分子实验室细胞实验室常用配方.docx
- 文档编号:4393445
- 上传时间:2022-12-01
- 格式:DOCX
- 页数:18
- 大小:24.40KB
分子实验室细胞实验室常用配方.docx
《分子实验室细胞实验室常用配方.docx》由会员分享,可在线阅读,更多相关《分子实验室细胞实验室常用配方.docx(18页珍藏版)》请在冰豆网上搜索。
分子实验室细胞实验室常用配方
(一)WB相关试剂及常用缓冲液
●RIPA(100mI)(最后要调pH为7.4)
终浓度
分子量
称取
Tris-HCI(pH7.4)
50mM
121.14
605.7mg
NaCI
150mM
58.44
876.6mg
TritonX-100
1%
1mI
脱氧胆酸钠
1%
1g
EDTA
1mM
292.248
29.2248mg
SDS
0.1%
0.1g
PMSF(100mM)
使用时每1ml加10ul
●10%过硫酸铵溶液AP(分装保存于-20度)
AP粉末1g
ddH2010ml
●10%SDS(十二烷基硫酸钠):
SDS粉末10g
ddH20定容到100ml
注意:
用磁力搅拌器搅拌不会容易起泡泡
●6X蛋白质samplebuffer
Tris-HCl(1M,pH6.8)30mL
SDS10g
甘油30mL
DTT(154.25)9.3g
溴酚蓝0.06g
ddH20定容至100mL
●10XPBS缓冲液的配制:
NaCl80g
KCl2g
Na2HPO414.4g(十二水合36g)
KH2PO402.4g
加800mLddH2O,根据开始的pH用NaOH或HCL调pH到7.4,调好pH再定容到1升。
配好后用高压蒸气灭菌后常温保存最好是在4度
●PBST(1X)
PBS(1X)500ml
Tween20500μl
●50×Tris-乙酸(TAE)缓冲液配制1L溶液各成分的用量
●Tris粉末242g
冰醋酸57.1ml
Na2EDTA·2H2O37.2g
ddH20定容到1L
●封闭液
脱脂奶粉5g
叠氮钠0.02g(现配现用时可不加)
PBS定容到100mL
●染色液(室温)
1L
500ml
200ml
100ml
甲醇
500mL
250
100
50
乙酸
100mL
50
20
10
R250考马斯亮蓝
0.5g
0.25g
0.1g
0.05g
H20
400mL
200
80
40
●脱色液:
(室温)
甲醇165mL
乙酸50mL
H20785mL
●8.8Buffer:
(调pH至8.8,4度保存)
100ml
200ml
Tris
18.17g
36.34g
10%SDS
4mL
8ml
ddH20
定容至100mL
200ml
●6.8Buffer:
(调pH至6.8,4度保存)
100ml
200ml
Tris
6.06g
12.12g
10%SDS
4mL
8ml
ddH20
定容至100mL
200ml
●转移缓冲液(10×transbuffer):
(常温保存)
1L
2L
甘氨酸
144g
288g
Tris粉末
30.3g
60.6
ddH20
定容至1L
定容至2L
使用时甲醇200mL
转移缓冲液(10×)100mL
ddH20700mL
●电泳缓冲液(10×)(runningbuffer):
(常温保存)
1L
2L
甘氨酸
144g
288g
Tris粉末
30.3g
60.6
SDS
10g
20g
ddH20
定容至1L
定容至2L
●10Х)TBS:
(常温保存)
NaCl80.0g
Tris粉末24.2g
ddH20定容至1L
●TBST(1X)
TBS(1X)500ml
Tween20500μl
●Strippingbuffer(可反复利用)温老师组配方
10%SDS10ml
Β-巯基乙醇350μl
Tris-HCI(pH6.8)6.25ml(6.06加到50mL水)
加入ddH2O至50mL
●Strippingbuffer(可反复利用)郭老师给配方
甘氨酸15g
SDS1g
Tween201ml
ddddH2O1L
作这个buffer洗20min,然后用PBST洗3次,再重新封闭孵抗体。
(二)细胞和细菌培养基、抗生素
●LB培养基(当天灭菌后放4度存放)
1000ml
500ml
300ml
250ml
200ml
氯化钠
10g
5g
3g
2.5g
2g
蛋白胨
10g
5g
3g
2.5g
2g
酵母提取物
5g
2.5g
1.5g
1.25g
1g
ddH20
定容至1000ml
定容至500ml
定容至300ml
定容至250ml
定容至200ml
●LB平板:
(当天灭菌后倒平板,放4度存放)
1000ml
500ml
300ml
250ml
200ml
氯化钠
10g
5g
3g
2.5g
2g
蛋白胨
10g
5g
3g
2.5g
2g
酵母提取物
5g
2.5g
1.5g
1.25g
1g
琼脂
15g
7.5g
4.5g
3.725g
3g
ddH20
定容至1000ml
定容至500ml
定容至300ml
定容至250ml
定容至200ml
●SOB培养基
将下列组分溶解在0.9L水中:
蛋白胨20g
酵母提取物5g
氯化钠0.5g
1mol/L氯化钾2.5ml
用水补足体积到1L。
分成100ml的小份,高压灭菌。
培养基冷却到室温后,再在每100ml的小份中加1ml灭过菌的1mol/L氯化镁
●1MIPTG(异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(分子量为238.3))溶液
IPTG粉末2.383g
ddH20定容到10ml
用0.22μm滤器过滤除菌,分装成1ml小份贮存于-20℃。
●Amp+(50mg/ml)
Amp+粉末50mg
ddH201ml
注意:
分装保存于-20度,使用时按1000:
1的比例用
●Kana+(50mg/ml)
Kana+粉末50mg
ddH201ml
注意:
分装保存于-20度,使用时按1000:
1的比例用
●胰酶:
抽滤,长期保存可放负20度
粉末0.25g
EDTA0.02-0.03g
1XPBS100ml
●高糖DMEM培养基:
抽滤保存在4度
粉末全部
碳酸氢钠3.7g
ddH20定容到1L(用盐酸调pH值到:
7.2-7.4)
●G418母液(100mg/ml)用0.22μM滤菌,分装存于-20度
粉末1g
PBS10ml
●zeocin母液(100mg/ml)用0.22μM滤菌,分装存于-20度
粉末1g
ddH2O10ml
●Blasticidin(100mg/ml)用0.22μM滤菌,分装存于-20度
粉末0.3g
PBS10ml
(三)利用His-tag从细菌中纯化蛋白配方
透析液配方
终浓度
母液浓度
量取体积
Tris-HCl(pH:
8.0)
20mM
1M
20ml
NaCl
20mM
4M
5ml
MgCl2
2mM
1M
2ml
DTT
1mM
1M
1ml
甘油
50%
500ml
ddH2O
472ml
●超声裂解液(lysisbuffer):
2011年做蛋白纯化时用
Na3PO4(164)8.2g(50mM)
NaCl(58.5)17.55g(300mM)
加800mLddH2O溶解,用2MNaOH或者2MHCL调pH到8.0,再定容到1升。
配好后用高压蒸气灭菌后常温保存。
●洗涤液(washbuffer):
2011年做蛋白纯化时用
Na3PO48.2g(50mM)
NaCl17.55g(300mM)
咪唑0.681g(10mM)
加800mLddH2O溶解,根据开始的pH用2MNaOH或者2MHCL调pH到8.0,调好pH再定容到1升
●洗脱液(elutionbuffer):
2011年做蛋白纯化时用
Na3PO48.2g(50mM)
NaCl17.55g(300mM)
咪唑17.025g(250mM)
加800mLddH2O溶解,根据开始的pH用2MNaOH或者2MHCL调pH到8.0,调好pH再定容到1升)
PrepEase®Histidine-TaggedProteinPurificationKits-HighSpecificity
●8XLEWBuffer(Lysis-Equilibrium-WashBuffer):
(室温保存)pH:
8.0
NaH2PO4.2H2O6.2404g(400mM)
NaCl14.0256g(2.4M)
dH20定容到100mL(调节pH:
8.0)
●4XElutionBuffer:
(室温保存)pH:
8.0
NaH2PO4.2H2O3.1202g(200mM)
NaCl7.0128g(1.2M)
咪唑6.81g(1M)
dH20定容到100mL(调节pH:
8.0)
●EDTA:
(100mM)
EDTA2.923g
dH20定容到100mL
●NiSO4:
NiSO4.6H2O2.6285g(100mM)
dH20定容到100mL
●溶菌酶:
(使用时1ml溶液加入20ul)
粉末50mg
ddH201mL
(四)利用His-tag从细胞中富集蛋白配方
●磷酸钠缓冲液
按图示比例混合0.2MNa2HPO4溶液和0.2MNaH2PO4溶液,得到两种缓冲液,pH分别调节成为8.0和6.3.
pH
0.2MNa2HPO4体积/mL
0.2MNaH2PO4体积/mL
6.3
11.25
38.75
8.0
47.35
2.65
●细胞裂解液(最好新鲜配制,当天使用)
Celllysisbuffer
终浓度
配10ml
配15ml
配20ml
配40ml
配30ml
盐酸胍(g)
6M
5.7318
8.5977
11.4636
22.9272
17.1954
Tris(g)
10mM
0.012114
0.018171
0.024228
0.048456
0.036342
pH8.0buffer(ml)
100mM
5
7.5
10
20
15
(注意胍盐是有害试剂注意这里用的磷酸钠缓冲液pH必须8.0!
)
(注意二价阳离子螯合剂,还原剂,会导致镍从树脂上的洗脱)
本实验的所有试剂中EDTA浓度不得超过1mM,DTT浓度不超过5mM,巯基乙醇浓度不超过20mM。
●pH8.0的洗脱溶液(最好新鲜配制,当天使用)
pH8.0的washbuffer
终浓度
配100ml
配50ml
配20ml
配40ml
配30ml
Urea尿素(g)
8M
48.048
24.024
9.6096
19.2192
14.4144
Tris(g)
10mM
0.12114
0.06057
0.024228
0.048456
0.036342
pH8.0Na3PO4buffer(ml)
100mM
50
25
10
20
15
TritonX-100(ul)
0.1%(vol/vol)
100
50
20
40
30
b-mercaptoethanol.巯基乙醇(ul)
5mM
35
17.5
7
14
10.5
●pH6.3washbuffer(现配现用)
pH6.3的washbuffer
终浓度
100ml
配50ml
配30ml
pH6.3的washbuffer
Urea尿素(g)
8M
48.048
24.024
14.4144
Urea尿素(g)
Tris(g)
10mM
0.12114
0.06057
0.036342
Tris(g)
pH6.3Na3PO4buffer(ml)
100mM
50
25
15
pH6.3Na3PO4buffer(ml)
TritonX-100(ul)
0.1%(vol/vol)
100
50
30
TritonX-100(ul)
注意使用pH为6.3的磷酸缓冲液,而且pH不得低于6,pH要精确配制,非常重要!
Histidine的质子化,会导致镍树脂上的解离,所以要精确测定pH,并且以pH试纸校对,而不是仅仅依靠pH仪器。
●洗脱溶液
200mMImidazole咪唑,
5%(wt/vol)SDS,
150mMTris-HCl(pH6.7)
30%(vol/vol)丙三醇
720mM巯基乙醇
0.0025%(wt/vol)溴酚蓝
注意wt/vol是质量/体积之比例,而vol/vol是体积:
体积的比例。
(五)双向电泳溶液配制
●水化上样缓冲液(I):
尿素(8M)4.805g
CHAPS(4%)0.4g
DTT(65mM)0.098g(现加)
Bio-Lyte0.2%(w/v)50μI(40%现加)
溴酚蓝0.001%10μI(1%溴酚蓝)
MilliQ水定容到10mI,分装成10小管,-20度冰箱保存
●上样缓冲液(II):
尿素(7M)4.2g
硫脲(2M)1.52g
CHAPS(4%)0.4g
DTT(65mM)0.098g(现加)
Bio-Lyte0.2%(w/v)50μI(40%现加)
溴酚蓝0.001%10μI(1%溴酚蓝)
MilliQ水定容到10mI,分装成10小管,-20度冰箱保存
●上样缓冲液(III)
尿素(5M)3g
硫脲(2M)1.52g
CHAPS(2%)0.2g
SB3-10(2%)0.2g
DTT(65mM)0.098g(现加)
Bio-Lyte0.2%(w/v)50μI(40%现加)
溴酚蓝0.001%10μI(1%溴酚蓝)
MilliQ水定容到10mI,分装成10小管,-20度冰箱保存
●平衡缓冲液母液
尿素(6M)36g
SDS(2%)2g
Tris-HCI(pH8.8)0.375M25mI(1.5M)
甘油(20%)20mI
MilliQ水定容到100mI,分装10管,-20度保存
●胶条平衡缓冲液I(充分混匀,用时现配)
胶条平衡缓冲液母液10mI
DTT0.2g
●胶条平衡缓冲液II(充分混匀,用时现配)
胶条平衡缓冲母液10mI
碘乙酰胺0.25g
●低熔点琼脂糖封闭液
低熔点琼脂糖0.5%0.5g
Tris(25mM)0.303g
甘氨酸(192mM)1.44g
SDS(0.1%)1mI(10%SDS)
溴酚蓝(0.001%)100μI(1%溴酚蓝)
MilliQ水定容到100mI,加热溶解至澄清,室温保存
(六)同位素实验相关试剂
●BERreactionbuffer(10ml,分装于-20度)
分子量
配10ml母液
称取
终浓度
Hepes-KOH(pH7.8)
238.31
1M称2.3831g
0.4mI
40mM
KCI
74.55
1.4M称1.0437g
0.5mI
70mM
DTT
154.25
1M称1.5425g
10μI
1mM
EDTA·2Na
372.23
1M称3.7223g
5μI
0.5mM
MgCI2·6H2O
203.30
1.4M称2.8462g
50μI
7mM
ATP
100mM
0.2mI
2mM
ddH2O
8.835mI
●2XligaseIactivitybuffer
终浓度
母液
配10ml取
Hepes(pH7.5)
60mM
1M
0.6ml
KCl
60mM
1M
0.6ml
MgCI2·6H2O
16mM
1M
0.16ml
DTT
2mM
1M
0.02ml
BSA
200μg/ml
2mg
ddH2O
至10ml
●2XAnnealingbuffer
Tris-HCI(pH7.5-8.0)20mM
NaCI100mM
EDTA2mM
●2X同位素反应buffer(polymerasebeta聚合反应)
终浓度
母液
10ml
Tris-HCl
100mM(pH8.0)
1M
1ml
MgCI2·6H2O
20mM
1M
0.2ml
DTT
4mM
1M
0.04ml
NaCl
40mM
4M
0.4ml
甘油
20%
2ml
ddH2O
至10ml
●2XAPE1活力鉴定buffer
终浓度
母液
配10ml
Trls-HCL(pH8.0)
100mM
1M
1ml
KCl
60mM
1M
0.6ml
MgCl2·6H2O
10mM
1M
0.1ml
甘油
20%
2ml
ddH2O
至10ml
●同位素电泳上样buffer(2X)(100ml)
终浓度
取
甲酰胺染料
90%
90ml
EDTA·Na2
30mM
111.669gX10-2
溴酚蓝(17kd)
0.02%
0.02g
二甲苯蓝
0.02%
0.02g
●10XTBEbuffer
Tris0.89M26.945g
硼酸(pH8.3)0.89M13.757g
Na2EDTA20mM1.86115g
●15%DenaturedDNAPAGEgel(100ml)
10XTBE15ml
40%,19:
1gelstock37.5ml
ddH2O16ml
Urea48g
存放在4度,使用前加200μl10%AP和20μlTEMED
●20%DenaturedDNAPAGEgel
10XTBE15ml
40%,19:
1gelstock50ml
ddH2O3.5ml
Urea(尿素)48g
存放于4度,使用前取35ml混合液加140μl10%AP和140μlTEMED
●硼氢化钠(1M)37.83
粉末0.7566g
ddH2O10ml
●2XdRPbuffer(分装保存于负20度)
分子量
母液
终浓度
配10ml
Hepes(pH7.5)
238.31
1M
100mM
1ml
MgCl2·6H2O
203.30
1M
20mM
0.2ml
KCl
74.55
1M
40mM
0.4ml
DTT
154.25
1M
4mM
0.04ml
ddH2O
8.36ml
●DNAbindingbuffer
终浓度
母液
分子量
配250ml
Tris-HCI(pH8.0)
50mM
1M
12.5
NaCl
100mM
58.3
1.4625g
MgCl2·6H2O
10mM
203.3
0.51g
Glycerol
10%
25ml
NP-40
0.1%
0.25ml
(七)酶切打质谱相关配方
NH4HCO3(79.06)100mM
粉末0.7906g
ddH2O定容到100ml,pH7.8-8.0
DTT(154.25g)100mM
粉末0.01542g
ddH2O1ml
IAA(碘乙酰胺,184.96)200mM
粉末0.036992g
ddH2O1ml
(八)其他配方
●2XHEPES-缓冲液(潘老师给的配方做细胞转染,需要调pH为7.05,用0.22μM滤菌,分装存于-20度)。
分子量
终浓度
称取
NaCI
58.5
280mM
1.6g
KCI
74.55
10mM
0.074g
Na2HPO4
141.96
1.5mM
0.021g
葡萄糖
180.06
12mM
0.21g
HEPES
238.31
50mM
1.19g
ddH20
定容到80ml
●CaCI2·2H2O(2M)147.02潘老师给的配方做细胞转染
粉末5.88g
ddH2O20ml
0.22μm滤菌,分装存于-20度
●5XTBS(1L体系)(在利用flagtag带磁珠的抗体富集蛋白时用)
Tris-HCI(250mM)30.275g
NaCI(750mM)43.875g
ddH20定容至1L(调节pH为7.4)
●MMS甲磺酸甲酯(Sigma密度为1.3g/mI,M=110.13)
1M体系:
液体85μIddH2O915μI
●Hochest
母液:
1mg/ml,避光存于-20度
工作液:
母液按1:
1000稀释
●TritonX-100(0.2%)
TritonX-1002μl
ddH2O1ml
●2XHDMbuffe(II)曾用于LSD1去甲基化
终浓度
母液
配10ml取
Tris(pH8.5)
100mM
1M
1ml
KCl
100mM
1M
1ml
MgCI2·6H2O
10mM
1M
0.1ml
BSA
1%
0.1g
甘油
5%
1ml
ddH2O
6.9ml
100mmol/LPMSF(苯甲基磺酰氟):
分成贮存于-20℃。
PMSF粉末1.742g
异丙醇/甲醇定容到10ml
【注意】PMSF严重损害呼吸道粘膜、眼睛及皮肤,吸入、吞进或通过皮肤吸收后有致命危险。
一旦眼睛或皮肤接触了PMSF,应立即用大量水冲洗之。
凡被PMSF污染的衣物应予丢弃。
●5mol/L氯化钠(NaCl):
氯化钠29.2g
ddH20定容到100ml
●2.5%X-gal(5-溴-4-氯-3-吲哚-β-半乳糖苷):
X-gal25mg
二甲基甲酰胺(DMF)1ml
注意:
用铝箔包裹装液管,贮存-20℃。
●DEPC(焦碳酸二乙酯)处理水
●加100ulDEPC于100ml水中,使D
- 配套讲稿:
如PPT文件的首页显示word图标,表示该PPT已包含配套word讲稿。双击word图标可打开word文档。
- 特殊限制:
部分文档作品中含有的国旗、国徽等图片,仅作为作品整体效果示例展示,禁止商用。设计者仅对作品中独创性部分享有著作权。
- 关 键 词:
- 分子 实验室 细胞 常用 配方