细胞培养地过程及注意事项.docx

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细胞培养地过程及注意事项

36细胞培养的过程及注意事项

细胞的培养过程及注意事项；根据培养过程中是否需要分割培养物进行再培养而将细；一、原代培养；

（一）过程；原代培养的基本过程包括取材、培养材料的制备、接种；1、组织块培养法；

（1）基本操作过程；1）、用培养液湿润所取组织材料，并用锋利的眼科剪；2）、用湿润的吸管吸取切碎的组织块，清清吹到培养；3）、将培养瓶翻转，使瓶底朝上，在种植了组织块一；4）、将种植了组织块

细胞的培养过程及注意事项

根据培养过程中是否需要分割培养物进行再培养而将细胞培养分为原代培养和传代培养。

一、原代培养

（一）过程

原代培养的基本过程包括取材、培养材料的制备、接种及培养等步骤。

原代培养的方法很多，基本和最常用的是组织块培养法和分离细胞法。

1、组织块培养法

（1）基本操作过程

1）、用培养液湿润所取组织材料，并用锋利的眼科剪将附在其上的脂肪和结缔组织去除干净。

再用平衡液（PBS）或Hanks液漂洗；用锋利的眼科弯剪将组织块剪成小块；再用PBS或Hanks液漂洗多次，直至液体不浑浊、无油滴、清亮为止。

2）、用湿润的吸管吸取切碎的组织块，清清吹到培养瓶皿中，并将其按一定间距均匀放在培养瓶底壁上，量不要过多，要将组织块切面贴在培养瓶底壁上；

3）、将培养瓶翻转，使瓶底朝上，在种植了组织块一侧的对侧面加足培养液，勿使组织块与培养液接触，塞紧瓶塞；

4）、将种植了组织块的一侧朝上，静置于37℃培养箱中；待组织块贴壁1h到3h后翻瓶，使贴壁的组织块浸没与培养液中，静置；

5）、每隔2到3天更换一次培养液，或者根据培养瓶种颜色的变化确定换液时间。

2、注意事项

1）、组织块接种后的前3天，从组织块向外迁徙的细胞数很少，组织块的黏附不牢固，在观察和移动的过程中，注意不要引起液体的振荡。

要避免经常翻动和振动，否则组织块不易附着于瓶壁上或附着后也会脱落飘起。

2）、加入的培养液不宜过多，避免浸泡的组织块受轻微的波动而脱落下来。

3）、用组织块培养时，要及时观察，当细胞向外迁徙出来后要注意记录并去除漂浮的组织块和残留的细胞，因为已漂浮的组织块和那些细胞碎片已经死亡，它们产生的有毒物质会影响原代细胞的生长，要及时清除。

4）、为促进组织块尽快粘贴在培养瓶皿上，可以在种植前先将胶原薄层涂在培养瓶底壁上。

细胞培养过程中，胶原中的促细胞贴附因子先吸附于培养瓶底壁上，悬浮的圆形细胞再与已吸附有促贴物质的底壁附着。

2、分离细胞培养法—贴壁型细胞培养

（1）基本操作过程

1）、首先用细胞分散法收获细胞，随时吸取少量消化液在镜下观察，并根据组织是否分散成细胞团或单个细胞，采取终止消化措施。

用筛网滤掉未消化的组织块。

2）、低速离心细胞悬液，弃掉上清液，加入含血清的培养液，轻轻吹打制成细胞悬液，计数并用培养液调整细胞密度。

3）、根据培养的细胞类型和实验要求，用吸管吸取一定量的细胞悬液，加到培养瓶中。

对于需要特殊底物的细胞，要先将底物涂一层于培养瓶皿底壁，然后接种细胞。

4）、将培养瓶放入37℃恒温箱中培养。

5）、每隔2到3天更换培养液一次或根据培养液颜色的变化确定换液时间。

（2）注意事项

1）原代培养的分离细胞在初次接触体外环境时，虽然被分散成单个细胞，但它们之间的互相影响还是存在的，而且这种影响对细胞能否存活是非常重要的。

在这些细胞之间能产生一些促生长的活性物质，使细胞彼此互相促进存活和生长。

如果接种的细胞密度过低，细胞之间的促生长作用很小，虽然营养物质很充足，也很难使细胞适应从体内的组织环境到被分散后进入独立生存环境的变化过程。

如果接种的细胞密度过大，会导致营养物质供应不足，代谢废物积累较快需要经常换液和传代。

2）原代培养时初始培养在组织分散和分离细胞时细胞可能会受到严重的损伤。

适当增大原代培养接种的细胞密度，给培养的细胞提供更多的类似于在体内时细胞之间的相互作用，会极大提高原代培养的细胞在体外存活率。

待细胞适应体外环境后进行传代培养时再以较低的密度接种和培养。

3）由于细胞之间的相互的内在联系被打破，分离细胞在体外培养时经历的生存环境改变很大，在体外存活和生长的难度相应增加。

对于贴壁依赖性细胞来说，尽快使接种的细胞贴壁，是决定培养能否成功的关键。

可以在接种后先将培养瓶置培养箱内培养3h到5h，由于细胞悬液中带有少量培养液，细胞即可以维持存活，又可以很快接触到培养瓶底壁，是细胞迅速黏附于底物，待细胞贴壁后，再补足培养液继续培养。

3、分离细胞培养法—悬浮型细胞培养

（1）操作过程

1）制备细胞悬浊液，计数并用培养液调整细胞密度。

2）在培养皿中加入足够的培养液。

3）将欲接种的细胞接种到培养器皿中。

4）在培养皿内放入一个有聚四氟乙烯包被的磁棒。

将培养皿封口，送入恒温箱内。

在磁力搅拌器上边搅拌边培养。

若接种培养瓶或试管中，封口后可将培养器皿固定在恒温摇床上，边摇动边培养，无需放置磁棒。

有些细胞也可以不用磁棒或磁力搅拌器，也不必使用恒温摇床，接种于预先用硅脂包被的培养器皿内直接在培养箱中静置培养即可。

5）培养液略呈黄色换液。

吸出部分旧培养液，加入新鲜培养液即可。

（2）注意事项

1）进行悬浮细胞培养时必须保持细胞的悬浮状态。

可以通过增加培养液的黏度来帮助细胞呈悬浮状态，如给培养液中加入低浓度的透明质酸复合物。

在有搅拌装置的培养器皿内加入培养液是，以5ml为最低限度，否则搅拌时会产生气泡对细胞造成伤害。

使用这种方式需注意勿使搅拌速度过快，否则即可使培养液溢出又容易造成污染。

如果培养液的量在5ml以下，可以采用旋转瓶培养。

给悬浮培养的细胞换液时要注意不要吸出细胞。

2）能够进行悬浮培养的细胞，其生命力一般都比较旺盛，体外分裂增殖的速度较快，营养成分消耗大，换液时间隔一般较短。

（二）原代培养的注意事项

1、在原代培养的1天到2天内，要特别注意观察是否有细菌、真菌的污染，一旦发现，要及时清除，防止造成其它细胞的交叉感染；

2、随着培养的进程，培养液中的营养物质被逐渐的消耗，营养成分越来越少，细胞代谢产物越来越多，有细胞呼吸过程中释放出来的CO2及其它产物如乳酸、丙酮酸等也逐渐增加。

随着酸性物质的增加，培养液中的pH值越来越低，培养液的颜色也越来越黄。

因此，在细胞培养的过程中，要注意培养液颜色的变化，并根据培养液的颜色来决定换液时间。

正常情况下，培养液呈桃红色；当培养液呈橙黄色时，细胞一般生长情况良好；呈淡黄色时，可能培养时间较长，营养不足，死亡细胞较多；呈紫红色时，可能是细胞生长状态不好或已经死亡。

所以，应在培养液略黄时吸出部分旧培养液，然后补加同等数量的新鲜培养液。

换液过程中，不要吸出细胞，不要使培养液溢出培养瓶，避免各种微生物的污染。

换液时，应将培养液事先预温至37℃。

一般培养一天，组织细胞即可在培养瓶皿底壁黏附并贴壁生长。

2天到3天后，细胞恢复增殖活动。

随着培养时间的延长，细胞数量逐渐增多，消耗的营养物越来越多，需要换液的时间越来越短，当细胞逐渐长满培养瓶壁并形成一单层细胞时，细胞之间相互发生接触和联系，逐渐产生接触抑制作用，培养物生长速度减慢。

当培养物最后形成一层完整的细胞单层时，生长几乎停止。

在细胞高达80%融合时就需要进行传代了。

二、传代培养

（一）传代培养的过程

1、组织块培养物的传代过程

基本操作过程：

（1）将原代培养物连同底物盖玻片一同取出，置于无菌的培养皿上。

（2）用刀将培养物分割，刮去多余的部分，剩余继续培养的部分。

一般是分割刮去组织

块外围的部分组织，留下中央的部分组织继续培养。

或部分分割并挑去组织块，留下迁移出来的细胞于底物盖玻片上继续培养。

也可以将组织块挑出，再种植于新的底物盖玻片上继续培养。

（3）给剩余的培养物加上培养液，放入培养箱中继续培养。

2、分离细胞培养物—贴壁型细胞的传代过程：

有两项核心工作：

一是分割培养物，二是再接种。

基本操作过程：

（1）取出培养瓶，打开瓶盖，用吸管吸出旧的培养液。

（2）用无Ca、Mg的平衡盐溶液轻轻漂洗培养物1次到2次，洗去残余血清后弃去平衡盐溶液。

（3）在培养皿内加入胰蛋白酶溶液，室温下消化5min到15min显微镜下观察细胞突起缩回近似圆形、细胞之间的间隙增大时停止消化。

（4）吸管吸去消化液后立即加入含血清培养液或蛋白酶抑制剂，抑制胰蛋白酶的活性，使消化终止。

（5）用弯头吸管吸取培养皿内的培养液反复吹打瓶皿底壁，使已经消化的细胞脱离瓶皿底壁。

（6）低速离心，弃去上清液。

（7）用新鲜培养液将细胞沉淀重新悬浮，计数并调整细胞密度。

2+2+

（8）根据传代目的将细胞悬浮液接种到一个或多个新的培养器皿中。

3、分离细胞培养物—悬浮型细胞的传代过程

基本操作过程：

（1）将培养物移入离心管低速离心。

根据传代目的将细胞悬液接种在一个或多个新的培养皿中。

（2）用吸管吸去上清液，加入新鲜培养液使细胞沉淀重新悬浮

（3）根据传代目的将细胞悬液接种在一个或多个新的培养皿中。

（4）加足培养液，加盖封口，加入恒温箱中继续培养。

（二）传代培养的注意事项

1、离体培养的细胞生命力比较脆弱，因此传代时细胞没有生长到培养瓶底壁面积的80%以前，不要急于传代。

2、首次传代，由于原代培养中各种类型的细胞常混杂生长，传代时不同细胞又不同的消化时间，因而要根据需要注意及时处理。

3、对贴壁细胞消化后的吹打过程要有序进行，要从一边开始到另一边结束，尤其是器皿的四角处，确保瓶皿底壁各处的细胞都被吹打脱离。

吹打时动作不宜过猛，吹出液体的力度要适中，否则会直接损伤细胞并产生能伤害细胞的气泡。

4、对于贴壁能力较弱，容易脱壁的细胞，可以不经蛋白酶原消化处理和终止消化这两步，直接对原代培养物或经漂洗后用吸管进行吹打使细胞脱离瓶皿底壁。

这种直接吹大的方法对生命力旺盛的细胞如某些肿瘤细胞较为合适。

高强度机械吹打易对细胞造成伤害较大，细胞也常有较大数量的丢失，因而绝大部分贴壁生长的细胞需消化后才能吹打，一般不单独采用高强度机械吹打。

5、首次传代时适当增大接种的细胞密度，使培养的细胞间尽快发生相互作用，有利于传代细胞的存活。

6、传代数是指对培养物传代的次数，它不等于细胞分裂的次数或细胞的代数，而仅代表传代操作的次数。

7、传代对细胞的影响或伤害程度仅次于将活细胞从生物体内取出并进行原代培养的程度。

只是因为传代后的细胞生长并不像刚开始原代培养时那样缓慢罢了。

8、每经过一次传代，细胞的生长环境就相应发生一次较大变化。

体外生长的细胞若处于动荡的生活环境中，细胞的遗传特性往往容易发生改变。

经过多次传代培养的细胞，往往容易转化为恶性细胞。

因此，传代对细胞生长和性状会产生不利影响，一般情况下要尽可能减少传代次数。