中药活性指标成分阿克苷制备及鉴定.docx
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中药活性指标成分阿克苷制备及鉴定
附件1
中药活性指标成分阿克苷(Acteoside)的制备与鉴定
何江1,胡小鹏2,邱榕珠3,马文杰3,李涛2
1.深圳大学医学院
2.深圳大学生命科学学院
3.深圳大学化学与化工学院
摘要:
本实验以苦丁茶木犀科植物紫茎女贞(Ligustrumpurpurascens)叶为原料,通过高效快速的分离纯化方法,制备得到目标化合物。
目标化合物经结构鉴定为阿克苷(acteoside)。
关键词:
阿克苷紫茎女贞制备鉴定
概述
阿克苷(Acteoside),又名洋丁香酚苷(《中华本草》)、洋丁香苷(《中药辞海》)、毛蕊花苷、马鞭草苷、麦角甾苷等。
1963年罗马大学,M.L.Scarpati首先报道从植物Verbascumsinuatum中分离到阿克苷(acteoside)[1]。
根据现有的文献查询分析,阿克苷广泛分布于双子叶植物中,含阿克苷的植物包括:
唇
阿克苷(acteoside)分子结构
形科(Labiatae)15属41种,紫薇科(Bignoniaceae)4属5种,木犀科(Oleaceae)7属12种,列当科(Orobanchaceae)5属10种,玄参科(Scrophulariaceae)21属34种,马钱科(Loganiaceae)2属7种,马鞭草科(Verbenaceae)12属31种,车前科(Plantaginaceae)2属7种,爵床科(Acanthaceae)2属3种,木兰科(Magnoliaceae)1属2种,苦槛蓝科(Myoporaceae)1属1种,蓼科(Polygonaceae)1属1属,菊科(Compositae)1属1种,胡麻科(Pedaliaceae)1属1种,桔梗科(Campanulaceae)1属1种,胡椒科(Piperaceae)1属1种,苦苣苔科(Gesneriaceae)1属1种,蔷薇科(Rosaceae)1属1种,共计79属160种植物。
现代药理研究表明阿克苷具有多种生理活性:
抗氧化,抗病毒,保肝,抗肿瘤转移,抗炎,降血脂,抗菌,神经保护,降血压和心血管保护等[2]。
由于阿克苷具有多种生理活性,且分布广泛,资源丰富,因此对其药用价值的研究已成为天然药物研发的新热点。
阿克苷属新一类天然活性结构分子,随着药理研究的不断深入,必将为其带来广泛的临床应用前景。
阿克苷为苯丙素苷类成分,可溶于醇类有机溶剂,溶于水,极性大,阿克苷分子结构对热和光不稳定,分离纯化难度大。
探索高效快速制备和鉴定的方法,有益于阿克苷的药物研究和开发。
实验部分
一、实验仪器及试剂
比旋度J―20C旋光光谱仪测定,紫外光谱用UV―210A型紫外光谱仪测定,红外光谱用IR―450型红外光谱仪测定,核磁共振谱用WH―400型核磁共振仪测定,FAB―MS用JAB―HS测定。
层析柱材料用硅胶,D101大孔吸附树脂,SephadexLH-20。
薄层层析用高效硅胶G板(HPTLC,silicagel,Merck),展开剂为CHCl3―MeOH―H2O(7:
3:
。
有机溶剂用甲醇,乙醇和氯仿等。
二、提取及分离
称量g干燥的苦丁茶紫茎女贞(Ligustrumpurpurascens)叶,剪碎,放入10L加热回流提取磨口器皿中,加入5LMeOH,加热回流2小时后,静置放凉,然后过滤,得提取液H1;随后,再重复操作一次,得提取液H2(提取流程见图1)。
合并两次提取液H1和H2,并减压浓缩,得甲醇提取物g。
在甲醇提取物g中加入4L纯净水,充分搅拌混匀,然后静置一小时,滤出上清液,如此反复操作三次,将所得的上清液合并,并直接上D101树脂(1500g)层析柱分离。
D101树脂层析柱分别用纯净水、50%甲醇和甲醇洗脱,得到三组馏分:
Ag),Bg)和Cg)。
所得A、B、C三部分,经TLC检测[硅胶G,展开系统CHCl3―MeOH―H2O(7:
3:
],B部分含有阿克苷。
B部分(g)经硅胶层析,干柱切割法,得到三部分:
Eg)、F和G(g)。
将含有阿克苷的F部分进行硅胶柱层析,以CHCl3―MeOH―H2O溶剂系统洗脱得到7组馏分(如图1所示)。
其中F3部分(g)再进行一次硅胶柱层析分离,得到粗品Mg。
粗品M再经SephadexLH-20柱层析纯化得到Mg。
图1阿克苷提取及分离纯化
三、纯度检测
经色谱层析纯化得到的Mg),其纯度进行高效液相(HPLC)检测。
检测条件为:
1.仪器:
安捷伦1200(Agilent1200)高效液相仪
2.检测波长:
227nm
3.分析柱:
C-18column(HypersilODS,250⨯MM)
4.柱温:
4℃
5.流速:
1ml/min
6.样品浓度:
1mg/ml
7.进样量:
5μl
8.洗脱条件:
起始洗脱比例为H2O―acetonitrile(80:
20,v/v);时间程序为0―25min,洗脱比例由0―100%acetonitrile
通过高效液相色谱检测,从苦丁茶紫茎女贞叶中分离纯化得到的M其纯度为%。
四、结构鉴定
1.显色反应[3]
1)FeCl3显色:
将少许M试样溶于10ml适量的甲醇中,用毛细管取样,并在硅胶TLC板上点样,用风筒将斑点吹干,然后用10%FeCl3水溶液在TLC上喷雾,此时观察到斑点呈墨兰色。
2)KOH水溶液显色:
取少许M试样放入一小试管中,用甲醇溶解,然后滴加10%KOH水溶液二至三滴,溶液呈深黄色。
2.比旋度测定:
[α]D24―(c,MeOH)
3.紫外光谱λmax(EtOH)nm,(logε)(如图3所示)
在210―240nm区间,出现225和248()吸收,表明化合物M结构中含有α、β不饱和酰基和苯环官能团。
288()为苯环的弱吸收甙,而335()吸收为结构中的π→π*电子跃迁的吸收带峰。
4.红外光谱IRνmaxKBr,cm―1(如图4所示)
3450吸收宽峰表明M分子中存在多―OH基团,1690与1660为共轭α、β不饱和酰基的特征吸收峰,1510和1440为双键和苯环骨架振动吸收。
5.1H―NMR核磁共振谱
如图5所示,化合物M的1H―NMR谱图在―ppm低磁场共振范围内出现6个苯环质子信号,属于两个ABX自旋系统。
δ和的两组二重峰,J=Hz,为咖啡酰基的反式双键质子信号;而δ(2H,J=Hz)、(1H,t,J=Hz)和(1H,m)分别为苯乙醇基质子信号。
在1H―NMR谱中可观察到β-D-葡萄吡南糖基和α-L-鼠李吡喃糖基的端基质子信号。
化合物M的1H―NMR化学位移信号归属如下:
Aglycone(3,4-dihydroxyphenylethyl):
(1H,d,J=Hz,H-2),(1H,d,J=Hz,H-5),(1H,dd,J=,Hz,H-6),(2H,t,J=Hz,H2-7),(1H,t,J=Hz,H-a),(1H,m,H-8b)
Glucosyl:
(1H,d,J=Hz,H-1'),―(m,2',3'and5'),(1H,t,J=Hz,H-4'),(1H,dd,J=12,Hz,H-6'),(1H,dd,J=12,Hz,H-6')
Rhamnosyl:
(1H,d,J=Hz,H-1"),―(m,2"and3"),(1H,t,J=Hz,H-4"),(m,H-5"),(3H,d,J=Hz,H3-6")
Caffeoyl:
(1H,d,J=Hz,H-2"'),(1H,dd,J=Hz,H-5"'),(1H,dd,J=,Hz,H-6"'),(1H,d,J=Hz,H-7"'),(1H,dd,J=,Hz,H-8"')
图5化合物M的1HNMR图谱
6.13C―NMR核磁共振谱
化合物M的13CNMR图谱(见图6)显示29个碳信号,与文献报道数据比较[4],其碳化学位移信号得到归属:
Aglycone(3,4-dihydroxyphenylethyl):
(C-1),(C-2),(C-3),(C-4),(C-5),121(C-6),(C-7),(C-8)
Glucosyl:
(gluC-1'),(gluC-2'),(gluC-3'),(gluC-4'),(gluC-5'),(gluC-6'),
Rhamnosyl:
(rhaC-1"),(rhaC-2"),(rhaC-3"),(rhaC-4"),(rhaC-5"),(rhaC-6")
Caffeoyl:
(C-1"'),(C-2"'),(C-3"'),(C-4"'),(C-5"'),(C-6"'),(C-7"'),(C-8"')
图6化合物M的13CNMR图谱
7.FAB-MS谱图
化合物M的FAB-MS图谱显示,亚分子离子峰[M+H]+为625,分子式可推定为C29H36O15。
图7化合物M的FAB-MS图谱
8.结果
以苦丁茶紫茎女贞为原料,经提取纯化,得到化合物g,经HPLC测定,其纯度为%。
通过以上物理化学性质和波谱学的数据进行结构推定,化合物M的分子结构应为:
2―(3,4―二羟基苯)乙基―[3―O―α―L-鼠李吡喃糖基][4―O―反式咖啡酰基]―O―β―D―葡萄吡喃糖苷,即该化合物M与已知成分阿克苷(acteoside)一致[5]。
讨论
按照课题立项的要求,现已如期完成。
从苦丁茶紫茎女贞叶中分离得到目标化合物阿克苷g,纯度为%,所分离纯化得到的阿克苷结构经波谱学和化学方法得到鉴定。
阿克苷为天然多酚类成分,极性大,分子结构对热和光敏感,不稳定,分离纯化难度大。
针对阿克苷分子极性大,不稳定,分离难度大的具体问题,我们应用新方法,大大提高了阿克苷的分离纯化速度和效率。
所采用的新方法有:
1)在本实验中采用浸膏水萃取法,克服以往混悬水相亲脂溶剂梯度萃取法时间长、易乳化、成分交叉等问题;2)将浸膏水萃取的上清液,直接加样进行大孔吸附树脂柱层析分离,省去了萃取相水液的浓缩步骤,本方法不仅节省了人力物力,更避免了阿克苷分子在浓缩过程中的分解,此属本实验室开发创立的新方法;3)在硅胶层析分离时,采用干柱切割法,将原本需要进行2个多月层析的实验,缩短为一周时间,大大提高了柱层析分离的效率。
通过本次实验,建立了阿克苷的高效快速分离法,为阿克苷资源开发以及产业化奠定了良好的提取纯化工艺。
参考文献
1.ScarpatiML,DelleMonacheF
IsolationfromVerbascumsinuatumoftwonewglucosides,verbascosideandisoverbascoside.
AnnalidiChimica(Rome,Italy)1963;53:
356―67
2.HeJ,HuXP,ZengY,LiY,QiuRZ,MaWJ,LiT,LiCY,HeZD
AdvancedResearchofActeosideforChemistryandBioactivities.
NatProdResDev2010(submitted)
3.贺震旦,杨崇仁
植物中苯丙素甙成分研究进展
天然生物研究与开发1989;1
(2):
29―40
4.贺震旦,刘玉清,杨崇仁
云南植物研究1992;14(3):
328―336
5.贺震旦,王德祖,杨崇仁
云南植物研究1990;12(4):
439―446
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- 中药 活性 指标 成分 阿克苷 制备 鉴定