诺，论文中的所有内容均真实、可信。

毕业论文作者（签名）：

年月日

目录

摘要I

关键词：

I

1前言1

2仪器与试药4

2.1仪器4

2.2试剂与试药4

3方法与结果5

3.1色谱条件5

3.2混合对照品储备液的制备5

3.3供试品溶液的制备5

3.4阴性对照溶液的制备5

3.5系统适用性试验5

3.6线性关系考察7

3.7重复性试验8

3.8精密度试验9

3.9稳定性试验10

3.10加样回收率试验11

3.11样品含量测定12

4讨论12

4.1样品处理的方法12

4.2检测波长的选择12

4.3流动相的选择12

5结论13

参考文献14

综述15

透皮贴剂的研究进展15

致谢24

HPLC法同时测定复方盐酸特比萘芬压敏胶贴剂中

酮康唑和盐酸特比萘芬的含量

摘要目的：

建立以高效液相色谱法同时测定盐酸特比萘芬压敏胶贴剂中酮康唑和盐酸特比萘芬含量的方法。

方法：

色谱柱为ThermoODS-2Hypersil柱（4.6mm×250mm，5μm），流动相为甲醇-0.03mol·L-1醋酸铵溶液（84:

16），流速为1.0mL·min-1，检测波长为244nm，柱温为室温。

结果：

酮康唑和盐酸特比萘芬的浓度分别在8.160～81.60μg·mL-1（r=0.9996）和31.30～313.0μg·mL-1（r=0.9997）范围内与峰面积呈良好的线性关系；平均回收率分别为100.0%和99.3%，RSD分别为2.2%和2.5%。

结论：

本方法快速简便，重复性好，专属性强，可作为盐酸特比萘芬压敏胶贴剂的质量控制方法之一。

关键词：

盐酸特比萘芬压敏胶贴剂；酮康唑；盐酸特比萘芬；高效液相色谱法

SimultaneousDeterminationofKetoconazoleandTerbinafineHydrochloeideinTerbinafine/KetoconazolepatchbyHPLC

Abstract：

ObjectiveToestablishanHPLCmethodforthecontentdeterminationofketoconazoleandterbinafinehydrochloeideinTerbinafine/Ketoconazolepatch.Methods：

TheanalyticalwascarriedoutwithThermoODS-2Hypersil（4.6mm×250mm，5μm）columnandthemobilephaseconsistedofmethanol-0.03mol·L-1ammoniumacetate（84:

16）asaflowrateof1.0mL·min-1.Thedetectionwavelengthwas244nm.Results：

Thecalibrationcurvewaslinearwithintherangeof8.160～81.60μg·mL-1（r=0.9996）and31.30～313.0μg·mL-1（r=0.9997）forketoconazoleandterbinafinehydrochloeide,respectively.Theaveragerecoverieswere100.0%（RSD=2.2%）and99.3%（RSD=2.5%）forketoconazoleandterbinafinehydrochloeide,respectively.Conclusion：

Themethodissimple,accurate,reproducibleandprecise,andapplicableforthedeterminationofketoconazoleandterbinafinehydrochloeideinTerbinafine/Ketoconazolepatch.

KeywordsTerbinafine/Ketoconazolepatch；ketoconazole；terbinafinehydrochloeide；HPLC

1前言

透皮吸收贴剂是经皮给药系统（transdermaltherapeuticsystemortransdermaldrugdeliverysystems，简称TTS）之一，作为未来药物剂型开发的重点方向，是指通过皮肤给药，使药物通过皮肤各层进人体循环并达到有效血药浓度，从而产生全身或局部的治疗作用，实现疾病治疗或预防的一类制剂[1]。

中国是世界最早使用透皮吸收制剂的国家，中医外治法（即“经皮给药”）源远流长，中医典籍《黄帝内经》中早在公元前二世纪已有关于外治法的相关记载[2]，透皮给药技术是中医外治法之一，清代名医徐洄溪曾对经皮吸收制剂有过如此阐释：

“汤药不足尽病，人之疾病，由外入内，其流行于经络脏腑，必服药乃驱之，若其病既有定所，在皮肤筋骨之间可按而得者，用膏药贴之，闭塞其气，使药性从毛孔而入其腠理，通经贯络，或提而出之，或攻而散之，较之服药尤有力，此至妙之法也。

”中国传统的透皮吸收制剂大部分表现为膏药的形式，如黑膏药和白膏药，主要用于冶疗跌打损伤、风湿疼痛、骨质增生以及关节疼痛等病症，如狗皮膏、麝香壮骨膏、伤湿止痛膏、消痛贴膏（原奇正消痛贴）等。

但现代的透皮吸收制剂在制作方法、所用基质材料和用途范围等方面与传统的膏药有极大差别，绝大部分的透皮吸收贴剂都是以压敏胶作为药物储库，其中压敏胶起着保证释药面与皮肤紧密接触以及药库、调节药物释放等作用[3]。

作为透皮贴剂的关键因素，压敏胶基质一般具有良好的黏附性能，使贴剂能够与皮肤表面牢固而柔软地密接，易于剥离，对药物要有理想的溶解度，在固定面积条件下，能提供足够的经皮流率和足够长时间的载药量。

选择压敏胶的依据包括药物在压敏胶基质中的溶解度，分散系数和渗透系数，目前用于透皮贴剂的压敏胶类型有聚异丁烯压敏胶、热熔型压敏胶、聚丙烯酸酯压敏胶和硅酮压敏胶等。

透皮吸收系统的有效性主要表现为：

皮肤是人体最大的器官，而人体的皮肤组织中存在着极为丰富的毛细血管网，全身血循环有1/3在皮肤进行，药物通过皮肤表层后，可以很快被吸收进入血液循环，对于口服给药吸收效果很差或者会对肝脏等产生毒副作用的药物而言，透皮给药是非常理想的药方式。

正常人的皮肤由表皮，真皮及皮下脂肪组织三部分组成，表皮在皮肤的最外层，从外到里依次为生发层，颗粒层，透明层和角质层，表皮内无血管，因此药物在表皮内不能被吸收；真皮内有丰富的毛细血管、淋巴管、神经、皮脂腺、毛囊及汗腺等；皮下脂肪组织在真皮之下，其中有许多血管、淋巴管和汗腺。

真皮和皮下脂肪组织对药物穿透的阻力小，药物进入真皮及皮下脂肪组织后容易被毛细血管及淋巴管所吸收。

透皮吸收制剂中药物经皮吸收的机制主要包括三个环节，分别是释放，渗透以及吸收进入血液循环三个阶段，其中释放是指药物从基质中脱离出来并扩散到皮肤或黏膜表面；渗透是指药物通过表皮进入真皮，皮下组织，对局部组织起治疗作用；吸收是指药物通过皮肤微循环或与黏膜接触后通过血管或淋巴管进入体循环而产生全身作用。

现代研究表明：

药物的经皮吸收主要通过3条途径，分别为：

完整的表皮，表皮具有类脂膜性质，脂溶性药物可以非解离型通过皮肤，但解离型药物则难以通过，一般认为药物的主要吸收途径为角质层细胞及其细胞间隙；毛囊和皮脂腺，毛囊、皮脂腺开口于表皮，进入毛囊口及皮脂腺的药物能通过毛囊壁及皮脂腺到达真皮或皮下组织，皮脂腺分泌物是油性的，有利于脂溶性药物透过皮肤；汗腺，大分子药物和离子型药物可以通过汗腺及毛囊。

皮脂腺途径转运，当药物达到平衡后，该途径的作用就显得很微弱。

与传统的给药途径相比，透皮吸收制剂具有许多优点，如可以通过恒定速率持续释放药物来延长有效作用时间，从而减少给药频率；皮肤间层兼具储库作用，可以避免药物浓度的峰谷现象，维持最佳血药浓度，并减少由血浆峰浓度造成的不良反应；皮肤所含蛋白水解酶较少，药物所处环境稳定；避免药物通过胃肠道时遭受各种因素的影响而被破坏，或者避免某些药物对胃肠道所产生的副作用；免除肝脏内酶对药物的代谢分解作用即首过效应，同时避免了某些肝毒性较大的药物对肝脏的损害，如许多抗癌药物在使用较大剂量时会产生不良副作用，比如肝脏毒性等[4]，由于经皮给药可以避免首过效应，因此，通过经皮给药，减少给药剂量的方法，可降低抗癌药物对人体全身的毒性；由于神经系统位于皮下大约l00nm处，在此部位之上导入药物没有疼痛感，透皮给药系统能够实现无痛注射；除上述几点以外，透皮吸收制剂还具有便于携带，可自主用药，使用方便，可随时中断用药，减少给药次数等优点。

过去，皮肤用药主要用于治疗皮肤局部疾病，但随着1981年美国FDA批准了NovartisConsumerHealth公司生产的抗晕药东莨菪碱贴剂生产上市后，透皮吸收制剂近年来已经逐渐成为制药工业领域的研究热点，目前国际上竞相生产透皮吸收制剂的公司就有数十家，涉及的品种有几十个，正在研究准备上市的品种有数百种，治疗领域主要涉及疼痛、心脑血管疾病、激素替代治疗、帕金森氏综合症、儿童多动症等，比较知名的透皮贴剂有治疗慢性疼痛的芬太尼贴剂，治疗炎症的双氯芬酸二乙胺透皮贴剂，治疗神经性疼痛的利多卡因贴片，治疗夜间哮喘的妥洛特罗贴剂等。

我国对透皮贴剂的开发起步较晚，国内比较知名的贴剂有云南白药创可贴，可用于小面积外创伤口的止血，镇痛，消炎，透气和愈创，其他常见的贴剂产品有小儿退热贴、硝酸甘油贴剂、可乐定贴剂等。

但由于中药多为复方用药，药味较多、成分比较复杂、有效成分不明确且含量较低、专一性较差[5]，目前我国在透皮吸收制剂工艺方面的研发远远落后于欧美国家，但随着石油化工，高分子材料的迅速发展，近年已经发展出许多新的基质和新的辅料，而且国内对于透皮技术和药物透皮吸收机制的研究也日益深入，中药透皮贴剂的研究开发得到了快速发展，国内通过对如青蒿琥酯[6]、磷酸川芎嗪[7]等药物的透皮实验研究，对其透皮吸收的规律以及释药机制进行了探讨，同时对透皮促进剂的选择等方面进行了考察，取得了良好的效果，国内应用于临床的中药贴剂品种越来越多，质量与应用也不断提高与扩大，常用的有如舒妇贴膏、消痛贴膏、消肿止痛贴、丁桂儿脐贴等。

复方盐酸特比萘芬压敏胶贴剂是由盐酸特比萘芬和酮康唑组成的透皮吸收制剂，主要用于甲真菌病的治疗。

其中特比萘芬属于丙烯胺类抗真菌药，其药理作用机制为高选择性抑制真菌角鲨烯环氧化酶[8]，能特异性地干扰真菌麦角固醇的早期生物合成，从而使真菌细胞膜形成过程中角鲨烯环氧化反应受阻，达到杀灭或抑制真菌的作用，常用于治疗股癣、头癣、甲癣等皮肤疾病[9]，酮康唑属咪唑类抗真菌药，该品的药理作用机制主要为高度选择性干扰真菌的细胞色素P-450的活性，从而抑制真菌细胞膜上麦角固醇的生物合成，使真菌细胞膜结构破坏，达到抗真菌作用[10]，对皮真菌、酵母菌（念珠菌属、糠秕孢子菌属、球拟酵母菌属、隐球菌属）、双相真菌和真菌纲有抑菌和杀菌作用。

两者联合用药，可以扩大抗菌谱，使抗真菌疗效更为显著[11,12]，做成经皮给药剂型后，酮康唑和盐酸特比萘芬可经皮肤直接吸收，无肝脏首过效应，药物利用率高，吸收速率稳定，具有使用方便、安全性好、作用迅速、给药剂量小、患者依从性好等优点[13]。

目前尚未有同时测定盐酸特比萘芬压敏胶贴剂中盐酸特比萘芬和酮康唑的报道，本研究采用HPLC法[14,15]，同时测定复方盐酸特比萘芬压敏胶贴剂中盐酸特比萘芬和酮康唑的含量，为复方盐酸特比萘芬压敏胶贴剂的质量控制提供了方法。

2仪器与试药

2.1仪器

KQ-500型超声波清洗仪

昆山市超声仪器有限公司

UV1102紫外可见分光光度计

上海天美科学仪器有限公司

CP225D型电子天平

德国Sartorius公司

SHZ-D（Ⅲ）循环水式真空泵

巩义市英峪予华仪器厂

AUY220型电子天平

广州佑科仪表仪器有限公司

ThermoODS-2Hypersil柱（4.6mm×250mm,5μm）色谱柱

上海赛默飞世尔科技公司

P230型液相色谱仪大连依利特分析仪器有限公司

大连依利特分析仪器有限公司大连依利特分析仪器有限公司

2.2试剂与试药

盐酸特比萘芬对照品

中国食品药品检定研究院（100563-200301）

酮康唑对照品

中国食品药品检定研究院（100294-201203）

盐酸特比萘芬压敏胶贴剂

信东生技股份有限公司（批号分别为TE9512-BA1,TE9512-BA2,TE9512-BA3）

甲醇（分析纯）

天津市富宇精细化工有限公司

甲醇（色谱纯）

霍韦尼尔贸易（上海）有限公司

醋酸铵

江苏强盛化工有限公司

超纯水

实验室自制

3方法与结果

3.1色谱条件

色谱柱为ThermoODS-2Hypersil柱（4.6mm×250mm,5μm），流动相为甲醇-0.03mol·L-1醋酸铵溶液（84:

16），流速为1.0mL·min-1，检测波长为244nm，柱温为室温，进样量为10μL。

3.2混合对照品储备液的制备

分别取酮康唑对照品和盐酸特比萘芬对照品适量，精密称定，置同一50mL量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，作为混合对照品储备液Ⅰ，酮康唑对照品和盐酸特比萘芬对照品的浓度分别为81.60μg·mL-1和313.0μg·mL-1。

同法制得对照品储备液Ⅱ，其中酮康唑对照品和盐酸特比萘芬对照品的浓度分别为4.224mg·mL-1和18.10mg·mL-1。

3.3供试品溶液的制备

取载药盐酸特比萘芬压敏胶贴剂1片，分别剪成小条，除去保护层，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇50mL，称定重量，超声处理（功率500W，频率40KHz）30min，取出，放冷，再称定重量，用甲醇溶液补足减失的重量，摇匀，先用滤纸过滤后，再经0.45μL微孔滤膜过滤，即可得到供试品溶液。

3.4阴性对照溶液的制备

取不含酮康唑和盐酸特比萘芬的压敏胶贴剂1片，按“3.3”项下方法制备溶液，即得阴性样品溶液。

3.5系统适用性试验

分别取上述制备的阴性对照溶液、混合对照品溶液和供试品溶液，在上述“3.1”项色谱条件下进样分析，理论塔板数按盐酸特比萘芬计算不低于4000。

盐酸特比萘芬色谱峰和酮康唑色谱峰与相邻峰之间分离度均大于1.5，阴性对照对测定无干扰，拖尾因子满足测定需要。

系统适用性试验的结果如图1所示。

A

B

C

A.空白，B.对照品，C.样品；1.酮康唑，2.盐酸特比萘芬

图1高效液相色谱图

3.6线性关系考察

分别精密移取上述“3.2”项下制备的混合对照品储备液Ⅰ1mL、2mL、4mL、6mL、8mL和10mL，置不同的10mL量瓶中，加甲醇稀释定容至刻度，摇匀，即得系列对照品混合溶液。

在上述“3.1”项条色谱条件下，分别进样10μL测定，记录酮康唑和盐酸特比萘芬峰面积。

以对照品浓度X（μg·mL-1）为横坐标，酮康唑和盐酸特比萘芬的色谱峰峰面积（Y）为纵坐标，分别绘制标准曲线，得到酮康唑的回归方程为Y=1.662×104X-1.797×104，回归系数r为0.9996；盐酸特比萘芬的回归方程为Y=1.911×104X-8.555×104，回归系数r为0.9997。

结果表明，酮康唑在8.160～81.60μg·mL-1范围内与峰面积呈良好的线性关系，盐酸特比萘芬浓在31.30～313.0μg·mL-1范围内与峰面积呈良好的线性关系。

酮康唑和盐酸特比萘芬浓度与峰面积的线性关系考察结果见表1，两种成分的标准曲线分别见图2、图3。

表1酮康唑和盐酸特比萘芬线性关系考察

成分

C（ug·mL-1）

峰面积

酮康唑

8.160

118128

16.32

252712

32.64

512246

48.96

804726

65.28

1084802

81.60

1323000

盐酸特比萘芬

31.30

516778

62.60

1108643

125.2

2248800

187.8

3550820

250.4

4761331

313.0

5837578

图2酮康唑标准曲线图

图3盐酸特比萘芬标准曲线图

3.7重复性试验

取同一批样品（批号为TE9512-BA3），按“3.3”项下方法分别制备6份供试品溶液，在上述“3.1”项色谱条件下，依次进样分析，计算酮康唑和盐酸特比萘芬含量分别为1.699mg·片-1和8.533mg·片-1，其中，样品中酮康唑含量的RSD为0.83%，盐酸特比萘芬含量的RSD为1.3%。

结果表明，方法重复性良好。

重复性试验的结果见表3。

表3重复性试验

成分

峰面积

平均值

SD

RSD%

酮康唑

543160

547907

6502

1.0

544243

549013

540569

552669

550091

盐酸特比萘芬

3215053

3175025

43182

1.4

3123359

3175619

3122272

3196114

3217735

3.8精密度试验

取同一供试品溶液（批号为TE9512-BA3），在上述“3.1”项色谱条件下，连续进样6次，计算酮康唑色谱峰峰面积的RSD为1.0%，盐酸特比萘芬色谱峰峰面积的RSD为1.1%。

结果表明，仪器精密度良好。

精密度试验的结果见表4。

表4精密度试验

成分

峰面积

平均值

SD

RSD%

酮康唑

534606

536804

5519

1.0

535226

536408

535387

547574

531622

盐酸特比萘芬

3085621

3109639

33862

1.1

3115739

3106071

续表4

成分

峰面积

平均值

SD

RSD%

盐酸特比萘芬

3106218

3171004

3073183

3.9稳定性试验

取同一供试品（批号为TE9512-BA3），按“3.3”项下方法分别制备6份供试品溶液，于室温条件下放置，分别于0h、0.5h、1h、2h、4h和6h，在上述“3.1”项色谱条件下，分别进样分析，计算供试品溶液中酮康唑和盐酸特比萘芬色谱峰峰面积的RSD分别为1.4%和1.5%。

结果表明，样品溶液室温条件下放置6h内，两种组分均可以保持稳定。

稳定性试验的结果见表5。

表5稳定性试验

时间

成分

峰面积

平均值

SD

RSD%

0h

酮康唑

525413

528829

7103

1.3

0.5h

526831

1h

520719

2h

535269

4h

525144

6h

539588

0h

盐酸特比萘芬

2998574

3057135

45933

1.5

0.5h

3056776

1h

3014241

2h

3087741

4h

3062677

6h

3122803

3.10加样回收率试验

取已知含量的样品（批号为TE9512-BA3），每份0.5片，分别剪成小条，除去保护层，置具塞锥形瓶中，分别加入不同量的混合对照品储备液Ⅱ，按“3.3”条方法操作，制备低、中、高3个浓度的供试品溶液，每个浓度各3份，在上述“3.1”项色谱条件下进样分析。

按峰面积计算，酮康唑和盐酸特比萘芬的平均回收率分别为100.0%（RSD=2.2%）和99.3%（RSD=2.5%），加样回收率试验结果如见表6。

表6加样回收率试验

成分

原有量（mg）

加入量（mg）

测得量（mg）

平均回收率（%）

RSD（%）

酮康唑

0.8370

0.4224

0.4151

100.0

2.2

0.8370

0.4224

0.4189

0.8370

0.4224

0.4029

0.8370

0.8448

0.8439

0.8370

0.8448

0.8496

0.8370

0.8448

0.8538

0.8370

1.267

1.291

0.8370

1.267

1.293

0.8370

1.267

1.294

盐酸特比萘芬

4.228

1.810

1.798

99.3

2.5

4.228

1.810

1.758

4.228

1.810

1.708

4.228

3.620

3.597

4.228

3.620

3.615

4.228

3.620

3.581

4.228

5.430

5.559

4.228

5.430

5.428

4.228

5.430

5.554

3.11样品含量测定

取批号为TE9512-BA1，TE9512-BA2，TE9512-BA3的盐酸特比萘芬压敏胶贴剂，按“3.3”项下方法操作，分别制备每种批号的供试品溶液各3份，按上述“3.1”项色谱条件测定，记录酮康唑色谱峰和盐酸特比萘芬色谱峰的峰面积，利用标准曲线法计算分别计算出复方盐酸特比萘芬压敏胶中酮康唑和盐酸特比萘芬的含量。

样品含量测定的结果见表7。

表7含量测定结果（n=3）

样品批号

酮康唑含量

（mg·片-1）

RSD

（%）

盐酸特比萘芬含量

（mg·片-1）

RSD

（%）

TE9512-BA1

1.645

0.18

8.378

0.84

TE9512-BA2

1.668

0.38

8.504

0.87

TE9512-BA3

1.674

0.99

8.456

1