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环介导等温扩增技术检测动物病原研究进展讲解
生物技术通报
BIOTECHNOLOGYBULLETIN2009年增刊·技术与方法·
核酸扩增技术是分子生物学领域的一项重要的研究手段,其中PCR技术最为常用。
但在应用过程中人们发现PCR技术存在一些不足,如靶基因易被污染,可能引起非特异性扩增,多种因素可以产生抑制扩增反应,扩增反应时间较长,一般需要几小时,需要比较昂贵的PCR仪,不利于在基层实验室推广应用等。
2000年,日本学者Notomi等[1]建立了一种新的核酸扩增方法——
—环介导等温扩增(loop-mediatedisothermalamplification,LAMP技术,该技术克服了PCR技术的一些缺点。
目前已在人类及动植物细菌、病毒、寄生虫、真菌等病原体的检测中取得重要进展,在疫病诊断领域显示出广阔的应用前景。
1LAMP技术原理
LAMP技术依赖于能够识别靶序列上6个独立区域的两对特异性引物(内引物:
FIP和BIP;外引物:
F3和B3和一种具有解旋功能且呈瀑布式扩增的BstDNA聚合酶,在等温条件下可高效、特异的扩增靶序列。
LAMP反应过程是先由外部引物扩增出内部引物扩增所需要的模板,即起始反应物模板的合成;紧接着由内部引物引导合成靶基因DNA片段,由于内部引物扩增的DNA片段含有与该引物5’端DNA片段的反向互补序列,因而这些反向互补序列之间通过杂交形成茎环结构,另外一条内部引物与其互补链退火杂交后引导链置换合成反应,在扩增的DNA片段的另外一端产生了新的茎环结构,形成哑铃状结构,如此往复循环最后形成花椰菜形状的茎——
—环结构的DNA,数量级可达109~1010拷贝,电泳后可见扩增终产物由大小不等的DNA片段组成,呈梯状条带。
LAMP反应体系和PCR反应体系相似,即由模板、引物、聚合酶、dNTP和缓冲液组成。
但LAMP使用四个引物,聚合酶为BstDNA聚合酶。
LAMP扩
环介导等温扩增技术检测动物病原研究进展
郑洋妹1陈信忠2
(1福建农林大学动物科学学院,福州350002;2厦门出入境检验检疫局,厦门361026
摘要:
综述了环介导等温扩增技术检测病毒、细菌和寄生虫等动物病原方面的研究和应用最新进展。
关键词:
环介导等温扩增技术病原检测进展
ProgressinDetectingAnimalPathogensbyLoop-mediated
IsothermalAmplification
ZhengYangmei1ChenXinzhong2
(1TheZoo-scienceInstituteofFujianAgricultureandForestryUniversity,Fuzhou,350002;2XiamenEntry-ExitInspectionand
QuarantineBureau,Xiamen361026
Abstract:
Thisarticlesummarizedthenewestprogressontheresearchandapplicationindetectingvirus,bacteriumandparasitebyloop-mediatedisothermalamplification.
Keywords:
Loop-mediatedisothermalamplificationPathogensDetectionProgress
收稿日期:
2009-03-13
作者简介:
郑洋妹(1985-,女,硕士研究生,研究方向:
动物病原与分子生物学研究
通讯作者:
陈信忠(1964-,男,研究员,主要从事水生动物病害研究;Email:
chenxz@
2009年增刊郑洋妹等:
环介导等温扩增技术检测动物病原研究进展
增操作简便,反应体系混匀后于60℃~65℃恒温反应1h,移至80℃热浴10min灭活BstDNA聚合酶即可。
结果判定可通过肉眼直接观察副产物焦磷酸镁沉淀,阳性反应的反应管内液体浑浊,离心后有白色沉淀集于管底,阴性反应则无此现象。
也可在产物中加SYBRGreenI等核酸染色剂,呈绿色的为阳性反应,橙红色为阴性反应。
此外,还可通过琼脂糖电泳,用EB或SYBRGreenI染色进行判定。
LAMP技术具有比普通PCR更优越的特点:
(1特异性高:
4条精确设计的引物严格地识别靶核酸序列上的6个独立区域,所以LAMP不会受到反应混合物中存在的非靶序列DNA影响;(2灵敏度高:
扩增模板量可低至10拷贝或更少,而产物扩增指数达109-1010个拷贝,比普通PCR法普遍高1-2个数量级;(3扩增时间短:
LAMP是恒温扩增反应,在30min~60min内即可完成反应过程。
此外,在LAMP反应体系中增加2条环引物可使其反应所需时间比原来缩短近一半,大大提高了检测效率;
(4设备简单:
LAMP反应只需一个简单的水浴锅,不需要昂贵的PCR仪和凝胶成像系统,易于在基层实验室推广应用;(5结果判定便捷:
可以用肉眼观察反应管内沉淀的混浊度或者通过SYBRGreenI颜色变化判断结果;(6步骤简单:
扩增RNA只要在DNA基因扩增试剂的基础上加上逆转录酶,就能够完全像DNA基因扩增那样,实现一步扩增;(7费用低:
只要一个水浴锅就能完成扩增反应,总费用低;(8在检测细菌时,无需分离培养细菌,可直接提取感染动物组织基因组进行扩增[2,3]。
2LAMP技术在动物病原菌检测中的应用目前常用的细菌检测方法包括传统的细菌培养和生化鉴定法、免疫荧光、EILISA、PCR等,这些方法都存在一些缺陷,如细菌培养鉴定法步骤繁杂耗时长,免疫学方法特异性不强,PCR法容易出现假阳性等。
目前,应用LAMP法快速检测病原菌已显示其特有的优势。
Saleh等[2]根据鲁氏耶尔森菌(Yersiniarucker⁃i的yruI/yruR基因设计一套引物,建立了检测鲁氏耶尔森菌LAMP方法,研究表明LAMP比PCR灵敏10倍,而且LAMP不仅可以检测经培养纯化的细菌,还可以直接从感染鱼的组织基因组中检测到鲁氏耶尔森菌。
Yamazaki等[4]建立了检测产毒霍乱弧菌(toxin-producingVibriocholerae的高灵敏性的LAMP方法,其对110株菌进行了检测,仅34株产毒霍乱弧菌得到了扩增。
此方法用于人类粪便中的产毒霍乱弧菌的检测下限是7.8×102cfu/g,比普通PCR灵敏10倍,且扩增单菌落所用时间不超过35min。
Kayoko等[5]对疑被沙门氏菌感染的鸡蛋进行抽样(110个样品检测,并与细菌分离培养方法和PCR法做比较。
结果显示,PCR漏检了10%,LAMP及分离培养的检出率为100%;表明LAMP具有与细菌分离培养相同的灵敏度,而且更加快速。
徐芊等[6]针对副溶血弧菌(Vibriopara⁃haemolyticu不耐热溶血毒素基因(tlh设计4条特异性引物进行LAMP扩增,对扩增反应进行优化,最佳反应时间为60min,反应温度为60℃。
对12种细菌共28株菌进行扩增,仅14株副溶血弧菌得到阳性扩增结果,证明引物具有很高的特异性。
副溶血弧菌基因组DNA和纯培养物的检测灵敏度分别约为90fg和24cfu/ml。
结果表明,该方法检测副溶血弧菌特异性强、灵敏度高,并且简便、快速,有望成为检测副溶血弧菌的有效手段。
Savan等[7]根据迟钝爱德华氏菌(Edwardsiellatarda的溶血素(haemolysin基因序列设计4条引物,对日本鳗鲡(Anguillajaponica等4种水生动物和养殖水体中分离的5株迟钝爱德华氏菌进行了成功的检测,而非迟钝爱德华氏菌病原菌都没有扩增,证明LAMP法检测迟钝爱德华氏菌具有很强的特异性。
将LAMP法和PCR方法的灵敏性进行比较,发现LAMP法对迟钝爱德华氏菌的最低检测极限为10cfu/mL,比PCR法灵敏100倍。
用LAMP法检测正常的和受迟钝爱德华氏菌感染的褐牙鲆,仅从受感染鱼的脾和肾中提取的DNA模板能产生特异性扩增,并且也检测了养殖水体中的迟钝爱德华氏菌,其最低的检测浓度为3.8×10cfu/mL。
Yeh等也用LAMP法检测了斑点叉尾鲴的爱德华氏菌(Edwardsiellaictaluri[8]和柱状黄杆菌(Flavobacteri⁃iracolumnare[9],比real-timePCR法更加灵敏。
并且从感染的斑点叉尾鲴的组织中提取的DNA作为模板,均产生了特异性扩增,而正常鱼都没有产生
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扩增反应,证明此法具有简单灵敏的特点。
Iwamoto等[10]根据结核分枝杆菌复合群(My⁃cobacteriumtuberculoscomplex、鸟结核分枝杆菌(Mycobacteriumaviumsubsp.Paratuberculosis和胞内分枝杆菌的gyrB基因序列设计的引物和分枝杆菌属16SrRNA保守序列的公共引物,用LAMP技术对唾液样本中的结核分枝杆菌、鸟分支杆菌、胞内分支杆菌作了检测,通过检测24株分枝杆菌和7株非分枝杆菌证实了LAMP的特异性和敏感性。
LAMP从固体培养基中鉴定出特异的分枝杆菌属只需35min,液体培养基则需60min。
此外,还有LAMP技术检测嗜水气单胞菌(Aeromonashydrophila、胸膜肺炎放线杆菌(Acti⁃nobacilluspleuropneumoniae和葡萄球菌(Staphylo⁃coccus等细菌的报道。
3LAMP技术在病毒检测中的应用
动物病毒的检测和诊断比较复杂,常用的方法有细胞培养、组织病理学、Westernblot、ELISA和PCR方法等,但这些方法都有一定的局限性。
LAMP技术因其简便、快速、经济的特点,在动物病毒的检测上具有很好的应用前景。
LAMP用于DNA病毒诊断的报道相对较多。
Gunimaladevi等[11]根据锦鲤疱疹病毒(Koiherpesvirus,KHV胸苷激酶(thymidinekinase,TK的基因序列设计引物,采用LAMP法检测疱疹病毒,检测的灵敏度和PCR方法相似,但LAMP方法所需的时间仅为60~90min,而PCR需3~4h。
LAMP技术被应用于检测日本对虾白斑综合症病毒(Whitespotsyndromevirus,WSSV[12],对病毒DNA的检测限为10pg级,比巢式PCR法灵敏一个数量级。
Caipang等[13]使用染病真鲷的脾DNA抽提物,用LAMP扩增真鲷虹彩病毒(Redseabreamiridovirus,RSIV的DNA,LAMP比传统的PCR灵敏度高l0倍,而且利用病毒颗粒拷贝数和反应管混浊度的相互关系,可以对病毒进行量化。
Sun等[14]采用LAMP法检测了南美蓝对虾(Penaeusstylirostris传染性皮下及造血组织坏死病毒((Infec⁃tioushypodermalandhematopoieticnecrosisvirus,I⁃HHNV,反应条件优化为64℃反应60min。
Chen等[15]针对猪细小病毒(Porcineparvovirus的非结构蛋白-1基因设计一组特异性引物,结果显示LAMP的敏感性和特异性与PCR相当,并且LAMP的检测下限是5个拷贝的猪细小病毒。
RT-PCR可以用于诊断RNA病毒,但是费用高,而且要经过反转录阶段,费时且效率较低。
随着LAMP的发展,RT-LAMP已得到应用。
RT-LAMP第一次应用于日本山药花叶病毒的检测。
秦智锋等[16]设计了6条针对口蹄疫病毒(Foot-and-mouthdiseasevirus,FMDV3D基因的8个位点的特异性引物,建立了一套从核酸抽提到检测仅需要75min的快速检测FMDV的LAMP技术,灵敏度与实时荧光RT-PCR相当,特异性也强。
吴绍强等[17]建立了检测亚洲I型FMDV细胞培养病毒的RT-LAMP方法,作者认为LAMP法是适合基层和现场检测的快速灵敏实用的方法。
Li等[18]根据猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcinereproductiveandrespiratorysyn⁃dromevirus,PRRSV的开放阅读框6(ORF6设计了一套引物用于LAMP扩增,并用猪圆环病毒-2(Porcinecircovirustype2,PCV-2、猪免疫缺陷病毒(Simianimmunodeficiencyvirus,SIV、温和型猪瘟病毒(Classicalswinefevervirus,CSFV、猪流行性腹泻病毒(Porcineepidemicdiarrheavirus,PEDV进行对照,结果显示此引物特异性高,灵敏性也很高。
PoonLL等[19]用LAMP和PCR方法分别对稀释成不同浓度的禽流感病毒(Avianinfluenzavirus样本进行检测,PCR最低检测到10-2Pfu,而LAMP能在不到1h内检测到10-3Pfu,且可以通过肉眼观察反应所生成的白色沉淀物来快速检测禽流感病毒,因此LAMP在应对农场大规模禽流感病毒检测时有相当广泛的应用前景。
李启明等[20]对51份实验感染动物及病毒培养标本的H5N1亚型禽流感病毒的HA、NA基因区进行了RT-LAMP检测,并对扩增产物做内切酶验证和测序分析,证明RT-LAMP技术的特异性与Real-timePCR结果一致。
此方法的灵敏度可达到10个拷贝模板RNA。
作者认为RT-LAMP技术应用于H5N1亚型禽流感病毒的快速检测是一种可行的方法。
Mekata等[21]采用RT-LAMP法检测了斑节对虾的黄头病毒(Yel⁃lowheadvirus,YHV,反应条件优化为65℃反应60min。
Gunimaladevi等[22]以流行性造血器官坏死症病毒病毒(Infectioushaematopoieticnecrosisvirus,IH⁃
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NV的G蛋白为靶序列进行RT-LAMP,比较了RT-LAMP、LAMP和巢式PCR三种方法,其中RT-LAMP以RNA为模板,cDNA合成和目标基因的扩增可在单管中进行,可以节约30~40min反应时间;LAMP灵敏度比巢式PCR高10倍。
RT-LAMP和实时PCR都可作为诊断IHNV的很好的方法,但是RT-LAMP的花费要低很多。
RT-LAMP还用于检测诺达病毒(MrNV、小颗粒病毒(XSV、病毒性出血性败血症病毒(VHSV、伪狂犬病毒(Pseudorabiesvirus、新城疫病毒(Newcastlediseasevirus等。
4LAMP技术在寄生虫检测中的应用
形态学鉴定一直是寄生虫分类的传统方法,但常常需要对虫体进行染色、固定、制片等,而且要求有一定的经验,这种方法越来越显示出它的局限性,尤其对那些相似种或近缘种来说,从形态上很难进行区分,需要采用其它方法来对寄生虫进行分类、鉴定,而分子生物学是其中发展最快的一种。
随着LAMP技术的不断改善和成熟,相信LAMP法将成为寄生虫的一种快速检测方法。
Njiru等[23]以布氏罗得西亚锥虫(Trypanosomabruceirhodesiense的血清耐药相关(SRA基因为靶序列,进行了SPA-LAPM,该研究显示LAMP在检出率和灵敏性方面均比PCR高。
杨秋林等[24]设计4条扩增日本血吸虫尾蚴钙结合蛋白基因的引物,进行LAMP反应,可检测到最低1条尾蚴。
EI-Mat⁃boulim和Solimanh[25]用LAMP方法快速检测引起虹鳟增生性肾脏病的孢子虫Tetracapsuloidesbryosalmonae,而且将LAMP方法和常规的PCR方法进行比较。
根据目的基因SSUrDNA设计4条引物,并且加入了环引物来加速LAMP反应,整个反应在1h内完成,LAMP反应比PCR反应的灵敏度高100倍。
同时,用LAMP法快速检测了寄生鱼和寡毛类动物体上的黏液孢子虫(Myxoboluscere⁃bralis[26],检测的灵敏度和PCR相似,但是,此法需要的时间更短而且只需要一个水浴锅,更加适用于实际诊断。
Lin等[27]根据致病钩端螺旋体(pathogenicLeptospira的LipL41基因设计了一套引物进行LAMP检测,其检测的最低极限是100个拷贝,与普通PCR和real-timePCR一致。
巴贝西虫病(BabesiaGibsoniinfection是一种由蜱传播的致命性疾病,会导致犬类的死亡。
Ikadai等[28]根据18SrDNA序列设计引物,采用LAMP和PCR的方法进行扩增反应,两者的检测虫体密度(parasitemia的极限均为0.0005%,但LAMP操作简单,结果可通过肉眼观察,并且时间比PCR少3h。
5LAMP法在其他领域中的应用LAMP技术除了用于检测动物病原外,还被广泛应用于人类病原、食品微生物方面的检测。
Yoshikawa[29]和Ihira[30]等分别建立了人疱疹病毒(Humanherpesvirus6型和7型的LAMP检测方法,他们设计的LAMP引物具有高度的特异性和敏感性。
Maeda等利用LAMP方法建立了一种简单、快速的检测牙龈卟啉单胞菌(Porphyromonasgingi⁃valis体系,运用了3种结果判定方法,发现琼脂糖电泳和SYBRGreenI的检测极限相近,直接沉淀观测法则低10倍;此外,通过real-timePCR和re⁃al-timeLAMP的比较发现,后者更加快速、便捷,灵敏度更高。
Seki等[31]针对肺炎链球菌(Streptococcuspneumoniae的特异性基因序列lytA设计6条引物,利用LAMP法来检测肺炎链球菌,通过对10株肺炎链球菌和6株非肺炎链球菌的检测验证了LAMP法的特异性,LAMP的检测下限为10拷贝的纯化DNA,比PCR法敏感1000倍,时间只需60min。
LAMP技术还用于SARS冠状病毒、巨细胞病毒、登革热病毒、丙型肝炎病毒等方面的研究。
沙门氏菌是引起食物中毒和伤寒的主要病原菌。
朱胜梅等[32]根据沙门氏菌特异性的invA基因,设计了一套特异性引物对该基因进行了LAMP,同时优化了反应条件,建立了沙门氏菌的LAMP快速检测技术。
在此条件下,LAMP检测沙门氏菌DNA的敏感度达10fg,且与其他常见的细菌无交叉反应。
Song等[33]用LAMP方法以志贺氏杆菌(Shigellaenteroinvasive和肠侵染性大肠杆菌(E.coli的侵袭性质粒抗原基因(ipaH基因作为靶基因进行扩增,白色焦磷酸镁沉淀作为鉴定的依据。
试验发现,LAMP方法的检测灵敏度是8cfu,整个过程只需2h,而PCR反应是8×10cfu。
6应用前景
LAMP技术在快速检测和鉴定动物病原方面不仅具有重要的理论意义,而且具有很高的实用价
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值。
该方法快速高效,整个过程在恒温条件下进行,避免了常规PCR对于温度循环的特殊要求所带来的种种不便。
实验结果判定可以直接使用副产物——
—焦磷酸镁的浊度检测法。
由于该方法简单易行,提高了LAMP的使用价值。
目前,LAMP在以实用研究为主导的日本非常热门。
LAMP技术作为一种检测技术,在核酸研究方面具有重要的作用,尤其在人类和动植物的病原检测方面具有良好的发展前景。
LAMP方法是分子生物学领域的一种新的技术,同样存在一些不足。
由于LAMP法阳性反应呈现梯度条带,并不像PCR只呈现单带,一旦产生非特异性扩增,则不易鉴别。
因此,应特别关注反应的特异性,可通过对目标序列特异的限制性酶切割扩增产物进行验证。
另外,从分子生物学研究的角度看,还应该对LAMP反应的理论基础作更系统、更深入的探讨,扩大其在分子生物学领域的应用范围,以便开发出方便、快捷、实用的LAMP检测试剂盒。
参考文献
1NotomiT,OkayamaH,MasubuchiH,etal.NucleicAcidsRe~search,2000,28:
e63.
2SalehM,SolimanH,El-MatbouliM.BMCVeterinaryResearch,2008,4:
31.
3ItanoT,KawakamiH,KonoT,eta1.JApplMicrobiol,2006,100
(6:
1381~1387.
4YamazakiW,SetoK,TaguchiM,eta1.Microbiology,2008,8:
94.5KayokoOhtsuka,eta1.Appliedandenvironmentalmicrobiology.
2005,11(71:
6730~6735.
6徐芊,孙晓红,赵勇,等.中国生物工程杂志,2007,27(12:
66~72.
7SavanR,IgarashiA,MatsuokaS,eta1.ApplEnvironMicrobiol,2004,70(1:
621~624.
8YehHY,ShoemakerCA,KlesiusPH.JMicrobiolMethods,2005,63(1:
363~364.
9YehHY,ShoemakerCA,KlesiusPH.JApplMicrobiol,2006,100
(5:
919~925.
10IwamotoT,SonobeT,HayashiK.JournalofClinicalMicrobiolo-
gy,2003,41:
2616~2622.
11GunimaladeviI,KonoT,VenugopalMN,eta1.JFishDis,2004,27(10:
583~589.
12KonoT,SavanR,SakaiM,ItamiT.JournalofVirologicalMeth-ods,2004,115:
59~65.
13CaipangCM,HaraguchiI,OhiraT,etal.JournalofVirologicalMethods.2004,121:
155~161.
14SunZF,HuCQ,RenCH,eta1.JVirolMethods.2006,131(1:
41~46.
15ChenCM,CuiSJ.JVirolMethods,2009,155(2:
122~5.
16秦智锋,曾少灵,阮周曦,等.中国预防兽医学报.2008,30(5:
375~378.
17吴绍强,孙晓智,林祥梅,等.检验检疫科学,2008,18(1:
9~12.18LiQ,ZhouQF,XueCY.JVirolMethods,2009,155(1:
55~60.19PoonLL,WongBW,ChanKH,etal.JClinMicrobiol,2005,43
(7:
3457~34591.
20李启明,马学军,高寒春,等.病毒学报,2008,24(3:
179~185.21MekataT,KonoT,SavanR,eta1.JVirolMethods,2006,135
(2:
151~156.
22GunimaladeviI,KonoT,LapatraSE,etal.ArchivesofVirology,2005,150:
899~909.
23NjiruZK,MikoszaAS,ArmstrongT,etal.PLoSNeglTropDis,2008,2(1:
e147.
24杨秋林,许丽芳,张愉快,等.中国
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