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山药毕业设计

毕业设计（论文）

题目：

蕲山药多糖的纯化及

化学结构分析

学院

专业

学号

学生姓名

指导教师

2011年4月20日

学位论文原创性声明

本人郑重声明：

所呈交的论文是本人在导师的指导下独立进行研究所取得的研究成果。

除了文中特别加以标注引用的内容外，本论文不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写的成果作品。

本人完全意识到本声明的法律后果由本人承担。

作者签名：

年月日

学位论文版权使用授权书

本学位论文作者完全了解学校有关保障、使用学位论文的规定，同意学校保留并向有关学位论文管理部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅。

本人授权省级优秀学士学位论文评选机构将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存和汇编本学位论文。

本学位论文属于

1、保密□，在_________年解密后适用本授权书。

2、不保密□。

（请在以上相应方框内打“√”）

作者签名：

年月日

导师签名：

年月日

摘要

1.前言………………………………………………………………

1.1山药研究概况……………………………………………………

1.1.1山药功能研究现状…………………………………………

1.1.2山药化学成分研究现状………………………………………

1.2山药多糖提取、分离纯化及结构鉴定研究进展…………

1.2.1山药多糖的提取、纯化…………………………………………

1.2.2山药多糖的分离、结构测定……………………………………

1.3论文研究意义和主要研究内容……………………………………

1.3.1选题依据及研究意义………………………………………………

1.3.2论文的特色和创新之处……………………………………

1.3.3研究的主要内容……………………………………………

2.蕲山药多糖的提取工艺研究………………………………………

2.1实验材料…………………………………………………………

2.1.1材料…………………………………………………………

2.1.2仪器…………………………………………………………

2.1.3试剂…………………………………………………………

2.2实验方法…………………………………………………………

2.2.1多糖提取方法……………………………………………………

2.2.2正交实验的设计……………………………………………………

2.2.3多糖供试品液的制备………………………………………………

2.2.4标准曲线制作及总多糖含量测定………………………………

2.3实验结果及讨论……………………………………………………

2.3.1提取条件的正交实验优化结果……………………………………

2.3.2实验小结…………………………………………………………

3.蕲山药多糖的分离纯化工艺研究……………………………………

3.1实验材料…………………………………………………………

3.1.1材料…………………………………………………………

3.1.2仪器…………………………………………………………

3.1.3试剂…………………………………………………………

3.2实验方法………………………………………………………

3.2.1重结晶纯化法………………………………………………

3.2.2Sevage法……………………………………………………

3.2.3多糖脱色……………………………………………………

3.2.4小分子物质的去除……………………………………………

3.3实验结果与讨论……………………………………………………

3.3.1纯化条件的实验最佳结果……………………………………

3.3.2实验小结………………………………………………………

4.山药多糖的成分及其化学结构分析………………………………

4.1实验材料…………………………………………………………

4.1.1材料…………………………………………………………

4.1.2仪器…………………………………………………………

4.1.3试剂…………………………………………………………

4.2实验方法…………………………………………………………

4.2.1山药多糖的IR光谱分析……………………………………

4.2.2山药多糖的气象色谱分析……………………………………

4.3结果与讨论……………………………………………………

4.3.1山药多糖的红外光谱…………………………………………

4.3.2山药多糖的气象色谱…………………………………………

4.3.3实验小结………………………………………………………

5.结论与展望…………………………………………………………

5.1全文总结…………………………………………………………

5.2存在问题…………………………………………………………

5.3展望………………………………………………………………

致谢……………………………………………………………………

参考文献………………………………………………………………

附录……………………………………………………………………

1.前言

1.1山药研究概况

山药是传统药食同源食物，为薯蓣科植物薯蓣（DioscoreaoppositaThunb）的地下块茎。

山药既是一味重要中药，又是一种常见蔬菜，因其卓越的药用保健功效和糯香可口的风味品质而深得世人的喜爱。

山药性温味甘，温补而不骤，微香而不燥，不仅是健脾补气的良药，也是传统的保健食品。

我国栽培山药历史悠久，我国栽培山药历史悠久，自夏、商起就开始种植，明清以来逐渐形成道地药材。

目前河南、鄂东南等地区已经建立了多处规范化种植园区，山药生产正朝着现代化、规模化的方向发展。

山药的功能及有效成分等研究引起医药及食品行业科研人员的高度关注，有关研究综述如下。

1.1.1山药功能研究现状

1、降血糖作用

黄绍华等报道，山药多糖可通过抑制α-淀粉酶从而阻碍食物中碳水化合物的水解和消化，减少糖分的摄取，降低血糖和血脂含量水平值。

胡国强等研究证明山药多糖对四氧嘧啶模型糖尿病大鼠的血糖有明显降低作用，且同时能升高C肽含量，证明山药多糖对糖尿病的治疗作用与增加胰岛素分泌、改善受损的胰岛口细胞功能有关。

2、山药抗衰老作用

詹彤等研究了山药多糖对D-半乳糖O．12mg／g所致小鼠代谢性衰老模型的各项指标的研究中发现山药多糖具有良好的抗衰老作用。

另外有研究表明以给20％山药或熟地、菊花、山药、牛膝四药合剂水煎剂浸泡并阴干的新鲜桑叶喂饲家蚕，结果表明4药合剂能显著延长家蚕寿命，而单味山药虽能延长家蚕龄期，但效果不显著。

3、调节免疫作用

GuohuaZhao研究证明山药多糖可以促进伴刀豆凝集素A造成的胸腺依赖性淋巴细胞增殖，多糖在O-6部位的甘露糖残基对免疫活性表达非常重要。

赵国华以荷瘤小鼠为实验模型，证明山药多糖RDPS-I可显著增强荷瘤小鼠T淋巴细胞增殖能力、NK细胞活性、小鼠脾脏细胞产生L-2的能力及腹腔巨噬细胞产生TNF-α的能力。

4、体外抗氧化活性

何书英等报道，山药水溶性多糖能降低维生素C-NADPH及Fe2+-半胱胺酸诱发的微粒体过氧化脂质的含量，并对黄嘌呤-黄嘌呤氧化酶体系产生的超氧自由基及Fenton反应体系产生的羟自由基有清除作用。

此外山药多糖还具有抗肿瘤作用、降血脂、抗氧化和抗突变等多方面功能。

1.1.2山药化学成分研究现状

1、山药基本成分

现代药理学研究表明：

山药具有多种人体所需要的营养成分,发展前景十分广阔,不仅是一味常用的不可缺少的药品,也日益成为一种强身健体、延年益寿的保健品。

山药含淀粉约16%，还含有粘液质、糖蛋白、胆碱、多酚氧化酚、维生素C、甘露聚糖和植酸、3，4基苯乙胺、多巴胺、山药碱、皂甙、赖氨酸及精氨酸等多种氨基酸、蛋白质、淀粉酶、尿囊素、铁及锰等多种微量元素等。

2、山药的活性成分

国内外对山药功能性成份的报道很多，目前研究的最多的山药中最主要药用成分为山药多糖，其含量约为2.15％～2.92％，据报道多糖可分为酸性多糖与中性多糖两类，由甘露糖、木糖、阿拉伯糖、葡萄糖和半乳糖组成，国外有报道称山药多糖中还含有一定量的甘露聚糖。

姜军等通过DEAE-52，SephadexG-100分离纯化山药多糖，获得1种中性多糖及2种酸性多糖。

并通过GC-MS确定中性糖由葡萄糖和甘露糖组成，酸性多糖1是由葡萄糖、半乳糖、甘露糖组成。

酸性糖2是由阿拉伯糖、木糖、阿卓糖、葡萄糖、甘露糖组成。

此外还有一些研究学者对山药中的皂苷、尿囊素、氨基酸以及醇提物的研究也有一定的报道。

1.2山药多糖提取、分离纯化及结构鉴定研究进展

1.2.1山药多糖的提取、纯化

孟庆华等研究了水浸提法提取怀山药多糖、三氯乙酸法除蛋白及乙醇分离多糖的纯化条件，正交实验结果表明，浸提最佳工艺条件为浸提温度100℃，加水量1:

30，浸提时间2h，浸提2次，加入浓缩液7.5％体积的3％三氯乙酸溶液除去蛋白质的效果最好，再向浓缩液中加入5倍体积的无水乙醇溶液可以较好地分离怀山药多糖。

1.2.2山药多糖的分离、结构测定

乔善义等以水煮醇沉法提取山药多糖，将醇沉部分用水溶解，水溶液用1％CTAB溶液沉淀，上清液以乙醇沉淀，所得沉淀经冷冻干燥得到中性多糖部分SUP；CTAB沉淀用4mol／LNaCL溶解，适当浓缩后用95％乙醇沉淀，沉淀经冷冻干燥得到酸性多糖部位PPT。

SUP经Sephadex-G100凝胶层析得纯化多糖S1和S2。

全水解产物的分析表明，它们的糖组成均为葡萄糖。

HPLC分析显示它们为均一多糖，分子量分别为63000和7400。

通过IR、CNMR分析最终确定S1和S2都是[a-D-GIc（1→4）]n型葡聚糖。

赵国华等将山药水提液脱蛋白、透析、乙醇沉淀物经DEAE-52纤维素及SephadexG-100色谱纯化得白色粉末状多糖RDPS-1。

凝胶色谱分析表明RDPS-1为多糖纯品，定性化学反应表明RDPS-1不含核酸、蛋白质、酚类物质和糖醛酸，是一种非淀粉类中性纯粹多糖，相对分子质量为42200，完全酸水解后纸层析及气相色谱分析确定RDPS-1的糖基组成为葡萄糖、甘露糖和半乳糖，摩尔比为1：

0.37：

0.11。

顾林等对水溶中性多糖的水解产物进行薄层层析,初步认为山药水溶性中性多糖可能由葡萄糖、甘露糖、果三种单糖组成。

经过GC-MS精确分析，发现山药水溶中性多糖的单糖的组成为葡萄糖和甘露糖，摩尔比为0.56:

0.44。

红外光谱分析实验中，也发现存在甘露糖苷，D-葡萄糖等，进一步验证了多糖的组成。

1.3论文研究意义和主要研究内容

1.3.1选题依据及研究意义

山药既是一种重要中药，又是一种常见蔬菜，因其卓越的药用保健功效和糯

香可口的风味品质而深得世人的喜爱。

李时珍在《本草纲目》中将其功用概括为“益肾气，健脾胃，止泄痢，化痰涎，润皮毛”5个主要方面，其水煎剂有延缓衰老、防治糖尿病、降血糖及抗肝昏迷等作用。

近些年，随着生活水平的不断提高，人们的健康保健意识在逐渐增强。

多糖作为保健食品的主要成分己悄然兴起。

山药中多糖是已经公认的山药主要功能因子之一，山药多糖具有的广泛生物活性已逐渐被人们认知，其独特活性和来源的天然性在保障人体健康应用中具有很大潜力。

而且山药产量很高，又含有丰富的碳水化合物和蛋白质，营养成分全面，以干品计算较之谷物也毫不逊色，因而又是国际性的重要粮食作物。

进行山药深层次的加工技术的研究、开发高附加值山药新产品显得尤为必要和紧迫。

山药自古以来就是药食同源的保键食品，而多糖是山药的主要功能成分，多糖及其衍生物因其特殊的功能键能抗炎、抗凝血、抗辐射、降血脂，作为生物效应调节剂而成为近年来天然药物的研究热点之一。

论文研究对于提高加工企业生产山药利润，促进农民增收，推动农业可持续发展具有重要的意义。

同时论文研究借助于先进的仪器分析方法，研究多糖的高级结构，对于进一步明确多糖的生物学功能、指导医药新品药理研究均具有重要的意义。

但几乎所有有关山药多糖的讲究都是关于其他山药的，迄今未见蕲山药多糖研究的报告。

本实验拟在淮山药多糖研究较成熟的基础上，采用地方特色的蕲山药作为实验材料，进行多糖的提取纯化及化学结构研究，为蕲山药的食用、药用提供理论、实践依据以及一定的数据支持。

1.3.2论文的特色和创新之处

医圣李时珍的故里湖北省蕲春县具有悠久的山药种植历史,蕲山药是以蕲春县为主的鄂东山区大面积种植的优良地方山药。

据《本草纲目》记载:

蕲山药，“甘，温平无毒”；有“益肾气，健脾胃，止泻痢，化痰涎，润皮毛”之功效。

蕲山药以其枝肥个大，肉质细腻，淀粉丰富,色白多汁,食味香甜,清爽可口,而有别于它处，历为鄂东名产。

迄今未见蕲山药多糖研究的报告，本实验拟在淮山药多糖研究较成熟的基础上，采用地方特色的蕲山药作为实验材料。

且蕲山药经削皮切碎后均用液氮进行冷冻处理。

1.3.3研究的主要内容

本论文的研究内容主要有以下几个方面：

1、参考实验室其他同学实验数据共同确定蕲山药多糖提取的最佳工艺，最大限度地获得多糖，建立山药多糖分离纯化的体系。

山药多糖提取实验主要包括提取温度，提取PH、提取时间和液固比、乙醇体积以及提取次数的选择，针对这几个提取条件分别做单因素实验，考察它们对提取率的影响。

并通过正交实验获得蕲山药多糖最佳的提取条。

2、确定山药多糖的纯化方法，对使用Sevage法及重结晶法的不同去除蛋白质的效果以及多糖损失的比较中获得最佳的去除蛋白质的方法。

3、在其他同学利用气相色谱法测得多糖成分的基础上，利用红外光谱对多糖的构型进行了检测分析研究。

2.蕲山药多糖的提取工艺研究

山药是常用中药，具有补脾养谓、生津益肺和补肾涩精之功效，山药多耱是山药主要活性成分，本章对山药水溶性多糖的提取工艺进行初步研究。

山药多糖的提取多根据多糖是极性大分子化合物，易溶于水，不溶于乙醇的性质而常用水做提取溶剂，即所谓的相似相容原理。

一般工艺是原料经水提、离心、醇沉、干燥得粗多糖，这也是目前最为常用的方法。

2.1实验材料

2.1.1材料

山药为鄂东南地区特产新鲜蕲山药。

2.1.2仪器

BCD-215KAW海尔冰箱青岛海尔股份有限公司

便携式酸度计pHB-5型杭州奥立龙仪器有限公司

DK-S24电热恒温水浴锅上海森信实验仪器有限公司

离心机4K15北京博万力行仪器有限公司

FA2104N电子天平上海民桥精密科学仪器有限公司

SE2001F电子天平奥豪斯仪器（上海）有限公司

WG-43鼓风干燥箱天津市泰斯特仪器有限公司

移液枪上海求精生化试剂仪器有限公司

紫外分光光度计

2.1.3试剂

液氮；无水乙醇（分析纯）；纯水；98%浓硫酸（分析纯）、Tris饱和苯酚（分析纯）；无水葡萄糖（分析纯）。

2.2实验方法

2.2.1多糖提取方法

将蕲山药削皮切片，先用液氮装置进行处理，后置于冰箱备用。

称取一定量的冷冻块状蕲山药，加入适量纯水调节pH后在一定的温度的热水浴种浸提。

其间不断搅拌，静置冷却后离心（5000r/min,15min），收集上清液，浸提重复两次。

减压或烘干（60℃）浓缩，在浓缩后的上清液中加入一定体积的乙醇溶液，不断搅拌，有大量沉淀生成。

在冰箱4℃静置约2小时，离心（6000r/min,20min），收集沉淀，干燥（40℃）得粗多糖。

2.2.2正交实验的设计

以总糖含量为考察指标，用正交实验法优选蕲山药多糖最佳提取工艺。

本实验选取水浴温度、PH值、料液比和加入乙醇后乙醇的体积分数为影响因素，设置4个水平，实验安排见表2-1。

表2-l因素水平表

水平

实验因素

提取温度

料液比

乙醇：

浓缩液

（体积比）

pH

1

60℃

1:

8

1:

1

7.0

2

70℃

1:

10

1:

2

7.5

3

80℃

1:

12

1:

3

8.0

4

90℃

1:

15

1:

4

8.5

5

100℃

1:

20

1:

5

9.0

2.2.3多糖供试品液的制备

称取1.5～1.7g块状蕲山药共25组，按照L25（56）正交表（表3）中各条件分别提取、过滤，上清液定容至1000mL，摇匀，待测。

2.2.4标准曲线制作及总多糖含量测定

1、测定方法的选择

山药所含糖类物质从结构上说既有均多糖、杂多糖，也有蛋白复合多糖。

总糖测定常用方法主要有DNS法、蒽酮硫酸法、苯酚硫酸法。

DNS法：

利用碱性条件下，二硝基水杨酸（DNS）与还原糖发生氧化还原反应，生成3-氨基-5-硝基水杨酸，该产物在煮沸条件下显棕红色，且在一定浓度范围内颜色深浅与还原糖含量成比例关系，用比色法测定还原糖含量的。

蒽酮硫酸法与苯酚硫酸法：

利用多糖在强酸性条件下脱水生成糠醛或其衍生物，然后再与酚类或胺类化合物缩合，生成有特殊颜色，且在一定浓度范围内颜色深浅与还原糖含量成比例关系，用比色法测定糖含量。

苯酚-硫酸法是常用测定多糖含量方法，可用于甲基化的糖、戊糖和多聚糖的测定，方法简单、灵敏度高，实验时基本不受蛋白质存在的影响，并且产生的颜色稳定160min以上，蒽酮-硫酸法几乎可以测定所有的碳水化合物，所以用该法测出的碳水化合物含量，实际上是溶液中全部可溶性碳水化合物总量。

因此，蒽酮-硫酸法测定结果偏高于苯酚-硫酸法。

故苯酚-硫酸法测定总多糖含量更为合理准确。

2、苯酚-硫酸法原理

经水提醇沉淀得粗多糖，多糖在硫酸的作用下，水解成单糖，并迅速脱水生成糖醛衍生物，与苯酚缩合成有色化合物，在490rim处有最大吸收，吸收值与糖含量呈线性关系。

Ⅰ标准曲线的制备

1、对照品溶液的制备。

精密称取105℃干燥至恒质量的无水葡萄糖对照品250mg，置250mL量瓶中，加适量水溶解，稀释至刻度，摇匀，即得1mg/mL葡萄糖溶液。

2、多糖梯度浓度的制备。

取一定量葡萄糖液加适量水，按照表2浓度梯度配制，待测。

3、向9支试管加入5%苯酚溶液1mL，摇匀，迅速加入浓硫酸（98%）5mL，摇匀，放置10min，置40℃水浴中保温18min，取出后迅速冷却至室温，以一号管为空白对照，可见光分光光度法，在490nm的波长处测定吸光度。

已吸光度为纵坐标-浓度为横坐标制作标准曲线。

Ⅱ山药总糖的测定

1、将提取的多糖溶解，定容至250ml，再吸取10ml定容至100ml。

2、向稀释后的总糖提取液试管加入5%苯酚溶液1mL，摇匀，迅速加入浓硫酸5mL，摇匀，放置10min，置40℃水浴中保温18min，取出后迅速冷却至室温，同样以一号管为空白对照，可见光分光光度法，在490nm的波长处测定吸光度，做两组。

3、总多糖的测定。

按照“标准曲线的绘制”项下的方法测定吸光度值，按下式计算样品中总多糖的质量分数。

×100％

C×V×D

W×106

总多糖含量（％）=

式中C为测得的样品溶液的葡萄糖质量（mg／mL），D为样品溶液的稀释倍数，V为测定液总量（mL），W为山药样品的质量（g）。

2.3实验结果及讨论

2.3.1提取条件的正交实验优化结果

a）根据实验所得葡糖糖标注曲线如表2-2及图2-1。

表2-2葡萄糖标准曲线

管号

葡糖糖液/ml

水/ml

水/ml

最终浓度/ml

吸光度值（490nm）

1

0.00

0.50

3.5ml

0.000

0.000

2

0.05

0.45

0.0125

0.096

3

0.10

0.40

0.0250

0.147

4

0.15

0.35

0.0375

0.301

5

0.20

0.30

0.0500

0.354

6

0.25

0.25

0.0625

0.413

7

0.30

0.20

0.0750

0.521

8

0.35

0.15

0.0875

0.682

9

0.40

0.10

0.1000

0.731

图2-1葡萄糖标准曲线图

b）按照标准曲线制备项下的方法测得的总多糖含量实验结果及方差分析见表2-3和图2-2。

表2-3L25（56）正交优选设计及结果

因素

试验号

a.提取温度

b.料液比

c.乙醇：

浓缩液（体积比）

d.pH

蕲山药多糖提取率（%）

1

60℃

1:

8

1:

1

7.0

1.21

2

60℃

1:

10

1:

2

7.5

2.02

3

60℃

1:

12

1:

3

8.0

1.85

4

60℃

1:

15

1:

4

8.5

1.76

5

60℃

1:

20

1:

5

9.0

1.85

6

70℃

1:

8

1:

2

8.0

0.99

7

70℃

1:

10

1:

3

8.5

1.03

8

70℃

1:

12

1:

4

9.0

2.76

9

70℃

1:

15

1:

5

7.0

1.09

10

70℃

1:

20

1:

1

7.5

3.08

11

80℃

1:

8

1:

3

9.0

0.82

12

80℃

1:

10

1:

4

7.0

3.36

13

80℃

1:

12

1:

5

7.5

1.14

14

80℃

1:

15

1:

1

8.0

0.71

15

80℃

1:

20

1:

2

8.5

0.80

16

90℃

1:

8

1:

4

7.5

2.52

17

90℃

1:

10

1:

5

8.0

3.25

18

90℃

1:

12

1:

1

8.5

3.09

19

90℃

1:

15

1:

2

9.0

3.02

20

90℃

1:

20

1:

3

7.0

2.92

21

100℃

1:

8

1:

5

8.5

4.11

22

100℃

1:

10

1:

1

9.0

1.19

23

100℃

1:

12

1:

2

7.0

2.73

24

100℃

1:

15

1:

3

7.5

0.94

25

100℃

1:

20

1:

4

8.0

2.15

K1

1.7403

1.9322

1.8567

2.2630

K2

1.7883

2.1700

1.9104

1.9398

K3

1.3668

2.3138

1.5125

1.7895

K4

2.9598

1.5040

2.5120

2.1587

K5

2.2245

2.1597

2.2880

1.9287

极差R

1.5930

0.8099

0.7755

0.1392

图2-2极差分析结果图

c）实验结果

实验室提取蕲山药各影响因素主次顺序：

a（提取温度）＞b（料液比）＞c（乙醇：

浓缩液）＞d（pH）。

最佳提取条件：

提取温度为90℃，料液比是1:

12，乙醇：

浓缩液为1:

4，pH为7。

并且根据确定的最佳提取条件，硫酸-苯酚法测得的总多糖含量为4.27％。

2.3.2实验小结

1、根据以上图表可知，实验室提取蕲山药各影响因素主次顺序：

a＞b＞c＞d，因此在影响淮山药多糖提出率的3个因素中，水浴温度对提高山药总多糖含量有显著的影响，料液比及乙醇与浓缩液比对总多糖含量有一定的影响，溶液PH值影响最小；结合各因素的K值，可知总多糖