小鼠Ipr1基因与EGFP基因融合表达载体的构建及其在鼠巨噬细胞中的表达.docx
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小鼠Ipr1基因与EGFP基因融合表达载体的构建及其在鼠巨噬细胞中的表达
小鼠Ipr1基因与EGFP基因融合表达载体的构建及其在鼠巨噬细胞中的表达
作者:
李娜,朱道银,帖儒修,王瑜伟
【摘要】 目的:
构建小鼠胞内病原体抗性基因1(Ipr1)基因与EGFP基因融合表达载体,观察小鼠Ipr1基因在小鼠巨噬细胞株中的表达。
方法:
从C57BL/6J小鼠胸腺组织提取总RNA,以RTPCR法调取Ipr1基因编码序列,克隆至pEGFPC1载体中,筛选阳性克隆作PCR、酶切及测序鉴定后得到pEGFPIpr1,脂质体瞬时转染小鼠巨噬细胞株,以空质粒pEGFPC1转染组作为对照。
采用RTPCR法检测Ipr1的RNA水平表达及用激光共聚焦显微镜观察融合蛋白的表达及细胞内定位。
结果:
扩增出小鼠Ipr1基因编码序列,经PCR、酶切及测序鉴定证明得到正确的重组质粒pEGFPIpr1,脂质体瞬时转染小鼠巨噬细胞株得到了成功表达,Ipr1基因表达产物定位于细胞核内。
结论:
成功地调取小鼠Ipr1基因,构建了小鼠Ipr1基因与EGFP基因融合表达载体并在小鼠巨噬细胞株得到了成功表达。
Ipr1编码蛋白定位于细胞核内,提示其是一种调节蛋白。
【关键词】Ipr1基因结核病绿色荧光蛋白定位
[Abstract]AIM:
ToconstructaneukaryoticexpressionvectorcontainingthefusiongeneofmouseIpr1andEGFPandtostudyitsexpressioninmurinemacrophage.METHODS:
ThecodingsequenceofIpr1genewasamplifiedfromthetotalRNAofC57BL/6JmousethymusbyRTPCR.ThegenewasclonedintopEGFPC1andtherecombinantplasmidwasidentifiedbyPCR,restrictendonucleasedigestionandsequencing.ThenthepEGFPIpr1wastransientlytransfectedinto.TheexpressionofIpr1geneandfusionproteinwasdetectedbyRTPCRandlaserscanningconfocalmicroscopy.RESULTS:
ThewholecodingsequenceofIpr1wassuccessfullyamplified.TherecombinantplasmidwasidentifiedbyPCR,restrictendonucleasedigestionandsequencing.Thefusionproteinwassuccessfullyexpressedinthetargetedcellsanditslocalizationwasinnucleus.CONCLUSION:
TheeukaryoticexpressionvectorpEGFPIpr1hasbeensuccessfullyconstructed.Thefusionproteincanbeexpressedinmurinemacrophageandlocatedinnucleus.
[Keywords]Ipr1gene;tuberculosis;pEGFPC1;location
结核病位居单一病原体引起患者死亡的传染病之首,全球每年死亡200余万人。
我国属结核病高负担国家,结核病感染人数居全球第二。
感染结核分枝杆菌(Mycobacteriumtuberculosis,Mtb)的人中仅10%的人发展为结核病,除环境等因素外,遗传可能决定了机体的易感性[1]。
2005年Pan等[2]在小鼠巨噬细胞内发现了一个介导巨噬细胞抗胞内病原体的基因,称为胞内病原体抗性基因1(intracellularpathogenresistance1,Ipr1),该基因与结核病的易感性有着密切的关系。
Ipr1基因缺陷的小鼠感染Mtb后巨噬细胞表现为坏死,从而有利于细菌在宿主体内的繁殖与扩散;而表达Ipr1基因的小鼠,巨噬细胞则发生凋亡,对Mtb的感染表现出天然的抗性。
Ipr1基因抗Mtb的具体机制尚不清楚,因此了解Ipr1基因在巨噬细胞抗Mtb固有免疫和适应性免疫中的作用具有重要意义。
1材料和方法
材料清洁级C57BL/6J小鼠由重庆医科大学实验动物中心提供。
Clontech公司质粒载体pEGFPC1、大肠杆菌TOP10、小鼠巨噬细胞株由本室保存。
组织/细胞总RNA抽提试剂盒、RTPCR试剂盒(TaKaRaOneStepRNAPCRKit)、DNA聚合酶、限制性内切酶KpnⅠ/BamHⅠ、DNA连接试剂盒(DNALigationKit)、DNAmarker、抗生素等均购自大连宝生物公司。
PCR引物合成及测序由上海生工完成。
质粒小量抽提试剂盒、PCR产物纯化试剂盒及胶回收试剂盒均购自上海华舜公司。
RPMI1640培养液购自Gibco公司,胎牛血清为杭州四季青公司产品。
转染试剂Lipofectamine2000购自Invitrogen公司。
激光共聚焦显微镜为德国LeicaTCSNT。
方法
C57BL/6J小鼠胸腺组织总RNA的提取摘眼球放血颈椎脱臼处死小鼠,无菌操作取胸腺组织,迅速放入液氮,研磨后按组织/细胞总RNA抽提试剂盒说明提取总RNA,去离子甲酰胺溶解,15g/L琼脂糖凝胶电泳,-70℃保存。
RTPCR根据以发表的Ipr1基因序列(NCBIAY845984)设计2条引物,在其5′端分别加上KpnⅠ、BamHⅠ限制性酶切位点,P1:
5′TGCGGTACCATGTTCACTCTGACCAAAGC3′,P2:
5′CGCGGATCCCTAGGCACCCTTCTTTTGA3′。
内参阳性对照用一对扩增βactin的222bp大小片段的引物,P3:
5′GCTGTCCCTGTATGCCTCT3′,P4:
5′TTGATGTCACGCACGATTT3′。
按照TaKaRaOneStepRNAPCRKit试剂盒说明进行RTPCR,逆转录条件为50℃30min,94℃2min;PCR条件为98℃变性10s,59℃退火30s,72℃延伸90s共30个循环。
10g/L琼脂糖凝胶电泳观察后胶回收符合目的基因大小的条带。
克隆至pEGFPC1载体PCR胶回收产物与pEGFPC1分别用限制性内切酶KpnⅠ、BamHⅠ酶切4h后经PCR产物纯化试剂盒分别纯化PCR产物和载体大片段,用DNALigationKit试剂盒中的SolutionⅠ将载体大片段与PCR产物连接,反应条件为16℃1h。
连接产物转化至CaCl2法制备的感受态大肠杆菌TOP10中,涂布含有30mg/L卡那霉素的LB平板,37℃过夜,次日挑取阳性菌落,转种至含有30mg/L卡那霉素的LB培养液中200r/min37℃摇菌过夜,收集菌体提取质粒后10g/L琼脂糖凝胶电泳观察,阳性质粒进行PCR、KpnⅠ/BamHⅠ双酶切鉴定正确后送上海生工测序。
细胞转染及表达产物的检测及细胞内定位小鼠巨噬细胞株细胞用含100mL/L胎牛血清的RPMI1640培养液置37℃、50mL/LCO2培养箱进行培养,在细胞状态良好时常规胰酶消化转种至6孔板及预先放入8mm×8mm载玻片的24孔板中,待细胞状态良好及细胞汇片至70%时按转染试剂Lipofectamine2000操作步骤瞬时转染pEGFPIpr1及空载体pEGFPC1[3]。
转染开始后1~8h每隔1h于倒置荧光显微镜下观察融合蛋白表达情况以及转染后16、24、48h时荧光亮度变化情况。
根据倒置荧光显微镜观察结果选取转染后24h的细胞进行表达的鉴定:
将6孔板细胞抽提总RNA进行RTPCR检测Ipr1基因RNA水平表达;取出24孔板细胞爬片,1×PBS洗涤3次,950mL/L乙醇固定30min,水溶性封片剂封片后立即置激光共聚焦显微镜下观察,激发波长488nm,发射波长525nm,采集图像分析融合蛋白的表达及定位。
2结果
C57BL/6J小鼠胸腺组织总RNA的完整性及纯度鉴定提取C57BL/6J小鼠胸腺组织总RNA,测定A260/280为左右,取1μL进行琼脂糖凝胶电泳显示总RNA的28S和18SrRNA带型清晰,表明总RNA较完整(图1)。
RTPCR扩增结果RTPCR产物经10g/L琼脂糖凝胶电泳后,在约1338bp处得到特异性目标条带,与Ipr1基因的编码区大小相符(图2)。
图1C57BL/6J小鼠胸腺组织总RNA琼脂糖凝胶电泳结果(略)
Fig1ResultofC57BL/6JmousethymustotalRNA
图2Ipr1基因的RTPCR结果(略)
Fig2RTPCRofIpr1
M:
DL2000DNAmarker;1:
RTPCRproductofIpr1gene;2:
Positivecontrol.
pEGFPIpr1的构建及鉴定插入正确片段的重组菌落经PCR扩增后,电泳可见到与目的片段大小一致的PCR产物条带(图3)。
图3PCR鉴定结果(略)
Fig3PCRidentificationofIpr1
M:
DL2000DNAmarker;1:
PCRproductofIpr1.
抽提质粒KpnⅠ/BamHⅠ双酶切后琼脂糖凝胶电泳表明,酶切后产生一线性空载体条带及一条与理论预测值一致的目的片段(图4)。
测序结果与GenBank上公布的Ipr1基因(1338bp)的cDNA编码序列一致,获得正确的含Ipr1基因的重组质粒pEGFPIpr1。
pEGFPIpr1转染细胞及表达产物的检测及细胞内定位瞬时转染细胞24h后RTPCR结果显示pEGFPIpr1转染组在1338bp左右和222bp左右出现条带,空载体pEGFPC1转染组及未转染质粒组在1338bp左右未见条带(图5)。
图4pEGFPIpr1重组质粒KpnⅠ/BamHⅠ双酶切结果(略)
Fig4EnzymedigestionanalysisofpEGFPIpr1
M:
DL15000DNAmarker;1:
pEGFPIpr1/KpnⅠ/BamHⅠ;2:
pEGFPC1/KpnⅠ/BamHⅠ.
图5pEGFPIpr1转染细胞24hRTPCR结果(略)
Fig5RTPCRofIpr1transcriptionproductionincellsat24h
M:
DL2000DNAmarker;1:
cellstransfectedwithpEGFPIpr1;2:
cellstransfectedwithpEGFPC1;3:
Nontransfectedcells.
转染后倒置荧光显微镜观察结果显示,在转染4h开始有微弱荧光表达,此时荧光表达即位于细胞核内。
随后荧光亮度逐渐加强,在24h时荧光最强,48h荧光强度与24h荧光强度相似。
转染24h的细胞爬片激光共聚焦显微镜观察结果显示,转染pEGFPIpr1组绿色荧光表达定位于细胞核内,空载体pEGFPC1转染组绿色荧光则均匀地表达于整个细胞质和细胞核中(图6)。
图6pEGFPC1Ipr1转染细胞24h融合蛋白的表达及细胞定位(略)
Fig6LaserscanningconfocalmicroscopyanalysisofIpr1EGFPfusionproteininpEGFPIpr1transfected
A:
transfectedwithpEGFPIpr1;B:
transfectedwithpEGFPC1.
3讨论
结核病的病原体——Mtb是一种胞内寄生菌,感染人体后的结局主要取决于Mtb与机体免疫力之间的相互作用。
Mtb感染机体后首先入侵巨噬细胞,此时巨噬细胞可以通过一系列机制(将Mtb吞噬体递送至溶酶体、产生反应性氮中间产物、诱导自身发生凋亡等)对Mtb进行杀伤,但在机体免疫力不足时Mtb就可以在巨噬细胞内繁殖,或长期潜伏形成潜伏感染。
因此巨噬细胞被认为是抗Mtb感染的第一道防线[4]。
有研究显示,如果抑制巨噬细胞的功能,即使在机体抗结核病获得性免疫被正常激活的条件下,机体仍无法完全清除感染的Mtb[5]。
因此,在抗Mtb感染的免疫应答中,巨噬细胞发挥着极其重要的作用。
宿主的遗传因素影响机体对结核病的易感性,如主要组织相容性复合物(MHC)基因、维生素D受体(VDR)基因[1]等。
2000年,Kramnik等[6]在一种对Mtb特别易感的小鼠品系C3HeB/FeJ(感染Mtb4~5周死亡,而普通小鼠要6~8月死亡)的1号染色体上鉴定出一段基因序列sst1(supersusceptibilitytotuberculosis1)与该品系小鼠对Mtb易感性有关。
2005年,该研究小组将C3HeB/FeJ小鼠的sst1区域的序列用C57BL/6J小鼠(对结核病有抵抗性的品系)的相同区域序列置换得到C3HeB/FeJ小鼠的同源导入品系小鼠sst1,发现该鼠产生了对结核病的抵抗性,并由该序列克隆得到Ipr1基因,该基因具有体外调节巨噬细胞对病原体反应能力的作用。
然后用转基因方法使易感品系C3HeB/FeJ小鼠获得了对结核病的抵抗性,证实了Ipr1基因的作用。
Ipr1基因表达的上调能有效提高巨噬细胞抗Mtb感染的固有免疫能力,但其具体机制尚不清楚,而在人类基因组中存在着与小鼠Ipr1基因高度同源的基因SP110b,Ipr1基因与SP110b基因一样含有SP100基序(主要参与介导蛋白质和蛋白质间的相互作用)、染色质结合域(SANDdomain)和核定位信号(NLS)。
因此研究者推测Ipr1和SP110可能具有相同的功能,即通过参与核激素受体、病原体、干扰素信号间的信息交流介导机体抗胞内寄生菌的固有免疫[2]。
本实验中Ipr1基因的调取选用的实验动物是已经报道表达Ipr1基因的C57BL/6J小鼠。
选用小鼠巨噬细胞株细胞是由于该株细胞来源于BALB/c小鼠,目前国内外还未见报道其有Ipr1基因的表达,我们的实验结果表明未在该细胞中检测出Ipr1基因mRNA水平的表达,因此细胞是我们研究Ipr1基因在巨噬细胞抗Mtb等胞内寄生菌机制的理想细胞株。
绿色荧光蛋白(GFP)是目前公认的较为优良的一种标记基因,与目的基因融合后既保持外源蛋白的生物学活性,又表现出与天然GFP相似的荧光特性[7],因此利用GFP可以比较直观的判断转染效率及目的基因的功能定位。
本实验我们成功构建了EGFP与Ipr1的融合表达质粒并在小鼠巨噬细胞株细胞中得到成功表达,Ipr1基因编码产物定位于细胞核内,实验过程中我们未观察到该基因的编码产物在细胞质中的表达,这一结果符合Pan等[2]对Ipr1基因含有核定位信号(NLS)的分析。
本实验证实了Ipr1编码蛋白具有细胞核定位的特性,从而提示Ipr1编码蛋白可能作为一种调节蛋白参与细胞的转录调控。
该结果为下一步研究Ipr1基因的功能,揭示Ipr1基因在抗结核分枝杆菌感染的机制方面奠定了实验基础。
【参考文献】
[1]BellamyR.Geneticsusceptibilitytotuberculosis[J].ClinChestMed,2005,26
(2):
233-246.
[2]PanH,YanBS,RojasM,etal.Ipr1genemediatesinnateimmunitytoTuberculosis[J].Nature,2005,434(7034):
767-772.
[3]马玲娣,张彦,文世宏,等.小鼠TIM2基因真核表达载体的构建及鉴定[J].细胞与分子免疫学杂志,2006,22(6):
713-715.
[4]PietersJ.Entryandsurvivalofpathogenicmycobacteriainmacrophage[J].MicrobesInfect,2001,3(3):
249-255.
[5]FremondCM,YeremeevV,NicolleDM,etal.FatalMycobacteriumtuberculosisinfectiondespiteadaptiveimmuneresponseintheabsenceofMyD88[J].JClinInvest,2004,114(12):
405-412.
[6]KramnikI,DietrichWF,DemantP,etal.GeneticcontrolofresistancetoexperimentalinfectionwithvirulentMycobacteriumtuberculosis[J].ProcNatlAcadSciUSA,2000,97(15):
8560-8565.
[7]StearnsT.Greenfluorescentprotein.Thegreenrevolution[J].CurrBiol,1995,5(3):
262-264.
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