热休克蛋白70减轻帕金森病细胞模型中α突触核蛋白毒性的作用.docx
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热休克蛋白70减轻帕金森病细胞模型中α突触核蛋白毒性的作用
热休克蛋白70减轻帕金森病细胞模型中α-突触核蛋白毒性的作用
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【摘要】目的探讨HSP70在因α-突触核蛋白过表达或突变所致的帕金森病(PD)细胞模型中的作用及其机制。
方法构建过表达野生型和PD相关突变型(A53T)α-突触核蛋白质粒,转染人神经母细胞瘤细胞(SH-SY5Y)细胞后得PD细胞模型;然后在细胞模型中转染表达HSP70的质粒。
采用免疫印迹检测转染HSP70细胞模型中α-突触核蛋白表达量的改变;采用MTT法检测转染HSP70后细胞模型活力的变化。
结果转染HSP70后,细胞模型α-突触核蛋白表达减少,细胞活性增加。
结论HSP70通过降低α-突触核蛋白表达水平对PD细胞模型发挥保护作用。
【关键词】α-突触核蛋白;热休克蛋白70;过表达 α-突触核蛋白是一种在中枢神经系统突触前表达的可溶性蛋白,具有调节膜稳定性和神经可塑性等生理功能。
近年研究发现,α-突触核蛋白基因过表达或突变可引起α-突触核蛋白的错误折叠、有毒蛋白寡聚体和多聚体的形成,使其结构和功能障碍,从而启动一系列级联反应致多巴胺能系统损伤,最终导致帕金森病(PD)。
研究认为神经保护剂可能是治疗PD的一个新的有效途径,而热休克蛋白70(HSP70)就是其中之一。
HSP70是分子伴侣家族中的一员,作为一种重要的应激蛋白,能与 错误折叠的蛋白相互作用,阻止聚集物的形成;除此之外,HSP70还有助于错误折叠蛋白的降解〔1,2〕。
在果蝇及酵母的PD模型中发现,HSP70能减轻α-突触核蛋白的毒性及其引起的神经细胞凋亡〔3,4〕,而HSP70抑制α-突触核蛋白毒性可能与其能够与α-突触核蛋白相互作用,阻止α-突触核蛋白纤维样聚集,降低α-突触核蛋白表达量有关〔5,6〕。
为进一步证实HSP70在α-突触核蛋白所致PD的作用,本实验首次在神经母细胞瘤细胞(SH-SY5Y)PD模型中检测了HSP70的作用及机制,发现HSP70可以通过降低α-突触核蛋白水平发挥对PD细胞模型的保护作用。
1材料与方法 1.1实验材料SH-SY5Y细胞购自ATCC公司;限制性内切酶购自Takara公司;QIAprepTIP100Kit购自QIAGEN公司;人胎脑cDNA文库、胎牛血清(FBS)、Lipofectamine2000购自Invitrogen公司;蛋白酶抑制剂cocktail购自Sigma公司;anti-α-synuclein204抗体、anti-beta-actin抗体购自Santacruz公司;聚偏二氟乙烯(PVDF)膜购自Millipore公司。
1.2方法 1.2.1质粒构建以人胎脑cDNA文库为模板,PCR获得α-突触核蛋白可编码序列(CDS序列)以NotⅠ和HindⅢ连接到pCDNA3.1真核表达载体中,通过overlapPCR方法,构建A53T突变体,同样以NotⅠ和HindⅢ连接到pCDNA3.1真核表达载体中。
按照QlAprepTIP100KitProtocol抽取并纯化质粒,测序证实。
pCDNA3.1-HSP70质粒由湘雅二医院肝移植中心李杰群博士惠赠。
1.2.2细胞培养与转染SH-SY5Y细胞采用含10%FBS的高糖DMEM培养液,置于37℃,5%CO2的培养箱培养。
转染严格按照Lipofectamine2000说明书进行。
用不含FBS的DMEM培养基洗涤细胞2次,24孔细胞培养板每孔加入含2μlLipofectamine2000及0.8μg质粒DNA、不含FBS的DMEM培养基500μl,在37℃,5%CO2的培养箱中孵育3h,改用含10%FBS的DMEM培养基继续孵育48h。
1.2.3免疫荧光将稳定表达蛋白的SH-SY5Y细胞接种到有盖玻片的24孔板中,用含10%FBS的DMEM培养于37℃、5%CO2培养箱中36h后,弃去培养基,3.7%的多聚甲醛/磷酸缓冲液(PBS)室温下固定15min。
PBS洗2次,每次5min。
0.2%的TritonX-100/PBS透化10min,PBS洗2次,5%牛血清白蛋白(BSA)封闭液,室温封闭30min。
加入1∶400稀释的anti-α-synuclein204一抗室温孵育60min,PBS洗3次,每次5min。
5%BSA封闭液,室温封闭20min。
加入1∶200稀释的anti-鼠IgG-Cy2二抗100μl,避光室温下孵育60min。
1×PBS洗3次,每次5min。
4,6-二氨基-2-苯基吲哚(DAPI)染细胞核,室温,避光反应2min。
PBS洗2次,每次5min。
去离子水洗1次,封片,用激光共聚焦显微镜扫描和照相。
1.2.4免疫印迹取细胞,吸去培养基,加入2×十二烷基硫酸钠(SDS)samplebuffer(125mmol/LTrisHCl,20%Glycerol,4%SDS,0.1%bromphenolblue,pH6.8)加入蛋白酶抑制剂cocktail裂解细胞,超声后,使用蛋白定量试剂盒测定蛋白浓度。
均取20μg总蛋白经18%SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳,并电转移至PVDF膜上。
以5%脱脂奶粉封闭1h后,加入相应一抗,4℃过夜,Tris缓冲生理盐水溶液(TBST)洗膜后,加入对应的辣根过氧化物酶标记的二抗,室温孵育60min,TBST洗膜后,电化学发光免疫分析法(ECL)发光,曝光。
内参照为鼠抗-actin单克隆抗体。
1.2.5细胞活力测定调节SH-SY5Y细胞密度约5×104/ml,以100μl/孔接种于96孔板,24h后分别转染pCDNA 3.1+HSP70;α-突触核蛋白野生型+pCDNA3.1;α-突触核蛋白野生型+HSP70;α-突触核蛋白A53T+pCDNA3.1;α-突触核蛋白A53T+HSP70;每种处理设3个复孔,24h后每孔加5mg/ml四甲基偶氮唑盐(MTT),继续培养4h。
弃培养基,每孔加二甲基亚砜(DMSO)100μl振荡混匀,待颗粒溶解后置于酶标仪上,空白孔调零,以570nm波长检测各孔吸光度值。
1.3统计学分析利用SPSS11.5软件进行统计分析,用t检验进行两组间差异比较。
2结果 2.1PD细胞模型的构建α-突触核蛋白野生型和突变型A53T在转染SH-SY5Y细胞后,胞浆和胞核都有分布,以胞浆分布为主,部分细胞α-突触核蛋白呈点状分布,可能为其聚集体。
免疫印迹也显示,SH-SY5Y细胞中α-突触核蛋白野生型和突变型A53T都得到了过表达,说明PD细胞模型构建成功。
见图1A、B。
2.2HSP70对PD细胞模型中α-突触核蛋白的影响了探讨HSP70对PD细胞模型中过表达的α-突触核蛋白的作用,将HSP70与α-突触核蛋白进行了共转染,通过免疫印迹检测HSP70对α-突触核蛋白表达的影响。
结果显示,无论是在α-突触核蛋白野生型还是突变型PD细胞模型中,HSP70均能降低α-突触核蛋白的表达。
见图2。
A:
免疫荧光检测α-syunclein野生型(左图)与A53T突变体(右图)在SH-SY5Y中的表达。
一抗为antiα-syunclein鼠单克隆抗体,二抗为cy2标记的antimouseIgG抗体。
蓝色为DAPI染色的细胞核。
B:
western印迹检测α-syunclein在SH-SY5Y中的表达。
一抗为antiα-syunclein鼠单克隆抗体,二抗为HRP标记的antimouseIgG抗体。
内参为细胞骨架蛋白betaactin。
图1α-syunclein过表达PD模型的建立Western印迹检测α-syunclein与HSP70共转染后,HSP70对α-syunclein野生型和突变性表达量的影响。
一抗为antiα-syunclein鼠单克隆抗体,antiHSP70单克隆抗体,二抗为HRP标记的antimouseIgG抗体。
内参为细胞骨架蛋白β-actin。
图2HSP70降低α-synuclein的表达量 2.3HSP70对PD细胞模型活力的影响转染野生型和突变体α-突触核蛋白后,SH-SY5Y细胞活性明显降低,说明α-突触核蛋白对SH-SY5Y具有毒性作用,PD细胞模型建立成功。
而增加HSP70的表达后,对比α-突触核蛋白野生型(α-synucleinWT)+pCDNA3.1组和α-突触核蛋白突变型(α-synucleinA53T)+pCDNA3.1组,表达HSP70能分别提高α-synucleinWT和α-synucleinA53T引起的细胞活性降低(P0.01),见表1。
表1MTT检测HSP70对过表达α-syuncleinSH-SY5Y细胞活性的影响 3讨论 α-突触核蛋白是一种分布于中枢神经系统突触前末梢,约15~20kD的可溶性蛋白质。
自然状态下呈一种非折叠构象,不形成明显的三维结构,但其N末端2/3的序列可以形成一系列双极性区域,可能介导其与膜结构的结合;当高浓度或异常修饰时,构象改变形成寡聚体甚至是聚集体,具有细胞毒性〔7,8〕。
与单体不同,这类寡聚体富含8片层结构,在原子力显微镜及电镜下,可以观察到这类寡聚体形成过程中,一般先呈包含20~30个α-突触核蛋白分子的圆状结构;随后因彼此聚合形成链状结构,最终转化为稳定的纤维状结构。
这种由单体向纤维状结构的改变,可能是α-突触核蛋白产生毒性作用的重要原因〔5,10〕。
研究进一步发现,与家族性PD有关的α-突触核蛋白A53T及A30P突变蛋白在体外均可以促进寡聚体的形成,同时,野生型α-突触核蛋白的过量表达也可以导致寡聚体的增加〔11,12〕。
当机体无法处理有毒的α-突触核蛋白中间体时,可能会导致α-突触核蛋白形成聚集体,最终导致PD的发生〔11,13,14〕。
分子伴侣作为一类介导协助蛋白形成与维持天然构象的重要细胞因子,在α-突触核蛋白蛋白结构状态转换过程中可能发挥着很重要的调控作用。
实验表明,路易小体中除α-突触核蛋白外,还含有其他蛋白质,而HSP是其中重要的蛋白之一〔15〕。
当α-突触核蛋白本身结构的改变或分子伴侣、降解系统出现异常时,α-突触核蛋白的毒性作用就体现出来了。
在模型动物的研究中发现,分子伴侣(HSP70、HSP40)的表达可减轻α-突触核蛋白的细胞毒性。
譬如,在PD果蝇模型中,HSP70的表达可以减轻或阻止α-突触核蛋白引起的神经元损伤;而在酵母中HSP70水平的增加也可以有效地减缓或抑制PD的发生〔3,4〕。
因此,分子伴侣蛋白可能通过协助α-突触核蛋白形成并维持正确构象而防止其聚集产生有毒害作用的聚集体。
本研究中,利用α-突触核蛋白过表达细胞模型发现,过表达HSP70后能使PD细胞活性增加,说明HSP70对PD细胞模型具有保护作用。
过表达HSP70后,α-突触核蛋白的表达量也降低,而目前已知α-突触核蛋白是导致PD发生的重要因素〔11,13,14〕,因此认为HSP70对PD细胞模型的保护作用是通过减少α-突触核蛋白的表达量的表达量而实现的。
由于 α-突触核蛋白的细胞毒性作用与其由单体向寡聚体转化有关〔9,10〕,因此推测,HSP70可能通过参与维持α-突触核蛋白的正确构象,减少其向有毒的寡聚体和聚集体状态进行转化,减少细胞的毒性作用。
【参考文献】 1HartlFU,Hayer-HartlM.Molecularchaperonesinthecytosol:
fromnascentchaintofoldedprotein〔J〕.Science,2002;295(5561):
1852-8. 2Dzaman-SerafinS,Telatynska-MieszekB,CiechanowskiK.Heatshockproteinsandtheircharacteristics〔J〕.PolMerkurLekarski,2005;19(110):
215-9. 3AuluckPK,ChanHY,TrojanowskiJQ,etal.Chaperonesuppressionofalpha-synucleintoxicityinaDrosophilamodelforParkinson′sdisease〔J〕.Science,2002;295(5556):
865-8. 4FlowerTR,ChesnokovaLS,FroelichCA,etal.Heatshockpreventsalpha-synuclein-inducedapoptosisinayeastmodelofParkinson′sdisease〔J〕.JMolBiol,2005;351(5):
1081-100. 5HuangC,ChengH,HaoS,etal.Heatshockprotein70inhibitsalpha-synucleinfibrilformationviainteractionswithdiverseintermediates〔J〕.JMolBiol,2006;364(3):
323-36. 6DedmonMM,ChristodoulouJ,WilsonMR,etal.Heatshockprotein70inhibitsalpha-synucleinfibrilformationviapreferentialbindingtoprefibrillarspecies〔J〕.JBiolChem,2005;280(15):
14733-40. 7JoE,McLaurinJ,YipCM,etal.alpha-Synucleinmembraneinteractionsandlipidspecificity〔J〕.JBiolChem,2000;275(44):
34328-34. 8JoE,DarabieAA,HanK,etal.alpha-Synuclein-synaptosomalmembraneinteractions:
implicationsforfibrillogenesis〔J〕.EurJBiochem,2004;271(15):
3180-9. 9CooksonMR,vanderBrugM.Cellsystemsandthetoxicmechanism(s)ofalpha-synuclein〔J〕.ExpNeurol,2008;209
(1):
5-11. 10GoedertM.Parkinson′sdiseaseandotheralpha-synucleinopathies〔J〕.ClinChemLabMed,2001;39(4):
308-12. 11GoedertM.Alpha-synucleinandneurodegenerativediseases〔J〕.NatRevNeurosci,2001;2(7):
492-501. 12MoussaCE,WersingerC,TomitaY,etal.Differentialcytotoxicityofhumanwildtypeandmutantalpha-synucleininhumanneuroblastomaSH-SY5Ycellsinthepresenceofdopamine〔J〕.Biochemistry,2004;43(18):
5539-50. 13SpillantiniMG,GoedertM.Thealpha-synucleinopathies:
Parkinson′sdisease,dementiawithlewybodies,andmultiplesystematrophy〔J〕.AnnNYAcadSci,2000;920:
16-27. 14UverskyVN,LiJ,SouillacP,etal.Biophysicalpropertiesofthesynucleinsandtheirpropensitiestofibrillate:
inhibitionofalpha-synucleinassemblybybeta-andgamma-synucleins〔J〕.JBiolChem,2002;277(14):
11970-8. 15CuervoAM,StefanisL,Fredenburg,R,etal.Impaireddegradationofmutantalpha-synucleinbychaperone-mediatedautophagy〔J〕.Science,2004;305(5688):
1292-5.
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