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分子生物学实验技术
pUC18载体的双酶切及阳性克隆检测
(崔嘉20162140284河北农业大学动物科技学院071000)
摘要:
为了探究Xbc基因的分子结构特征,本实验选择大肠杆菌质粒做为载体,通过PCR技术获得目的基因,再将其与质粒进行双酶切后体外连接,再将连接重组后的重组体转入大肠杆菌感受体细胞中进行扩增,最后,通过对重组克隆基因双酶切结果进行筛选,成功获得目的基因。
关键字:
Xbc基因大肠杆菌质粒PCR目的基因
TherecombinationandselectionoftheCystatingeneine.coli
Abstract:
ToexplorethemolecularstructureoftheXbcgenecharacteristics,Thisstudychooseescherichiacoliplasmidascarrier.GettingthepurposegenebyPCRtechnique.Withtheplasmidinvitroafterdoubleenzymeconnection,wewillconnectrestructuringofrecombinantintoamplificationofcompetentescherichiacolicells.Bytheresultoftherecombinantgenecloningdoubleenzymescreening,wewillgetsuccessfulgene.
Keyword:
Xbcgene,escherichiacoli,plasmid,PCR,targetgenePCR,
引言:
聚合酶链式反应是一种用于放大扩增特定的DNA片段的分子生物学技术,它可看作是生物体外的特殊DNA复制,PCR的最大特点,是能将微量的DNA大幅增加。
由1983年美国Mullis首先提出设想,1985年由其发明了聚合酶链反应,即简易DNA扩增法,意味着PCR技术的真正诞生。
到如今2013年,PCR已发展到第三代技术。
1973年,台籍科学家钱嘉韵,发现了稳定的TaqDNA聚合酶,为PCR技术发展也做出了基础性贡献。
PCR(聚合酶链式反应)是利用DNA在体外摄氏95°高温时变性会变成单链,低温(经常是60°C左右)时引物与单链按碱基互补配对的原则结合,再调温度至DNA聚合酶最适反应温度(72°C左右),DNA聚合酶沿着磷酸到五碳糖(5'-3')的方向合成互补链。
基于聚合酶制造的PCR仪实际就是一个温控设备,能在变性温度,复性温度,延伸温度之间很好地进行控制。
1950年以来在纸上和在聚丙烯酰胺或琼脂糖凝胶上区带电泳的应用,1960年以后,圆盘和顶替电泳(等速电泳)以及等电点聚焦又提供了许多提高分辨率的方法[1]。
DNA分子在琼脂糖凝胶中泳动时有电荷效应和分子筛效应。
DNA分子在高于等电点的pH溶液中带负电荷在电场中向正极移动。
由于糖-磷酸骨架在结构上的重复性质,相同数量的双链DNA几乎具有等量的净电荷,因此他们能以相同的速度向正极方向移动。
在一定的电场强度下,DNA分子的迁移速度取决于分子筛效应,即DNA分子本身的大小和构型。
具有不同的相对分子质量的DNA片段泳动速度不一样,可进行分离。
DNA分子的迁移速度与相对分子质量对数值成反比关系。
凝胶电泳不仅可以分离不同相对分子质量的DNA,也可以分离相对分子质量相同,但构型不同的DNA分子。
如质粒有3种构型:
超螺旋的共价闭合环状质粒DNA(covalentlyclosedcircμLarDNA,简称CCCDNA);开环质粒DNA,即共价闭合环状质粒DNA1条链断裂,(opencircμLarDNA,简称OCDNA);线状质粒DNA,即共价闭合环状质粒DNA2条链发生断裂,(linearDNA,简称LDNA)。
这3种构型的质粒DNA分子在凝胶电泳中的迁移率不同。
因此电泳后呈3条带,超螺旋质粒DNA泳动最快,其次为线状DNA和开环质粒DNA。
根据在电泳室中使用的电解质系统,可以把电泳作如下分类:
①自由界面电泳②自由溶液中的区带电泳③在不同支持物上的区带电泳④在有机溶剂中的凝胶电泳⑤亲和电泳⑥等速电泳⑦等点聚焦⑧免疫电泳。
也可按照不用支持体和用支持体来区别电泳技术,分为自由电泳(无支持体)及区带电泳(有支持体)两大类。
毛细管电泳是上世纪80年代后期分析化学,特别是生物分析化学的重大研究进展,也是90年代最有影响的分离手段之一[2]。
载体是携带靶DNA片段进入宿主细胞进行扩增和表达的媒介,没有载体,目的基因无法进入受体,即使进入受体细胞也无法表达[3]。
从细菌中分离质粒DNA的方法都包括3个基本步骤:
培养细菌使质粒扩增;收集和裂解细胞:
分离和纯化质粒DNA。
采用溶菌酶可以破坏菌体细胞壁,十二烷基磺酸钠(SDS)和TritonX-100可使细胞膜裂解。
经溶菌酶和SDS或TritonX-100处理后,细菌染色体DNA会缠绕附着在细胞碎片上,同时由于细菌染色体DNA比质粒大得多,易受机械力和核酸酶等的作用而被切断成不同大小的线性片段。
碱裂解法提取质粒是根据共价闭合环状质粒DNA与线性染色体DNA在拓扑学上的差异来分离它们。
在pH值介于12.0~12.5这个狭窄的范围内,线性的DNA双螺旋结构解开而被变性,尽管在这样的条件下,共价闭环质粒DNA的氢键会被断裂,但两条互补链彼此相互缠绕,仍会紧密地结合在一起。
当加入pH4.8的乙酸钾高盐缓冲液恢复pH至中性时,共价闭合环状的质粒DNA的两条互补链仍保持在一起,因此复性迅速而准确,而线性的染色体DNA的两条互补链彼此已完全分开,复性就不会那木迅速而准确,它们缠绕形成网状结构,通过离心,染色体DNA与不稳定的大分子RNA,蛋白质-SDS复合物等一起沉淀下来而被除去。
质粒DNA小量提取法对于从大量转化子中制备少量部分纯化的质粒DNA十分有用。
这些方法共同特点是简便、快速,能同时处理大量试样,所得DNA有一定纯度,可满足限制酶切割、电泳分析的需要。
限制性内切酶能特异地结合于一段被称为限制性酶识别序列的DNA序列之内或其附近的特异位点上,并切割双链DNA。
绝大多数限制酶识别长度为4至6个核苷酸的回文对称特异核苷酸序列。
限制性内切酶的酶解反应最适条件各不相同,各种酶有其相应的酶切缓冲液和最适反应温度(大多数为37℃)。
对质粒DNA酶切反应而言,限制性内切酶用量可按标准体系1μgDNA加1单位酶,消化1-2小时。
但要完全酶解则必须增加酶的用量,一般增加2-3倍,甚至更多,反应时间也要适当延长。
酶活力通常用酶单位(U)表示,酶单位的定义是:
在最适反应条件下,1小时完全降解1mgλDNA的酶量为一个单位,但是许多实验制备的DNA不象λDNA那样易于降解,需适当增加酶的使用量。
反应液中加入过量的酶是不合适的,除考虑成本外,酶液中的微量杂质可能干扰随后的反应。
DNA重组技术是用内切酶分别将载体和外源DNA切开,经分离纯化后,用连接酶将其连接,构成新的DNA分子。
转化(Transformation)是将外源DNA分子引入受体细胞,使之获得新的遗传性状的一种手段,它是微生物遗传、分子遗传、基因工程等研究领域的基本实验技术。
转化过程所用的受体细胞一般是限制修饰系统缺陷的变异株,即不含限制性内切酶和甲基化酶的突变体(Rˉ,Mˉ),它可以容忍外源DNA分子进入体内并稳定地遗传给后代。
受体细胞经过一些特殊方法(如电击法,CaCl2,RbCl(KCl)等化学试剂法的处理后,细胞膜的通透性发生了暂时性的改变,成为能允许外源DNA分子进入的感受态细胞(Compenentcells)。
进入受体细胞的DNA分子通过复制,表达实现遗传信息的转移,使受体细胞出现新的遗传性状。
将经过转化后的细胞在筛选培养基中培养,即可筛选出转化子(Transformant,即带有异源DNA分子的受体细胞)。
CaCl2法简便易行,且其转化效率完全可以满足一般实验的要求,制备出的感受态细胞暂时不用时,可加入占总体积15%的无菌甘油于-70℃保存(半年),因此CaCl2法使用更广泛。
本实验以E.coliTOP10菌株为受体细胞,并用CaCl2处理,使其处于感受态,然后与pUC质粒共保温,实现转化。
由于pUC质粒带有氨苄青霉素抗性基因(Ampr),可通过Amp抗性来筛选转化子。
如受体细胞没有转入pUC,则在含Amp的培养基上不能生长。
能在Amp培养基上生长的受体细胞(转化子)已导入了pUC。
蓝白斑筛选是重组子筛选的一种方法,根据载体的遗传特征筛选重组子,它并不破坏读框,但可使少数几个氨基酸插入到β-半乳糖苷酶的氨基端而不影响功能,这种载体适用于可编码β-半乳糖苷酶C端部分序列的宿主细胞。
因此,宿主和质粒编码的片段虽都没有酶活性,但它们同时存在时,可形成具有酶学活性的蛋白质。
这样,lacZ基因在缺少近操纵基因区段的宿主细胞与带有完整近操纵基因区段的质粒之间实现了互补,称为α-互补。
由α-互补而产生的LacZ+细菌在诱导剂IPTG的作用下,在生色底物X-Gal存在时产生蓝色菌落,因而易于识别。
然而,当外源DNA插入到质粒的多克隆位点后,几乎不可避免地导致无α-互补能力的氨基端片段,使得带有重组质粒的细菌形成白色菌落。
这种重组子的筛选,又称为蓝白斑筛选[4]。
由于pUC质粒带有氨苄青霉素抗性基因(Ampr),可通过Amp抗性来筛选转化子。
受体细胞没有转入pUC,则在含Amp的培养基上不能生长。
能在Amp培养基上生长的受体细胞(转化子)肯定已导入了pUC。
转化子扩增后,可将转化的质粒提取出,进行酶·步鉴定。
1.实验材料
1.1主要仪器及试剂
1.1.1仪器
超净工作台、高压灭菌锅、微波炉、微量移液器、摇床、离心机、电泳仪、胶槽、梳子、凝胶分析仪、紫外仪、PCR仪、恒温培养箱、冰箱等。
1.1.2试剂以及主要溶液配制
DNAmarker(DL5000)、PCRmix、E.coli(TOP10)、EcoRI、HindIII、T4ligase各2管、IPTG、X-gal
石蜡油、SDS、氨苄青霉素、卡那霉素、95%乙醇、无水乙醇、冰乙酸、胰蛋白胨、酵母提取粉、NaCl、CaCl2、琼脂粉、葡萄糖、三羟甲基氨基甲烷(Tris)、乙二胺四乙酸二钠盐(EDTA.Na2)、乙酸钾、NaOH(上述试剂各一瓶)
电泳缓冲液(50×TBEBuffer)
称量Tris242g,Na2EDTA.2H2O37.2g于1L烧杯中;向烧杯中加入约800mL去离子水,充分搅拌均匀;加入57.1mL的硼酸,充分溶解;用NaOH调pH至8.3,加去离子水定容至1L后,室温保存。
使用时稀释50倍,即1×TBEBuffer。
1.2供试材料
pUC18、T4连接酶、EcoRI、HindIII
1.3实验原理
首先通过NCBI找到基因Xbc的cDNA序列,并设计引物(注意添加合适的酶切位点)。
本实验选择pUC18的EcoRI和HindIII切点进行克隆。
然后将重组后的DNA转化到大肠杆菌中,再利用蓝白斑和酶切等方法筛选和鉴定阳性克隆。
pUC18质粒图谱
2.试验方法
2.1.目的基因的获得
1.查找基因序列,设计合成PCR引物。
2.在25μL反应体系中,加入:
模板DNA(5ng/μL)1
引物P1P2(10μmol/L)各0.5
2×PCRmix12.5
ddH2O10.5
---------------------------------------------------------------
Total25
在冰上配制,注意混匀后离心。
加入10μL石蜡油覆盖。
3.在PCR仪中预变性94℃4min,然后循环:
94℃30s,55℃30s,72℃60s,30个循环;循环结束后,72℃10min。
扩增的PCR产物4℃保存。
(OC-II)
4.取PCR产物5μL与2μLLoadingBuffer混合,点样。
同时点3μLDNAMaker作为对照。
5.1%琼脂糖胶电泳,220V30-40min。
6.用凝胶成像仪观察、拍照。
琼脂糖凝胶配制方法如下:
A.取称量纸,称取0.2g琼脂糖,倒入锥形瓶;
B.量取20mL电泳缓冲液TBE(可适量多加些缓冲液,防止水分加热蒸发,导致浓度偏高);
C.摇晃锥形瓶,然后置于微波炉中加热。
待琼脂糖完全融化后,取出;
等待锥形瓶中的液体冷却至一定温度后,晃匀(可以在水龙头下边冲边摇晃,以加快冷却速度),倒于整理好的制胶槽中,待完全凝固后使用。
2.2酶切片段的纯化及其回收
使用DNA产物纯化kit进行PCR产物的回收。
具体操作步骤如下。
1、在紫外灯下将PCR琼脂糖凝胶电泳后的目的条带凝胶切割后移至一干净的1.5ml离心管中,称量重量,每0.1rpm加入100μLXP2,充分混匀。
2、55℃水浴5-7min,至胶完全熔化。
3、将混合液全部移入吸附柱,12000rpm离心1min;将滤出液倒出,加入300μLXP2再次过柱,12000rpm离心1min(此步骤可以提高回收效率);倒掉收集管中的液体,将吸附柱放入同一收集管中。
4、向吸附柱中加入700ulSPW,12000rpm离心1min。
倒掉收集管中的液体,将吸附柱放入同一收集管中。
重复步骤4一次
5、将空吸附柱和收集管放入离心机,12500rpm离心3min。
下管扔掉,上管放入1.5ml离心管中,晾干。
(残余的乙醇会严重影响得率和后续试验)
6、在吸附膜中央加入25ul60℃提前预热(进一步提高得率)的ElutionBuffer(加到滤芯上),室温静置1min,12500rpm离心3min。
将所得到的DNA溶液置于-20℃保存或用于后续试验。
注意:
本步骤中,所有转速单位为rpm。
2.3质粒DNA的提取
1.从平板上挑取单克隆,加入含有3mLLB+Amp100的试管中,37℃振荡培养过夜。
2.取培养物倒入1.5mL微量离心管中,4000r/min离心2min。
注:
剩余培养物放置4℃,用于保菌。
3.倒出培养液,使细胞沉淀尽可能干燥。
4.将细菌沉淀悬浮于100μL溶液Ⅰ中,充分振荡混匀,室温放置5min。
5.加200μL溶液Ⅱ(新鲜配制),盖紧管口,颠倒混匀内容物,将离心管放冰上5min。
6.加入150μL溶液Ⅲ(冰上预冷),盖紧管口,颠倒数次使混匀。
冰上放置5min。
7.12000r/min,离心15min,将上清转至另一离心管中。
350μL
8.向上清中加入等体积氯仿/异戊醇(24:
1)(去蛋白),反复混匀,10000r/min,离心10min,将上清转移到另一离心管中。
该步骤可以不做。
9.向上清加入2倍体积乙醇700μL,混匀后,室温放置15-30min。
10000r/min离心10min。
倒去上清液,把离心管倒扣在吸水纸上,吸干液体。
10.用500μL70%乙醇轻轻洗涤质粒DNA沉淀,离心10000r/min离心5min弃上清,干燥。
11.加入适量(20-50μL)的无菌水,室温使DNA完全溶解,-20℃保存。
2.4载体和目的片段的酶切
反应体系1.质粒2
10xMbf2
EcoRⅠ1(10U/μL)
HindⅢ1(10U/μL)
H2O14
---------------------------------------
Total20μL
反应体系2.PCR产物10(50ng/μL)(回收后的PCR产物)
10xMbf2
EcoRⅠ1(10U/μL)
HindⅢ1(10U/μL)
H2O6
----------------------------------------
Total20μL
37℃,2-4hr;65℃,10min,终止反应。
质粒载体酶解液,琼脂糖胶电泳检测。
切胶回收。
PCR产物酶切后不用回收,直接用于连接。
可以电泳检测回收效果。
2.5DNA重组技术(连接)
反应体系3.质粒酶切产物2
PCR酶切产物6
T4ligase1
10×bf1
-------------------------------
Total10μL
2.6大肠杆菌感受态细胞的制备及质粒转化
1.第一天:
从大肠杆菌平板上挑取一个单菌落接于2mLLB液体培养基的试管中,37℃振荡培养过夜。
2.第二天:
取0.5mL菌液转接到一个含有50mLLB液体培养基锥形瓶中,37℃振荡培养。
2-3h,测定OD600≤0.4-0.5,细胞数务必≤108/mL。
(此为实验成功的关键)
3.将菌液转移到50mL离心管中,冰上放置10min。
4.离心10min,4000r/min,4℃,倒出培养液,将管倒置1min以便培养液流尽,回收细胞。
5.用冰冷的0.1mol/LCaCl210mL悬浮沉淀,立即放在冰上30min。
6.4℃6000r/min,离心10min,回收细胞。
7.用冰冷的0.1mol/LCaCl22mL悬浮细胞,务必放在冰上。
此细胞为感受态细胞。
8.分装,每管200μL。
可以加入15%甘油-70度保存。
转化:
9.取200μL新鲜制备的感受态细胞,加入连接产物10μL(~50ng)混匀冰上放置30min。
同时作2个对照管:
对照1:
200μL感受态细胞+10μL无菌水(不含氨苄皿)每班做一个
对照2:
200μL感受态细胞+1μL标准质粒DNA溶液(10ng/μL)每班做1-3个
10.将管放到42℃循环水浴90-120sec。
11.冰浴2min。
(提前准备好)
12.每管加600μLLB液体培养基,37℃培养1h(慢摇)。
13.将适当体积已转化的感受态细胞,涂在含有氨苄青霉素的培养皿中。
(提前倒好平板)
14.倒置平皿37℃培养12-16h,出现菌落。
15.计算阳性对照的转化频率。
16.记录样品的转化子总数。
2.7重组克隆的筛选与鉴定
1.记录样品的转化子总数,白色和蓝色菌落各有多少。
2.记录对照2的菌落数,计算阳性对照的转化频率。
3.挑取一个白色菌落,接于2mL的LB中
4.37℃培养过夜。
5.快速碱裂解法抽提质粒
6.酶切,同时以提取的质粒作对照,取2μL质粒进行双酶切,酶切体系如下:
质粒2
10xMbf2
EcoRⅠ1(10U/μL)
HindⅢ1(10U/μL)
H2O14
---------------------------------------
Total20μL
37度,2-4hr。
0.8-1%琼脂糖电泳检测。
`
3.试验结果
3.1PCR产物的获得
图1目的基因产物
目的基因扩增结果如图1所示:
其中,左边第1条泳带为marker带,其他各带均为出现结果,符合预期。
3.2酶切载体的获得
图2酶切载体片段
3.3连接PCR产物与载体的检测
图3DNA重组得检测
3.4连接载体的酶切验证
图4酶切验证图
4.讨论与分析
PCR反应体系中,参与反应的物质有五种,引物、酶、dNTPs、模板和缓冲液(其中需要Mg2+),经过三个步骤,DNA变性,退火,延伸,多次循环得到扩增片段。
在整个反应中,关键步骤包括模板核酸的制备、引物的质量与特异性、酶的质量、PCR循环条件。
对于模板:
若模板中含有杂蛋白质、Taq酶抑制剂;在提取制备模板时丢失过多,或吸入酚;模板核酸变性不彻底。
PCR扩增条带都不会出现。
对于酶:
若所加的酶失活,或忘记加Taq酶、溴化乙锭,都会导致没有条带出现。
对于引物:
引物质量、引物的浓度、两条引物的浓度是否对称,是PCR失败或扩增条带不理想、容易弥散的常见原因。
对于dNTPs:
呈颗粒状,如保存不当易变性失去生物学活性,影响条带出现。
对于缓冲液:
由于量少若没混匀也会导致PCR条带扩增不出现,Mg2+离子浓度对PCR扩增效率影响很大,浓度过高可降低PCR扩增的特异性,浓度过低则影响PCR扩增产量甚至使PCR扩增失败而不出扩增条带。
在载体和目的基因片段的酶切体系中,通常所指的DNA限制性核酸内切酶就是Ⅱ型酶,其中常见的问题很多:
DNA完全没有被限制性内切酶切割,①限制性内切酶失活,②DNA不纯,含有SDS、有机溶剂、EDTA等,③非限制性内切酶最佳反应条件,④酶切位点被修饰,⑤DNA上不存在该酶的识别顺序;DNA切割不完全,①限制性内切酶活性下降或稀释不正确,②DNA不纯或反应条件不佳,③酶切位点被修饰,④部分DNA溶液粘在管壁上,⑤酶切后DNA粘末端退火;DNA片段数目多于理论值,①限制性内切酶星号活力,②存在第二种限制性内切酶污染,③样品DNA中含有其它DNA。
这些都会影响酶切的效果,以及试验的成败。
大肠杆菌感受态细胞的制备及质粒转化体系中,为提高转化效率,应考虑:
细胞生长状态和密度;不要用经过多次转接或储于4℃的培养菌,最好从-70℃或-20℃甘油保存的菌种中直接转接用于制备感受态细胞的菌液,细胞密度在5×107个/ml左右(不同的菌株情况有所不同),这时比较合适。
密度过高或不足均会影响转化效率;质粒的质量和浓度,转化效率与外源DNA的浓度在一定范围内成正比,但当加入的外源DNA的量过多或体积过大时,转化效率就会降低,一般情况下,DNA溶液的体积不应超过感受态细胞体积的5%;试剂的质量,所用的试剂,用超纯水配制,最好分装保存于干燥的冷暗处;防止杂菌和杂DNA的污染,整个操作过程均应在无菌条件下进行,所用器皿,如离心管,Tip头等最好是新的,并经高压灭菌处理,所有的试剂都要灭菌,且注意防止被其它试剂、DNA酶或杂DNA所污染,否则均会影响转化效率或杂DNA的转入。
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