RTPCR详细图文解析.docx
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RTPCR详细图文解析
RT-PCR详细图文解析(总9页)
一、实时荧光定量PCR原理
(一)定义:
在PCR反应体系中加入荧光基团,利用荧光信号累积实时监测整个PCR进程,最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。
(二)实时原理
1、常规PCR技术:
对PCR扩增反应的终点产物进行定量和定性分析无法对起始模板准确定量,无法对扩增反应实时检测。
2、实时定量PCR技术:
利用荧光信号的变化实时检测PCR扩增反应中每一个循环扩增产物量的变化,通过Ct值和标准曲线的分析对起始模板进行定量分析
3、如何对起始模板定量
通过Ct值和标准曲线对起始模板进行定量分析.
4、几个概念:
(1)扩增曲线:
(2)荧光阈值:
(3)Ct值:
CT值的重现性:
5、定量原理:
理想的PCR反应:
X=X0*2n
非理想的PCR反应:
X=X0(1+Ex)n
n:
扩增反应的循环次数
X:
第n次循环后的产物量
X0:
初始模板量Ex:
扩增效率
5、标准曲线
6、绝对定量
1)确定未知样品的C(t)值
2)通过标准曲线由未知样品的C(t)值推算出其初始量
7、DNA的荧光标记:
二、实时荧光定量PCR的几种方法介绍
方法一:
SYBRGreen法
(一)工作原理
1、SYBRGreen能结合到双链DNA的小沟部位
2、SYBRGreen只有和双链DNA结合后才发荧光
3、变性时,DNA双链分开,无荧光
4、复性和延伸时,形成双链DNA,SYBRGreen发荧光,在此阶段采集荧光信号。
PCR反应体系的建立及优化:
1、SYBRGreen使用浓度:
太高抑制Taq酶活性,太低,荧光信号太弱,不易检测 2、Primer:
引物的特异性高,否则扩增有杂带,定量不准 3、MgCl2的浓度:
可以降低到,以减少非特异性产物 4、反应Buffer体系的优化 5、反应温度和时间参数:
由酶和引物决定 6、其他与常规PCR相同
(二)应用范围
1、起始模板的测定; 2、基因型的分析; 3、融解曲线分析:
可以优化PCR反应的条件,对常规PCR有指导意义,如对primer的评价;可以区分单一引物、引物二聚体、变异产物、多种产物。
(三)优点及缺点
优点:
对DNA模板没有选择性;适用于任何DNA;使用方便;不必设计复杂探针;非常灵敏;便宜。
缺点:
容易与非特异性双链DNA结合,产生假阳性;但可以通过融解曲线的分析,优化反应条件;对引物特异性要求较高。
方法二:
TaqMan---水解型杂交探针
**5′端标记有报告基团(Reporter,R),如FAM、VIC等?
**3′端标记有荧光淬灭基团(Quencher,Q) **探针完整,R所发射的荧光能量被Q基团吸收,无荧光,R与Q分开,发荧光 **Taq酶有5′→3′外切核酸酶活性,可水解探针
(一)工作原理
注意:
每扩增一条DNA分子,释放一个荧光信号,可以在循环过程中任一点检测荧光
PCR反应的建立:
1、引物、探针的设计:
探针Tm为68-70℃,<30bp,5’不能有G,G可能会淬灭荧光素, 引物尽量靠近探针,扩增片段<400bp,引物Tm为59-60℃
2、反应参数的确定:
一般为:
94℃,10-20S
60℃,30-60S(Taq酶5′→3′外切核酸酶活性在60℃最高)
也可通过温度梯度优化退火温度72℃,45S,
3、优化引物和探针浓度:
获得最小Ct值,信号/背景比值的最大值?
引物浓度:
50-900nM 探针浓度:
50-250nM
4、其他与常规PCR相同
(二)优缺点
优点:
对目标序列的高特异性 ------阴性结果确定 设计相对简单 ------与目标序列某一区域互补 重复性比较好
缺点:
只适合一个特定的目标; 委托公司标记,价格较高; 不易找到本底低的探针
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