以pPIC9K为例的酵母表达纯化.docx
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以pPIC9K为例的酵母表达纯化
以pPIC9K为例的酵母表达纯化
以pPIC9K为例,pPIC9K是用于在毕赤酵母中的多拷贝整合分泌表达蛋白的穿梭载体,利用组氨酸缺陷型标记进行互补筛选。
一、信号肽的2步切割
pPIC9K载体带有自身信号肽,在分泌过程中被切除,但是由于切割效率,在目的产物N端带有3,5个左右的信号肽的氨基酸。
设计引物时,为了防止切割不完全,能去掉GluAla两个重复单位,不过文献报道多个Glu会提高kex2的切割效率。
要求目的蛋白中不能含有信号肽酶切割序列:
glu-lys-arg-glu-ala-glu-ala。
信号肽的切除分为两步:
kex2在glu-lys-arg和glu-ala-glu-ala
之间初步切除,STE123在两个glu-ala之间切割。
二、是否在3'端是带上一些其本来的序列,
1,首先,你要保证表达后细胞内信号肽酶能正确识别原来的位点,即此位点是不能随便增减的,否则信号肽不能正常切割,在这个基础上你再决定3'端其本来序列的去留。
2,一般5'端多出一些氨基酸不会明显影响到你的目的蛋白的活性,我们平时在做酵母表达时,信号肽切割后,目的蛋白往往有几个多余的AA,这对活性好象没什么影响,虽然如此,但你还得注意多余AA的性质,不能过酸或过碱。
三、重组pPIC9K/GS115表达出目的条带后,
确定信号肽是否切除完全的方法:
1、N端测序
2、先查查你的氨基酸序列里有没有糖基化位点,如果有就只能N端
测序了。
如果没有,看分子量大小。
信号肽中有kex2和ste13两个酶切位点,现在担心的是kex2的位点
酶切完全了,但ste13的两个酶切位点glu,ala重复序列没有切干
净,如果这两个氨基酸没有切除完全的话,分子量差异不大,两个氨
基酸的差异应该看不出来,一般来说,N端多一两个AA应该对蛋白
的活性没有太大影响。
western检测有两个条带的问题,可能是目的
蛋白有一部分被降解了。
四、附:
信号肽切割原理和优化切割
《ExpressionofYourRecombinantProteinwithaNativeN-terminus》
IfyouwishtohaveyourproteinexpressedwithanativeN-terminus,youshouldclone
yourgeneflush(直接地)withtheKex2cleavagesite.UsePCRtorebuildthesequencefromtheXhoIsiteatbp1184-1189totheargininecodonatnucleotides1193-1195.Remembertoincludethefirstaminoacidofyourprotein,ifnecessary,forcorrectfusiontotheKex2cleavagesite.
SignalSequenceProcessing
Theprocessingoftheα-factorsignalsequenceinpPICZα
occursintwosteps:
1.ThepreliminarycleavageofthesignalsequencebytheKEX2geneproduct,
finalKex2cleavageoccurringbetweenarginineandglutamineinthesequence
Lys-Arg*Glu-Ala-Glu-Ala,where*isthesiteofcleavage.2.TheGlu-AlarepeatsarefurthercleavedbytheSTE13geneproduct.
OptimizationofSignalCleavage
InSaccharomycescerevisiae,ithasbeennotedthattheGlu-Alarepeatsarenotnecessary
forcleavagebyKex2,butcleavageafterGlu-Lys-Argmaybemoreefficientwhen
followedbyGlu-Alarepeats.AnumberofaminoacidsaretoleratedatsiteXinsteadof
GluinthesequenceGlu-Lys-Arg-X.Theseaminoacidsincludethearomaticaminoacids,
smallaminoacids,andhistidine.Proline,however,will
inhibitKex2cleavage.Formore
informationonKex2cleavage,pleasesee(Brakeetal.,1984).
TherearesomecaseswhereSte13cleavageofGlu-Alarepeats
isnotefficient,andGlu-
AlarepeatsareleftontheN-terminusoftheexpressedprotein
ofinterest.Thisis
generallydependentontheproteinofinterest.continuedonnextpage
五、翻译Genebank所查序列
为设计一个引物,在Genebank上查找序列如下:
CDS序列是57,560,sig_peptide从57,119,mat_peptide从
120,557。
问题如下:
1、sig_peptide和mat_peptide各代表什么意思,sig_peptide是
不是就是信号肽,哪mat_peptide是什么,
2、sig_peptide前面1,57是序列的什么部分,
3、cDNA序列中除了CDS是编码区外其它部分主要起什么作用,在设
计引物时应该从第一个碱基开始还是从信号肽开始,还是从CDS的第
一个碱基开始~
答:
sig_peptide信号肽,mat_peptide成熟肽,就是切除信号肽以
后的成熟蛋白元件。
sig_peptide前面1,57是5‘非编码序列,它
一般含有Kozard序列,在翻译起始过程中发挥作用。
3’非编码序列
是帮助翻译的终止。
酵母转化原理:
LikeSaccharomycescerevisiae,linearDNAcangeneratestabletransformantsofPichia
pastorisviahomologousrecombinationbetweenthetransformingDNAandregionsof
homologywithinthegenome(Creggetal.,1985;Creggetal.,1989).Suchintegrants
showextremestabilityintheabsenceofselectivepressureevenwhenpresentasmultiplecopies.Notethatsinglecrossoverevents(insertions)aremuchmorelikelytohappenthandoublecrossoverevents(replacements).Multipleinsertioneventsoccurspontaneouslyatabout1-10%ofthesingleinsertionevents.
像酿酒酵母,线性化的转化DNA和Pichiapastoris基因组的同源区
域发生同源重组,使得线性化DNA产生稳定的转化子(Creggetal.,
1985;Creggetal.,1989).这样的整合方式显示极强的稳定性,即
使多拷贝转化子在没有选择压力的情况下也很稳定.单交换事件(插
入)比双交换事件(置换)发生几率更大.单插入事件中约发生1-10%概
率的多插入事件.
电转化注意点:
一、制备感受态的菌液收集时间:
1、准确测定OD值:
OD在1.2,1.5之间。
1)为了准确测定OD值,建议将菌液稀释不同浓度测定(1、2、4、8、16倍稀释,看其OD值是否呈线性关系)。
每个倍数做3,5个重复,应该可以大致推断OD值是否准确~菌液看上去浑浊,但OD值不高,很可能OD稀释倍数不够~
2)OD值是否测准也可以这样估算:
OD600为40左右时,菌体湿重(6000rpm离心5min)约0.95g/10ml。
高密度发酵时菌体湿重将相应下降。
2、75ml的菌,经18h左右的培养,最后sorbital洗涤完毕后,50ml离心管里所剩菌体特别浓,需要1mlsorbitol才可溶解为糊状。
正常培养的OD在1.2,1.5之间的500ml菌液,收集的感受态也用1ml稀释的,没那么粘稠。
可以看看降低培养温度(27摄氏度)或缩短培养时间(12h)。
3、甚至不用转接,直接挑单克隆在50,100mlYPD中摇过夜,效果也很好
二、制备感受态的菌液量
如果只转一个样品,50ml就够了,一般50ml的培养液如果OD值正常的话够做10管感受态的,其他的按比例缩小。
用大试管摇5ml菌
液,然后取1ml毫升在1.5mlEP管中制感受态,每一步的离心时间30秒就行。
整个流程时间短,制备好的感受态用来做转化的效率很高。
山梨醇离心,洗涤的过程之后的重悬的时候注意浓度,不要过于粘稠和稀释。
三、感受态的保存
感受态细胞做好后由于电转化杯还没有处理好等原因,在冰上放几个小时再做可能有一定的影响,尽量马上制备马上转化。
如果感受态细胞要保存,不需要加甘油,一般80ulEP管分装,-70或-80摄氏度保存。
另附:
酵母GS115点种分离纯化
接种GS115于5mlYPD液体培养基,30?
,200rpm振荡过夜,涂布YPD平板,30?
培养48小时,用YNB基本培养基和含His的补充培养基作点种分离纯化,挑选在补充培养基生上生长而在基本培养基上不生长的单菌落划YPD平板,4?
保存。
四、电转化注意点:
1、感受态做好后,最后一次吸出sorbital时,不是直接倒调的,而是用毛细管轻吸出来的,这样可能使剩下的感受态纯净些。
2、最后用毛细管取出100ul出来,加入质粒,混匀~(怕量不够,吸
得很多,电转时效果反而不好。
)
3、电转杯清洁处理:
一般先冲洗,洗净;然后浸泡在75%的乙醇中;使用前我们都是放在超净台上,开启紫外,边吹风晾干,边进行紫外照射。
电转杯的新包装或重复使用可能对转化率有一定的影响。
4、电击的时候,电压数以及电击时间可以摸索一下,适当增加电压或者延长电击时间都可以。
电击条件比如1.5kv,放电4.8,5.5ms。
电击所有过程都要尽量在冰上进行,电击时间可以减少一点,设置为5ms左右,电击之后马上加入预冷的山梨醇溶液,转移至EP管,30度静止培养1h。
如果菌体悬液浓度比较大的时候,在制备感受态的时候要留心一下操作中的问题了。
5、电击之后,加入1ml的山梨醇,吸入1.5ml的ep管中,置于30度摇床低速培养1h,再涂板。
6、注意的是处理液中的DTT是在使用前加入,其它配好后于4度保存,DTT单独于-20度保存,可配成100倍的贮备液。
7、转化后1ml用sorbitol重悬的细胞悬液不能全部涂在一块板子上,按标准程序制作的感受态一般3块左右可能比较合适,以干燥后看见一薄层淡淡的白色为宜。
转化子会在白色的薄层上长出圆韵、饱满的大菌落的。
五、转化试剂和培养基的正确准备方法
1、MD板子提前几天做好,放在冰箱里,涂板的时候吸收效果会好些。
如果是新板子,可能吸收不是太好,板子上有些积层,反而不利于生
长。
2、YNB42度水浴一会,然后过滤除菌,YNB是加到培养基里面的,去离子水pH偏低,建议直接用蒸馏水就可以(关系不是太大)。
3、山梨醇,以及无菌去离子水均是冰冻,存放在4度冰箱中4、一般用10ug以上质粒用SalI酶切,然后直接加乙醇沉淀,70,乙醇洗一遍,约20ulddH2O重溶。
转化效率一般大于100个克隆每ugDNA。
有人用LiCl和DTT处理细胞,转化效率很高,可以试试。
建议你不要用胶回收kit,回收的DNA可能还有盐,导致电击时放电时间很短。
5个电转化方案
方法一:
高效
1.收集菌体
取1mlGS115过夜培养物(OD约6-10)分装到1.5mlEP管中,4?
、10000g离心1min,弃上清,沉淀用无菌水(4?
)洗涤,同样条件下离心,弃上清。
2.菌体处理
加入1ml处理液,室温下放置20min。
处理液:
10mMLiAc
10mMDTT
0.6Msorbitol
10mMTrisHCl(pH7.5)
3.离心,弃上清,加入1ml1Msorbitol,离心,弃上清,4.用1Msorbitol洗涤二次,到最终体积约为80μl.(菌体太多可适当弃去部分)
5.加入10μl.经过Bgl?
酶切处理的工程质粒,混匀后转入电击杯中,冰浴5min.
6.电转.1.5kv,25μF,200Ω条件下进行电转。
7.电击后立刻加入1mL1Msorbitol,吸出后于30?
培养2h。
8.取一定量涂平板(YPDS+Zeocin,涂布的量分别为100、200微升,剩余的经离心处理后全部涂在一个平板上)
有一点要注意的是处理液中的DTT是在使用前加入,其它配好后于4度保存,DTT单独于-20度保存,可配成100倍的贮备液。
方法二:
按下面步骤转化,开始每个板子只长了一二十菌落;小细节修改后,每个板长了约100个.
步骤如下:
1、目的DNA(pPIC9K),经电泳检测已经线性化(SalI酶切);2、DNA纯化方法是经酚仿,氯仿两步抽提后,无水乙醇沉淀的,目测定量应足够;
3、GS115甘油菌经新鲜平板复苏后,5ML培养过夜,16h左右后,取菌1:
100稀释,接种于70ml菌液扩大培养,14h后测得OD600约1.3
左右。
4、将sorbital、水和菌液均冰浴;
5、菌液离心5min,100ml冰水洗涤,50ml冰水洗涤,4mlsorbital洗涤,然后溶解于300ul冰sorbital;
6、加入约5,10ug的DNA,枪吹匀,置0.2CM电转杯静置5min;7、电击,1,5KV.
8、立即加入1ml冰浴的sorbital,静止10min。
9、取100ul转化液,涂布10cm的MD平板。
做了一点修改每块板子大概能长100来个菌落(一般需要2天左右):
1、菌液收集时间:
以前可能是OD值测得不太准确,我然后把菌液分别做了1、2、4、8、16倍稀释,看其OD值是否呈线性关系。
1、菌液测OD值时,建议将菌液稀释不同浓度测定,这样才准确些。
菌液看上去浑浊,但OD值不高,很可能就是你的OD稀释倍数不够~你分别稀释2倍、4倍、8倍、10倍等,每个倍数做3,5个重复,应该可以大致推断OD值是否准确~
2、我开始是先挑单克隆于5mlYPD中,过夜16h后,转接于50mlYPD中,培养大概18个小时吧。
OD值是否测准可以这样估算:
OD600为40左右时,菌体湿重(6000rpm离心5min)约0.95g/10ml。
高密度发酵时菌体湿重将相应下降。
[测OD,用什么作空白对照呢,菌体稀释液,我一般使用PBS]
3、电击条件等上面帖子上都有,1.5kv,放电4.8,5.5ms。
2、其它做法相同,就是感受态做好后,最后一次吸出sorbital时,
不是直接倒调的,而是用毛细管轻吸出来的,这样可能使剩下的感受态纯净些。
3、最后用毛细管取出100ul出来,加入质粒,混匀~(我以前怕量不够,吸得很多,电转时效果反而不好。
)
4、MD板子提前几天做好,放在冰箱里,涂板的时候吸收效果会好些。
如果是新板子,可能吸收不是太好,板子上有些积层,反而不利于生长。
5、你说的YNB,我用的是成品,只需要直接配制。
42度水浴一会,然后过滤除菌。
我没有加硫酸铵。
YNB是加到培养基里面的,去离子水pH偏低哦,我建议直接用蒸馏水就可以了(关系不是太大)。
方法三:
简便独特
在筛选高表达菌种中,与大多数人和说明书有区别(成功做出几个基因):
每次转化前,均用多种酶BlgII/salI/sacI同时切,转化时,用GS115/KM71/KM71H同时转化,转化的条件也和大家一样,即1.5/25/200,但是我用的是0.1的杯子,不是0.2的,转化后涂MM及YPD+0.25G,长出菌落后,即进行大规模的表达试验,直接用YPD表达的,一般48h后即进行大量的SDS-PAGE鉴定,鉴定时,样品不用浓缩,直接上样,看到目的带后再做PCR,测序。
方法四:
没有转化子(无aa的YNB和硫酸铵称好后,去离子水溶解,
然后高压灭菌)
1.挑取酵母单菌落,接种至含有50mlYPD培养基的三角瓶中,30?
、250-300rpm培养过夜约14h,OD600约1.3
2.菌液离心5min,50ml冰水洗涤,25ml冰水洗涤,2mlsorbital洗涤,然后溶解于200ul冰sorbital;两管分装,每管100ul3.加入约5,10ug的线性化的DNA20ul,枪吹匀,置0.2CM电转杯冰浴5min;
4.电击,1,5KV.使用的是Eppendorf2510,用于转化细菌及酵母。
5.立即加入1ml冰浴的sorbital,静止1h。
将菌体悬液涂布于MD平板上,每300µl涂布一块平板;
方法五:
和Invitrogen公司说明书差不多的方法
X33菌株于100mlYPD摇到OD600约1.1-1.3,太高影响感受态效率
(1)1500,1700g离心5min,将离心管倒置在吸水纸上轻轻控几下,充分弃上清
(2)加入100ml冰浴的超纯水ddH2O,可在振荡器上振荡混匀,可静置3,5分钟
(3)离心,弃上清,再加100mlddH2O洗一遍
(4)离心,弃上清,加20ml冰浴1MSorbitol洗一遍(5)离心,弃上清,菌体置于冰浴中,加入约100,200ulSorbitol
混匀
加入Sorbitol量需自己调整,这时菌液很浓,只要能够用200ul
黄枪头吸出来就可以了,一般共有约400,500ul,够做几管感受态了。
(7)吸取100,150ul感受态到线性化的DNA中,用枪头打匀或手指弹匀
静置5min,于2mm电转化杯中,电击参数:
1.5KV,25uF,200欧姆(不是400),一般放电时间在4.5-4.9ms之间,小于4说明你的DNA盐浓度太高
(9)立即加入1mlSorbitol,转入10ml离心管,30度静置1小时,然后加入1mlYPD,30度,200rpm摇1小时,取50,200ul菌液涂100ul/mlYPDS板
(10)一般转化效率可以达到:
200个以上转化子每200ul菌液,足够筛选表达菌株了。
方法六:
酵母感受态细胞的制备
?
接种PichiapastorisGS115于5mlYPD液体培养基,30?
,250~300250rpm,过夜。
?
取200µl的培养物接种至含有500ml新鲜培养基的三角摇瓶中,28~30?
、250~300r/min培养过夜,一般12小时左右。
?
将细胞培养物于4?
,5000g离心5min,用500ml的冰预冷的无菌水将菌体沉淀重悬;
?
按步骤3离心,用250ml的冰预冷的无菌水将菌体沉淀重悬;?
按步骤3离心,用20ml的冰预冷的1M的山梨醇溶液将菌体沉淀
重悬;
?
按步骤3离心,用1ml的冰预冷的1M的山梨醇溶液将菌体沉淀重悬,其终体积约为2ml;
?
NOTE:
可将其分装为200µl一份的包装冷冻起来,但如果保存时间过长会影响其转化效率。
化学转化
毕氏酵母氯化锂转化法
试剂
1.1MLiCl:
用去离子蒸馏水配制,滤膜过滤除菌;必要时用消毒去离子水稀释
2.50%PEG3350:
SigmaP3640用去离子蒸馏水配制,滤膜过滤除菌,用较紧的盖子的瓶子分装
3.2mg/mlsalmonspermDNA/TE(10mMTris-Cl,pH8.0,1.0mMEDTA)-20?
保存
注:
醋酸锂对毕氏酵母无效,仅氯化锂有效;PEG3350可屏蔽高浓度LiCl的毒害作用;
毕氏酵母的转化
1.煮沸1ml鲑鱼精DNA5min,迅速冰浴以制备单链担体DNA;2.将感受态酵母菌离心,以Tips去除残余的LiCl溶液;
3.对于每一个转化,按以下顺序加入:
50%PEG3350240ul
1MLiCl36ul
2mg/ml单链SalmonspermDNA25ul5,10ug/50ulH2O质粒DNA50ul
4.剧烈旋涡混匀直至沉淀菌体完全分布均匀(约1min);5.30?
水浴孵育30min;
6.42?
水浴热休克20,25min;
7.6000,8000rpm离心收集酵母菌体;
8.重悬酵母于1mlYPD培养基,30?
摇床孵育;
9.1,4h后,取25,100ul菌液铺选择性培养基平板,于30?
培养2,3天鉴定(将表达菌株和对照菌株在固体培养基平板,30'c培养至转化子出现)
毕氏酵母PEG1000转化法
试剂
缓冲液A:
1.0MSorbitol,10mMBicine,pH8.35(sigma),3%(v/v)ethyleneglycol
缓冲液B:
40%(w/v)PEG1000(sigma),0.2MBicine,pH8.35缓冲液C:
0.15MNaCl,10mMBicine,pH8.35未污染的新鲜、试剂级DMSO,-70?
保存
注:
1.缓冲液A、B、C均用滤膜过滤,-20?
保存;2.将DNA直接加在冻结的酵母细胞上是本实验的关键之处(即使在冰上解冻的待转化细胞,其摄取外源DNA的能力也在解冻过程中迅速下降;如进行多样品的转化,建议按6样品/组进行);
待转化毕氏酵母的制备
1.接种环接种Pachiapastoris于YPD平板,30?
培养2d;2.挑取单克隆酵母菌株于10mlYPD培养基中,30?
振荡培养过夜;3.取步骤2中小量菌液接种到100mlYPD培养基中振荡培养,待其OD值从0.1升到0.5,0.8;
4.室温下3000g离心收集酵母菌体,50ml缓冲液A洗涤一次;5.重悬菌体于4ml缓冲液A中,按0.2ml/管分装于1.5ml的离心管中,每管加入11ulDMSO,混合后迅速于液氮中冷冻,6.-70?
保
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