猪圆环病毒病2型灭活疫苗LG株工艺规程教学提纲.docx

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猪圆环病毒病2型灭活疫苗LG株工艺规程教学提纲

猪圆环病毒病2型灭活疫苗（LG株）工艺规程

编号:

SC-TS-02-218

猪圆环病毒2型灭活疫苗（LG株）

工艺规程

上海海利生物药品有限公司

工艺规程

生产管理

上海海利生物药品有限公司

编号:

SC-TS-02-218

生效日:

1/16页

标题:

猪圆环病毒2型灭活疫苗（LG株）工艺规程

起草 :

起草日期 :

部门审核 :

审核日期 :

QA审核 :

审核日期 :

批准 :

批准日期 :

分发部门 :

质管部、技术研发部、生产部

题目 :

猪圆环病毒2型灭活疫苗（LG株）工艺规程

编号:

SC-TS-02-218

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1.主题内容

本标准规定猪圆环病毒2型灭活疫苗（LG株）达到的技术要求。

2.适用范围

本标准适用于猪圆环病毒2型灭活疫苗（LG株）

3.引用标准

国家标准（猪圆环病毒2型灭活疫苗（LG株）制造及检验试行规程）。

4.规程内容

4.1品名

通用名称：

猪圆环病毒2型灭活疫苗（LG株）

英文名：

PorcineCircovirusType2Vaccine,Inacitvated（StrainLG）

汉语拼音：

ZhuYuanhuanbingduErxingMiehuoyimiao（LGZhu）

4.2剂型

水包油剂型

4.3规格

20ml/瓶、40ml/瓶、100ml/瓶、250ml/瓶

4.4菌（毒）种

1.来源：

中国农业科学院哈尔滨兽医生物研究所保存

2.毒株：

猪圆环病毒LG株

3.代次：

56～60代

4.保存温度：

-80℃以下保存

4.5批准文号

兽药生字（2010）090201071

4.6工艺流程图

猪圆环病毒2型灭活疫苗（LG株）工艺流程图

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猪圆环病毒2型灭活疫苗（LG株）工艺规程

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4.7质量控制点

工序名称

控制项目

控制标准

细胞消化

消化液

0.125%胰蛋白酶+0.01EDTA溶液；50-100mL/转瓶

消化温度

37℃

消化时间

转动转瓶，待细胞层开始出现裂缝时终止，一般为45秒

转瓶培养

温度

37℃恒温室的控制

时间

细胞生长成单层即可结束培养，一般为24小时左右

转速

转瓶机设置为10～12转/小时

接毒

接种量

无菌控制下接种，5%

无菌检测

取样，T.G、G.P、G.A培养基培养应无菌

调PH值

PH值

2日后，无菌，7.5%碳酸氢钠调PH为7.2

观察

细胞病变情况

出现混浊，可能污染，弃去。

细胞病变达70%~80%时收获

收获

无菌

无菌控制下操作，不污染

灭活

灭活剂

0.2%的甲醛

灭活温度

调整灭活罐的温度为37℃

灭活时间

灭活充分，维持24小时

乳化

水相、油相比例

保证抗原含量并不分层，水相：

油相为9:

1

乳化时间

30分钟

乳化温度

0～10℃

4.8活性物质制备工艺过程

4.8.1PK-15细胞系标准：

1.细胞形态：

用含10%的小牛血清的MEM培养液培养细胞，置37℃、含5%CO2培养箱中培养，2～3小时可貼壁，培养48小时应在1/2以上的瓶面出现细胞岛，并有部分相连、镜检时细胞形态是椭圆形或梭状上皮细胞，明朗、轮廓清晰、胞浆内可见小颗粒，72～96小时形成单层。

2.细胞纯净性：

应无菌、无霉菌、无支原体、无外源病毒污染。

3.细胞致瘤性检验：

不致瘤。

4.细胞核学检查：

不同代次的细胞与基础细胞库的细胞相比，所有细胞的染色体模式数不得高出15%，核型必须相同。

5.制苗的细胞代次：

第20～40代之间。

6.细胞保存：

液氮保存，保存期为36个月。

4.8.2生产用毒种要求

◆病毒含量：

每毫升病毒含量应不低于105.5TCID50

◆纯净性：

病毒应无

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细菌

霉菌

支原体

其它外源病毒

◆特异性

与PCV2阳性血清中和后接种PK15细胞，中和细胞孔IPMA检测无明显着色反应，病毒对照孔呈棕红色染色。

◆毒种保存与毒种继代

1）在-20℃以下保存，应不超过1年。

2）继代应不超过3代。

4.8.3细胞的传代

Ø工艺过程

选生长2—3天已形成致密单层的细胞种按常规法进行细胞分散，37℃培养，2～3天传代一次。

传代细胞传代时的分种率一般1：

3即1瓶分3瓶，也可1：

5。

可根据生产和试验的需要和细胞生长的情况增殖和扩大细胞。

每次传代应在细胞瓶上（中方瓶、扁瓶、圆瓶）注明细胞代次、日期。

◆生长不良、形态不好的细胞不能用。

Ø工作条件

工作环境

洁净级别：

100级

温度：

18～26℃

相对湿度：

30～65%

压差：

大于5Pa

工作器械

121℃高温灭菌

◆高温蒸汽灭菌工艺应进行验证

4.8.4接种

制备细胞同步接种5%LG毒种，置37℃温室的转瓶机上培养，转速10～12转/小时。

4.8.5观察和收获

Ø工艺过程

接种后每天逐瓶观察细胞病变，并做好记录，接毒后36～48小时用无血清的MEM培养基换液1次，继续培养72～96小时收获病毒液，置–20℃以下冰箱冻结保存，保存期不得超过12个月。

细胞培养物需冻融3次，检验无菌后，将数瓶圆瓶的病毒液混合后，无菌吸取病毒液小样，进行中间检验。

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Ø工作条件

工作环境

洁净级别：

100级

温度：

18～26℃

相对湿度：

30～65%

压差：

大于5Pa

工作器械

121℃高温灭菌

◆高温蒸汽灭菌工艺应进行验证

4.8.6.灭活工艺过程

Ø工艺过程

病毒液导入灭活罐后，将甲醛溶液缓缓导入灭活罐使其终浓度为0.2%，37℃灭活24小时。

灭活结束后用10%亚硫酸钠加入病毒液，使其终浓度为0.05%终止灭活。

Ø工作环境

工作条件

洁净级别：

10000级

温度：

18～26℃

相对湿度：

30～65%

压差：

大于5Pa

工作器械

121℃高温灭菌

◆高温蒸汽灭菌工艺应进行验证

4.8.7半成品检验

4.8.7.1按照现行《中国兽药典》附录进行检验，应无

细菌

霉菌

支原体

外源病毒

4.8.7.2病毒含量检验IPMA（免疫过氧化物酶单层细胞染色法）

1）将毒种用无血清MEM培养基做10倍系列稀释。

2）取10-3、10-4、10-5、10-64个稀释度各接种96孔细胞培养板，每个稀释度接种4孔，每孔100UL,同时设不接毒的空白对照4孔；

3）每孔再加入100uL加入新消化的PK15细胞悬液

4）37℃、含5%CO2培养箱中培养72小时

5）用33%丙酮-PBS固定，用PCV2阳性血清进行IPMA试验，测定各孔中病毒感染情况，按照Reed-Muench法计算TCID50，每ml病毒含量应不低于105.5TCID50。

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4.8.7.3抗原灭活检验后检验

◆按现行《中国兽药典》附录进行检验，应无菌

◆灭活检验灭活后的病毒液10倍稀释后取10-1、10-2、10-33个稀释度，每个稀释度各取1ml接种到新消化的PK15细胞培养瓶中，37℃、含5%CO2培养箱中培养96小时，盲传2代，按照病毒含量检验法检验，应均为阴性结果。

4.8.8岗位定员和生产周期

岗位

人员

生产周期

制细胞

3

每批共7天

配液

2

接种

2

收获

3

4.8.9原材料：

PK15细胞，其质量标准应符合PK15细胞系的要求。

4.9活性物质生产技术经济指标和原料利用率计算

原料

营养液

收获得益率

数量

PK-15细胞

10*1000

95%

价值/元

500

10*1000*0.2

1000*10*0.95

每ml活性物质

（500+2000）/1000*10*0.95=0.2631元

4.10油乳剂灭活疫苗制造工艺过程

4.10.1配方

灭活液

水相

9份

15AVG

油相

1份

4.10.2油相制备

为法国SEPPIC提供的MontanideTMISA15AVG佐剂，

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4.10.3水相制备

为已灭活的病毒液

4.10.4乳化

按照上述比例，先将水相加之乳化容器中进行搅拌，然后缓慢加入油相，以800r/min搅拌30分钟，再静止30分钟。

4.10.5分装

4.10.5.1内包装容器

Ø名称：

西林瓶或药用高密度聚乙烯瓶、丁腈橡胶塞

Ø药用高密度聚乙烯瓶由符合GMP要求的厂家直接提供。

Ø丁腈橡胶塞灭菌：

121℃，蒸汽灭菌20分钟。

Ø西林瓶清洗：

用超声波清洗机清洗2-3次；121℃，干热灭菌60分钟。

4.10.5.2分装生产：

生产好的疫苗产品，移至分装生产线上，进行分装，有20ml/瓶、40ml/瓶、100ml/瓶、250ml/瓶四

种规格。

4.10.5.3工作环境

工作条件

洁净级别：

100级

温度：

18～26℃

相对湿度：

30～65%

压差：

大于5Pa

工作器械

121℃高温灭菌

◆高温蒸汽灭菌工艺应进行验证

4.10.6轧盖贴签装箱

Ø压盖：

分装完毕的产品，立即进入压盖生产线，加上铝盖，进行压盖。

Ø贴签：

贴签机调整设置好相应的产品批号及有效期限，进入贴签程序。

Ø装盒：

20ml每10瓶一盒，盒内放置说明书，用条形码封小盒口；装箱。

100ml每一瓶装入纸箱，盒内放置说明书，再每10瓶装入一盒；用条形码封小盒口。

Ø装箱：

外箱用泡沫箱外套纸箱，20ml每箱放入49盒疫苗，并在包装箱外侧贴一张该产品的标签。

100ml每箱放入9盒疫苗，并在包装箱外侧贴一张该产品的标签。

Ø入库。

注：

批号设置、贴签印刷应符合《兽药瓶签、说明书的管理规定》

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4.10.7岗位定员和生产周期

岗位

人员

生产周期

分装

4

1/2天

压盖

3

1/2天

贴签装箱

3

2天

4.11油乳剂剂制造技术经济指标

序号

项目及计算

指标

1

分装率（%）=实际分装瓶数/理论分装瓶数*100%

100%±5%

2

合格率（%）=合格瓶数/实际分装瓶数*100%

≥99%

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4.12设备一览表

编号

工序

设备名称

型号

规格

数量

制造单位

1

活性成分制备

恒温培养箱

HW-2500

0-100℃

2

上海一恒科学仪器有限公司

2

恒温摇床

YC-120

0-65℃

1

上海一恒科学仪器有限公司

3

转瓶机

SHXJ-VI

1400*650*14000

4

南京博健科技有限公司

4

-70℃冰箱

HAIER

450L

1

青岛海尔集团

5

2-8℃冷库

装配

40m2

2

上海开灵制冷有限公司

6

-20℃冰库

装配

20m2

1

上海开灵制冷有限公司

7

脉动真空灭菌柜

YXQ-MG-225

2200*2000*2200

1

华菱医疗设备制造有限公司

8

脉动真空灭菌柜

YXQ-MG-208

2415*1200*1800

1

华菱医疗设备制造有限公司

11

干热灭菌柜

101A

1600*1800*2550

1

华菱医疗设备制造有限公司

12

灭活

灭活罐

YJ-2005

2000L

4

上海永巨制药设备有限公司

13

电子天平

YH-1000

0.0001

1

上海一恒科技有限公司

14

乳化

乳化泵

RH-2000

2000L

3

上海华东制药机械有限公司

15

分装

分装机

HD-2005

0-20ml

1

上海华东制药机械有限公司

16

分装机

HD-2005

0-100ml

1

上海华东制药机械有限公司

17

自动胶塞清洗机

CDDA-10

2370*1320*1880

1

上海欣丽实业有限公司

18

臭氧灭菌柜

KER-1000

1600*1800*550

1

康尔医药设备制造有限公司

19

包装

轧盖机

XF-2005

1375*755*1600

1

上海华东制药机械有限公司

20

贴签机

TLJ

1650*845*1200

1

上海华东制药机械有限公司

21

检验

恒温箱

HIHENG

650*445*550

1

上海一恒科技有限公司

4.13生物安全及劳动保护

4.13.1技术安全

1.上岗工人必须经过“生物安全及自我防护”培训。

2.生产过程中，各岗位必须严格按照工艺规程、岗位标准操作程序及设备标准操作程序操作，不得违反。

3.生产时必须在符合兽药GMP要求环境条件下进行。

4.每次生产更换批号（或品种和规格），各工序须清洗工具容器和场地，达到清场要求。

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5.各工序半成品容器加盖密封存放，放至半成品贮存间规定的地方，防止异物混入，并有明显标志（有卡片），按品名、规格、批号存放或设棚栏隔开。

6.机器设备有专人管理、维护、保养。

严格执行安全用电规定，经常检查电源、线路，防止漏电短路，电源要接地线，禁止湿手开掣；机电设备严禁带病运转，机器运行时，严禁用手伸入转动部位；禁止用水洗电机转轴及皮带轮防护安全罩，操作时不能站在与皮带轮同一线上。

7.随时检查燃气系统，应保持完好无损，以免发生事故，设备、设施应定期检查完好情况。

8.管道标志明显：

水管涂绿色，药液管涂黄色，蒸气管涂红色，严防漏气漏液。

高压容器、管道系统等应经劳动技术安全部门检测合格方能使用。

9.各工序均应配备防火设施和其他意外应急设施，每个员工都要学会使用灭火器材。

10.各岗位操作人员须经严格岗位培训并经考核合格，凭岗位合格证才能上岗独立操作。

非本岗位人员不能顶替上班。

当班人员不能随意离开岗位，严禁窜岗，必需离开时要有本岗位人员接替方能离开。

交接班应交接清楚，认真填写交接班记录。

11.各岗位上岗须按规定穿戴工作服、帽、鞋、手套。

特别是接触强酸、强碱，要穿戴防护衣、胶手套、水鞋及防护镜，避免酸、碱液溅到身上。

万一被溅上皮肤，立即用大量水冲洗。

4.13.2劳动保护

1．上班人员均要按规定穿戴工作服、帽、鞋、防护手套等劳保用品。

2．使用显微镜的人员严格执行中休、班休制度，每年检查视力一次。

◆员工每年进行健康检查一次。

建立健康档案。

4.14物料

4.14.1注射用水的质量标准及检验

1）性状：

本品为纯化水经蒸馏所得的无色的澄明液体；无臭，无味。

2）检查

a :

pH值 :

应为5.0～7.0（附录ⅥH）。

b :

氨

取本品50ml，照纯化水的方法检查，

注：

对照用氯化铵溶液改为1.0ml，应符合规定（0.00002％）。

c :

细菌内毒素

取本品，依法检查（附录ⅪE），每1ml中含内毒素量应小于0.25EU。

d :

氯化物、硫酸盐与钙盐、硝酸盐与亚硝酸盐、二氧化碳、易氧化物、不挥发物与重金属

照纯化水的方法检查，应符合规定。

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4.14.2小牛血清

名称：

牛血清

质量标准：

2005年版《中华人民共和国药典》三部附录

供应商：

上海微科生化试剂有限公司（或经公司批准的其他符合规定的厂家）

4.14.3营养液

名称：

MEM

质量标准：

HG/T3935-2007

供应商：

清大天一生物科技有限公司（或经公司批准的其他符合规定的厂家）

4.14.4磷酸钠

名称：

磷酸钠

质量标准：

HG/T2968-1999

供应商：

国药集团化学试剂有限公司（或经公司批准的其他符合规定的厂家）

4.14.5磷酸氢二钾

名称：

磷酸氢二钾

质量标准：

HG-T3487-2000

供应商：

国药集团化学试剂有限公司（或经公司批准的其他符合规定的厂家）

4.14.6磷酸氢二钠

名称：

磷酸氢二钠

质量标准：

GB1263—2006

供应商：

国药集团化学试剂有限公司（或经公司批准的其他符合规定的厂家）

4.14.7胰酶

名称：

胰酶

质量标准：

GB/T21498-2008

供应商：

国药集团化学试剂有限公司（或经公司批准的其他符合规定的厂家）

4.14.8D-氨基葡萄糖

名称：

D-氨基葡萄糖

供应商：

Sigma（或经公司批准的其他符合规定的厂家）

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4.14.9无水氯化钙

名称：

无水氯化钙

质量标准：

HG/T2327-92

供应商：

国药集团化学试剂有限公司（或经公司批准的其他符合规定的厂家）

4.14.10苯酚红

名称：

苯酚红

质量标准：

GB/T15351-94

供应商：

国药集团化学试剂有限公司（或经公司批准的其他符合规定的厂家）

4.14.11佐剂

名称：

15AVG佐剂

质量标准：

供应商：

法国SEPPIC公司（或经公司批准的其他符合规定的厂家）

4.14.12EDTA

名称：

乙二胺四乙酸二钠（250g）

质量标准：

GB12593-2007

供应商：

国药集团化学试剂有限公司（或经公司批准的其他符合规定的厂家）

4.14.13乙醇

名称：

乙醇

质量标准：

中国药典，2000年版。

供应商：

国药集团化学试剂有限公司（或经公司批准的其他符合规定的厂家）

4.15成品质量标准

4.15.1物理性状

Ø外观本品为粉白色乳状液。

Ø剂型水包油型。

Ø稳定性取疫苗10ml加入离心管中，以3000r/min离心30分钟，管底析出的水相应不大于0.5ml。

Ø粘度用1ml吸管（出口内径1.2mm），吸取25℃左右的疫苗1ml，令其垂直自然流下，记录流出0.4ml所需的时间，应在4秒以内。

4.15.2无菌检验

应无菌生长。

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4.15.3安全检验

Ø用30～40日龄健康易感仔猪（IPMA法检测PCV2抗体效价，应低于50）5头。

各深部肌肉注射疫苗2ml。

连续观察14日。

接种前1日及接种后逐日测定体温，每日上、下午各测定1次。

应不出现体温升高，或仅于接种次日体温升高不超过1℃，在观察期内应不出现由疫苗注射引起的任何局部或全身不良反应。

4.15.4效力检验

下列方法任择其一。

（1）抗体检测用30～40日龄健康易感仔猪（IPMA法检测PCV2抗体，应低于50，见附注1）10头，随机等分成2组。

其中一组分别经颈部肌肉注射途径接种疫苗1ml，21日后，以相同剂量和途径加强免疫1次；另一组不接种疫苗，作为对照组。

二免后14日采集血，分离血清，用IPMA法（见附注1）检测血清抗体效价。

免疫猪应至少4头抗体效价不低于800，对照猪抗体效价均应低于50。

（2）免疫攻毒二免后14日，取上述免疫猪和对照猪，用PCV2LG株强毒攻击，通过滴鼻和肌肉注射途径各接种1ml（105.0TCID50）。

称取攻毒当日体重。

攻毒后28日，将所有猪称重后扑杀，取腹股沟淋巴结样品，采用荧光定量PCR法（见附注2）检测病毒核酸载量。

相对增重率（见附注3）应不低于5%；免疫猪应至少4头病毒核酸载量不高于3.5×107拷贝/g组织，对照猪应至少4头病毒核酸载量不低于1.45×109拷贝/g组织。

4.15.5甲醛含量测定

应不超过0.2%。

4.16贮藏和有效期

2-8℃保存，18个月

4.17包装材料要求

4.17.1标签

名称：

猪圆环病毒2型灭活疫苗（LG株）标签

质量标准：

80克铜板纸，内容符合《兽药瓶签、说明书的管理规定》

尺寸：

24mm×60mm，39mm×98mm

供应商：

上海郑盛印务有限公司（或经公司批准的其他符合规定的厂家）

4.17.2塑料瓶

名称：

外用液体药用高密度聚乙烯瓶

质量标准：

符合《中华人民共和国药品管理法》和《药品包装用材料和容器管理办法》

尺寸：

20mm

供应商：

沧州维康食品药品包装有限公司，江阴恒利源包装材料有限公司（或经公司批准的其他符合规

定的厂家）

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4.17.3铝塑盖

名称：

铝塑盖

质量标准：

符合《中华人民共和国药品管理法》和《药品包装用材料和容器管理办法》

尺寸：

d:

2cm,h:

1cm

供应商：

洛阳豫洛瓶盖有限公司（或经公司批准的其他符合规定的厂家）

4.17.4胶塞

名称：

丁腈橡胶塞

质量标准：

Q/HT006-2007 ;符合《中华人民共和国药品管理法》和《药品包装用材料和容器管理办法》

尺寸：

Φ20mm

供应商：

湖北应城市恒天药业包装有限公司（或经公司批准的其他符合规定的厂家）

4.17.5外包装箱

名称：

纸箱

质量标准：

符合《中华人民共和国药品管理法》和《药品包装用材料和容器管理办法》

尺寸：

610mm×346mm×410mm;440mm×342mm×420mm;375mm×286mm×318mm

供应商：

上海御风包装材料有限公司（或经公司批准的其他符合规定的厂家）

4.17.6保温箱

名称：

泡沫保温箱

质量标准：

符合《中华人民共和国药品管理法》和《药品包装用材料和容器管理办法》

尺寸：

360mm×280mm×300mm;600mm×340mm×390mm;430mm×335mm×390mm

供应商：

上海正泰泡塑厂、上海琅轩企业发展有限公司（或经公司批准的其他符合规定的厂家）

4.17.7内包装盒

名称：

小彩盒

质量标准：

符