生物工程下游技术复习.docx

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生物工程下游技术复习

一、名词解释（每题4分，共20分）

1、连续培养反应器：

不断地往反应器中加入营养物，利用罐中的菌体增殖得到产物，并不断采出。

在良好的控制下，罐内菌体的增殖速度可以与采出速度相同而达到稳态。

2、贴壁培养:

贴壁依赖性细胞在培养中要贴附于壁上才能迅速铺展,开始有丝分裂并迅速进入对数生长期,这种培养方式就叫贴壁培养.多数动物细胞的培养都采取这种方式.

3、蛋白质的复性：

包含体蛋白质溶解于变性剂溶液中，呈变性状态，所有的氢键、疏水键全部被破坏，疏水侧链完全暴露，但一级结构和共价键不被破坏，当除去变性剂后，一部分蛋白质可以自动折叠成具有活性的正确构型，这一折叠过程称为蛋白质复性。

4、膜污染：

物料中的微粒、胶体粒子或溶质大分子由于与膜存在物理化学相互作用或机械作用而引起的在膜表面或膜孔内吸、沉积造成膜孔径变小或堵塞，使膜产生透过流量与分离特性的不可逆变化的现象。

5、排阻色谱又称凝胶色谱或凝胶渗透色谱，是利用被分离物质分子量大小的不同和在填料上渗透程度的不同，以使组分分离。

常用的填料有分子筛、葡聚糖凝胶、微孔聚合物、微孔硅胶或玻璃珠等，可根据载体和试样的性质，选用水或有机溶剂为流动相。

6、分配色谱是利用溶液中被分离物质在两相中分配系数不同，以使组分分离。

其中一相为液体，涂布或使之键合在固体载体上，称固定相；另一相为液体或气体，称流动相。

常用的载体有硅胶、硅藻土、硅镁型吸附剂与纤维素粉等。

7、有效柱长（有效迁移距离，Leff）：

溶质从开始迁移至其迁移速度等于流动相速度时，溶质在色谱柱上迁移的距离称为有效迁移距离，也称为有效柱长。

8、吸附等温线：

指在一定温度下物质分子在两相界面上进行的吸附过程达到平衡时它们在两相中浓度之间的关系。

9、切向流过滤（错流过滤、交叉流过滤、十字过滤）：

就是一种维持恒压下高过滤速度的技术，其原理就是：

使悬浮液在过滤介质表面作切向流动，利用液体的剪切作用将介质表面的固体移走，当移走固体与固体沉积速率相同时，过滤速度就保持恒定，控制不同的切向流速度就可以得到不同的过滤速度。

（实际是维持了Ｒc）.目前几乎所有的膜固液分离都采用切向流方式

10、包含体（包涵体，inclusionbodies）:

存在于基因工程细胞中，主要由蛋白质构成，其中大部分是克隆表达的产物，这些产物在一级结构上是正确的，但在立体结构上却是错误的，因此没有生物学活性。

难溶于水，只有在变性剂溶液中才能溶解。

11、蛋白质的复性：

包含体蛋白质溶解于变性剂溶液中，呈变性状态，所有的氢键、疏水键全部被破坏，疏水侧链完全暴露，但一级结构和共价键不被破坏，当除去变性剂后，一部分蛋白质可以自动折叠成具有活性的正确构型，这一折叠过程称为蛋白质复性。

12、双水相萃取：

利用被提取物在二相中的分配不同而实现分离的目的；由于蛋白质在有机相中容易失活，因此采用的二相均为亲水相，如PEG/葡聚糖、ＰＥＧ／无机盐等，称为双水相，两相密度不同，轻相富含一种高分子，重相可能富含另一高分子，细胞碎片和蛋白质在二相间的分配系数不同，从而实现分离的目的。

13、保留值：

试样中,个组分在色谱柱中的滞留时间,由色谱分离过程中的热力学因素控制,作定性参数

14、亲和色谱：

利用生物大分子和固定相表面存在的某种特异性亲和力，进行选择性分离。

15、非线性色谱:

Cm与Cs不存在线性关系的色谱.

16、线性色谱:

在色谱学中,如果流动相中样品的浓度与固定相中的样品浓度之间是线性关系,那么这种情况下的色谱分配过程就称为线性色谱

二、填空题（共20分）

1.超声波破碎细胞的效率与声频、声能、处理时间、细胞浓度及细胞类型等因素有关。

2.目前用于固液分离的膜过滤法主要有以下三种:

微孔过滤（微滤）、超滤、反渗透。

3.在生物工程下游技术领域，色谱和电泳是目前所知最好的两种分离蛋白的方法。

4.无论是什么类型的液相或气相色谱,其色谱装置均应包括:

流动相供给、进样、色谱柱、检测器等四大部分。

5.在色谱过程中，有两种将目标产品从色谱柱上洗脱下来的方法：

一种是维持流动相热力学参数不变的等梯度洗脱法，另一种叫梯度洗脱法。

6.径向色谱填料主要有：

离子交换树脂和亲和色谱填料两种。

7.评价HPLC色谱填料性能的主要表征指标包括：

（每空0.5分）

保留值，选择性,

柱效率，填充柱的空喜和穿透性,分离度。

8.请列举任意四种破碎细胞的方法：

（每空0.5分）

高压匀浆法，高速珠磨法，超声破碎化学渗透法。

9.在HPLC领域内经常可以遇到的吸附等温线可以有以下5种（形状）:

（每空0.5分）

凹形，,凸形，,

S形，H形，阶梯形。

10.羟其磷灰石在原理上一般被认为是一种弱离子交换色谱。

（本小题1分）

11.请列举二种测量蛋白质含量的方法考马斯亮蓝法，

克氏定氮法。

（每空1分）。

12.常见的无机色谱填料主要包括：

硅胶、可控孔径玻璃、氧化铝、氧化钛、羟基磷灰石以及碳和石墨等基质。

13.无机HPLC填料最常见的是以多孔硅胶为基本材料的填料；含硼的Na2O-B2O3-SiO2系玻璃经过热处理引起相分离，生成可溶于酸的Na2O-B2O3相及不溶于酸的高硅相。

将酸可溶相浸析出来后剩下的另一相就制成了可控孔径玻璃，可控孔径玻璃的主要化学成份就是二氧化硅。

14.不同分子量的蛋白质在电场中的迁移速度与其所带的静电荷数成正比，与它本身的半径及溶液的粘度成反比。

（每空1分）

溶质保留置换理论的核心是：

当一个溶质被吸附剂西湖时,在溶质份子和吸附剂接触的表面必然会释放出一定数目的溶剂分子。

（本小题3分）

18．指出三种交联葡聚糖的微载体：

Cytodex1微载体；Cytodex2微载体；Cytodex3微载体

19．指出蛋白质复性的三种方法：

稀释法，透析法，液相色谱法等

20．固液分离的主要方式包括：

离心法，过滤法，双水相萃取，泡沫分离法。

21．膜的孔径一般为微米级，依据其孔径的不同（或称为截留分子量），可将膜分为微滤膜、超滤膜、纳滤膜和反渗透膜

22色谱的保留值可以用保留时间也可以用保留体积来表示。

23．色谱的峰宽可以用半峰宽、峰底宽、标准偏差表示。

25．线性色谱的吸附等温线是直线，非线性色谱的吸附等温线的形状常见的有：

凸形、凹形、S形、H形、阶梯形。

从吸附等温线的形状可以预见色谱曲线的形状，一般凸形的吸附等温线代表色谱图是拖尾的，凹形吸附等温线代表的色谱图是吐舌头形状、S形的色谱图是波浪形的。

30．离子交换层析一般是通过梯度一般采用两种方法达到分离蛋白质的目的。

一种是增加洗脱液的离子强度，一种是改变洗脱液的pH值。

32．目前径向色谱柱使用的填料主要有离子交换树脂和亲和色谱两种;

33．蛋白质含量和纯度测定方法。

含量测定:

克氏定氮法，TCA比浊度法、双缩脲法、福林-酚法和紫外线法，考马斯兰法（Bradford法）。

纯度衡量:

电泳法，层析法，质谱法等。

一般应采用二种以上方法，而且同一原理的方法不应该采用二次。

34．细胞破碎法包括：

机械力和非机械力破碎方法；机械方式又包括：

液体剪切力和固体剪切力方法，液体剪切力包括：

高压匀浆法和超声破碎法；固体剪切力包括：

高速珠磨法和压榨法。

35．高压匀浆法的主要困难包括：

温控和堵塞问题

26．高压匀浆法的破碎率决定于：

匀浆阀的结构，操作压力，破碎次数。

34．蛋白质的分子量测定：

超离心法：

光散射方法：

凝胶过滤法：

SDS-PAGE电泳法：

五、综合题（共40分）

1．什么叫吸附等温线?

研究吸附等温线有什么意义?

附等温线：

指在一定温度下物质分子在两相界面上进行的吸附过程达到平衡时它们在两相中浓度之间的关系。

研究吸附等温线可以提供得到以下方面的信息：

预测代表该吸附等温线的组分在非线性色谱中色谱峰的形状；

为非线性色谱分离与纯化物质选择最佳条件；

反映被分离物质分子与固定相表面的作用，从而研究分子的构型及吸附状态。

建立分子结构-吸附之间的定量关系，从而由分子结构预测吸附性能。

2．做为优良的凝胶色谱介质应该具备什么基本特点?

介质本身为惰性物质，不与溶质、溶剂分子发生任何作用；

应尽量减少介质内含的带电离子基团，以减少特异性吸附，提高蛋白质的收率；

介质内孔径大小要分布均匀，即孔径分布较窄。

凝胶珠粒大小均匀；

介质要有良好的物理化学稳定性及较高的机械强度，易于消毒。

3．做为优良的HPLC填料应具备什么基本的物理化学特性?

▪在物理结构上的要求:

合适的颗粒大小及较窄的粒度分布;

一定的颗粒强度;

一定的孔径大小和孔径分布,避免复杂的微孔结构;

一定的溶胀及收缩水平;

▪在化学结构上的要求:

填料的化学结构,特别是颗粒表面和内孔表面的化学结构（如连接在基质上的官能基团或链段）是影响色谱热力学行为（保留值,选择性等）的主要因素

特定的选择性;

良好的化学稳定性;

避免不可逆吸附;

4．HAP的色谱机理

▪是一种弱离子交换色谱,实验结果表明其对DNA,多肽,蛋白质的分离机理合乎离子交换色谱的机理.

▪HAP的色谱机理可能包括以下几个方面:

1.存在两种不同的吸附晶面;

2.两种不同晶面吸附方式不同;

3.两种不同吸附点的起因:

Ca2+离子和PO43-

4.色谱历程为离子间的竞争过程

5．试述羟基磷灰石做为一种有广阔发展前途的色谱填料的主要特点.

羟基磷灰石（hydroxyapatite,HAP）是一种弱阳离子或弱阴离子交换层析材料.其材料本是骨骼和牙齿等生物硬组织的主要无机成分,与生物组织有特异性的亲和力和相容性.其优点是:

能精确地分离,纯化结构上只有微小差别的生物大分子.

做为一种优良的色谱填料,羟基磷灰石具有以下特点:

1.高机械强度:

可以耐受15MPa以上压力,陶瓷HAP可以耐受几十MPa的压力.

2.高柱效:

球形HAP颗粒大小,形状及孔隙大小均适合HPLC的要求.其颗粒及孔径小,有比较高的柱效.

3.化学和热稳定性:

是磷酸钙盐中最稳定的,在中性和碱性不相中非常稳定,溶解度很低,热稳定性很高,可采用高温制备方法生产.

4.低的非可逆性吸附:

HAP有非常低的非可逆性吸附.

5.表面修饰性:

HAP表面比较容易进行各种化学修饰.

6.总之HAP:

高选择性,高键合容量,低的非可逆吸附,良好的化学和热稳定性.

6．试述化学渗透法破碎细胞的原理及其优缺点?

作用机理：

某些有机溶剂，抗生素，表面活性剂，金属螯合剂，变性剂等化学药品都可以改变细胞壁或膜的通透性，从而使内容物有选择地渗透出来，这种处理方法叫渗透法。

▪优点（相对机械破碎）：

对产物释出有一定的选择性；

细胞保持完整，碎片少，利于进一步提取；

核酸释放量少，黏度低，便于进一步分离。

▪缺陷：

时间长，效率低；

化学试剂有毒；

通用性差

7．与传统的稀释法和透析法相比，液相色谱复性的优点是：

1.在进样后可很快的除去变性剂；

2.色谱固定相对变性蛋白质的吸附可明显的减少、甚至完全消除变性蛋白质分子在脱离变性剂环境后的分子聚集，从而避免了沉淀的产生，提高蛋白质复性的质量和活性回收率；

3.在蛋白质复性的同时，可使目标蛋白质与杂蛋白分离达到纯化的目的，使复性和纯化同时进行；

4.便于回收变性剂，降低废水处理成本。

8．在对包含体蛋白质进行增溶和复性的过程中为什么要加入还原剂,同时为什么还必须加入金属螯合剂?

常用的还原剂有哪些?

在复性后为什么要加入氧化剂?

常用的氧化剂有哪些?

（10分）

9．包含体蛋白溶解的方要方式是什么？

在溶解过程中为什么要加入还原剂，为什么要在复性完成后才加入氧化剂？

答：

包涵体的溶解必须用很强的变性剂，如8mol/L尿素、6~8mol/L盐酸胍，通过离子间的相互作用破坏包涵体蛋白间的氢键而增溶蛋白。

其中尿素的增溶效果稍差，异氰盐酸胍最强；去污剂，如SDS，可以破坏蛋白内的疏水键，可以增溶几乎所有的蛋白，但由于无法彻底去除而不允许用在制药行业中；酸，如70%甲酸，可以破坏蛋白的次级键从而增溶蛋白，这种方法只适合少数蛋白质。

对于含有半胱氨酸的蛋白，在增溶时应加入还原剂（如DTT、GSH、β-ME）打开蛋白质中所有二硫键，对于没有二硫键的目标蛋白有时也应使用还原剂，因为含二硫键的杂蛋白会影响包涵体的溶解，同时还应加入金属螯合剂，如EDTA或EGTA，用来螯合Cu2+、Fe3+等金属离子以防止其与还原状态的巯基发生氧化反应。

10．什么是径向色谱?

径向色谱应用于生物物质分离有什么优点?

（7分）

11．径向色谱的优点

采用径向流技术,可以在较小的柱床层高度时使用较大的流动相速度.

在较高流动相速度时,反压降低;

可以线性地增加样品处理量,样品可以在完全相同的色谱条件下直接放大;

12．利用微载体进行动物细胞培养的优点有哪些？

答：

微载体培养的优点:

1表面积/体积比大;

2微载体悬浮于培养基中,细胞生长环境均一,便于监测和控制;

3培养基利用率高;

4采样重演性好;

5收获过程不复杂;

6放大较容易;

7劳动强度小,占用空间小.

13．为什么动物细胞培养要用血清培养基？

血清培养基使用有何缺点？

答：

1）因为动物细胞正常生长所需要的一些必要成份均存在于血清中，而且这些成份的组成及其含量至今没有被阐明，因此只能直接采用血清进行培养，而目前寻找无血清的制品代替进行培养并没有获得广泛的成功。

2）采用血清培养基有以下缺点：

1血清是培养基成本的主要部分；血清中含有细胞生长必须的微量组分，但这些组分的成分及其作用至今未清楚，因此无法取代；

2血清的存在是产物纯化的主要障碍；

3血清是病毒污染及其他未知因素影响的主要来源，增加了细胞培养产品潜在的使用危险；

4血清同时也有生长抑制的作用；

5血清使用使实验和生产过程标准化变得困难。

14．化学渗透法破碎细胞的原理及其优缺点。

答：

作用机理：

某些有机溶剂，抗生素，表面活性剂，金属螯合剂，变性剂等化学药品都可以改变细胞壁或膜的通透性，从而使内容物有选择地渗透出来，这种处理方法叫渗透法。

优点（相对机械破碎）：

对产物释出有一定的选择性；

细胞保持完整，碎片少，利于进一步提取；

核酸释放量少，黏度低，便于进一步分离。

缺陷：

时间长，效率低；

化学试剂有毒；

通用性差

15．什么叫双水相萃取?

在双水相萃取中为什么要尽量将细胞碎片集中在下相?

可以采取什么可能的措施在使细胞碎片尽量集中在下相的同时,使目标蛋白质尽可能集中在上相?

（9分）

双水相萃取：

利用被提取物在二相中的分配不同而实现分离的目的；由于蛋白质在有机相中容易失活，因此采用的二相均为亲水相，如PEG/葡聚糖、ＰＥＧ／无机盐等，称为双水相，两相密度不同，轻相富含一种高分子，重相可能富含另一高分子，细胞碎片和蛋白质在二相间的分配系数不同，从而实现分离的目的。

16．双水相萃取的概念?

为什么要进行双水相萃取?

双水相萃取的主要操作原则是什么?

如何做到?

双水相萃取：

利用被提取物在二相中的分配不同而实现分离的目的；由于蛋白质在有机相中容易失活，因此采用的二相均为亲水相，如PEG/葡聚糖、ＰＥＧ／无机盐等，称为双水相，两相密度不同，轻相富含一种高分子，重相可能富含另一高分子，细胞碎片和蛋白质在二相间的分配系数不同，从而实现分离的目的。

双水相萃取的一般原则：

▪一般的原则是将碎片分配在下层（调节ＰＥＧ和无机盐浓度比例，可以控制细胞碎片在上下层间的分配）其好处有：

1核酸等大部分杂质一般处于下相，可以一并除去；

2下相是无机盐富集相，作为废弃物成本低些；

3蛋白质保持于上相的ＰＥＧ层有利于其活性的保持；

4碎片在下相有利于离心机的连续分离；

17．试述包含体复性的基本过程,复性过程错误发生的主要原因是什么?

举例分析主要的复性方法的优缺点,为什么LC复性是最好的?

18．包含体蛋白质含有二个以上二硫键应该如何处理？

为什么要在复性完成后再加入氧化剂？

19．膜分离技术的优点：

1.处理效率高，设备易于放大；

2.可在室温或低温下操作，适宜于热敏感物质分离；

3.化学与机械强度最小，减少失活；

4.无相变，省能；

5.选择性好，可在分离、浓缩的同时达到部分纯化的目的；

6.选择合适膜与操作参数，可得到较高的回收率；

7.系统可密闭循环，防止外来污染；

8.不外加化学物，透过液可循环使用，降低了成本，并减少了对环境的污染。

20．膜污染与浓差极化的主要区别？

1.膜污染：

物料中的微粒、胶体粒子或溶质大分子由于与膜存在物理化学相互作用或机械作用而引起的在膜表面或膜孔内吸、沉积造成膜孔径变小或堵塞，使膜产生透过流量与分离特性的不可逆变化的现象。

2.浓差极化：

指在分离过程中，料液中的溶剂在压力驱动下透过膜，溶质被截留，于是在膜表面与临近膜面区域浓度越来越高。

在浓度梯度作用下，溶质由膜面向本体溶液扩散，形成边界层，使流体阻力与局部渗透压增加，从而导致溶剂透过量下降。

溶剂向膜面流动引起溶质向膜面的流动，这种流动如果与浓度梯度所驱动的溶质向本体溶液扩散的速度平衡时，在膜面附近就形成一个稳定的浓度梯度区，这一区域就称为浓度极化边界层，这一现象称为浓差极化。

浓差极化是一个可逆的过程；

21．试述非线性色谱的概念及其特点?

非线性色谱:

流动相中的样品浓度（Cm）与固定相中的样品浓度（Cs）不呈线性关系的色谱.分析色谱大多属于线性色谱;制备色谱大多属于非线性色谱

22．非线性色谱的特点：

1.样品的保留值可变:

非线性色谱的保留值随样品及其浓度的不同而变化;

2.峰形的不对称性:

不是高斯正态分布的;

3.色谱峰的峰高与浓度不是线性关系:

峰高增加的速率随浓度的增加而下降.