分子生物学研究法上DNARNA及蛋白质操作技术分子生物.docx
- 文档编号:4314141
- 上传时间:2022-11-29
- 格式:DOCX
- 页数:20
- 大小:47.25KB
分子生物学研究法上DNARNA及蛋白质操作技术分子生物.docx
《分子生物学研究法上DNARNA及蛋白质操作技术分子生物.docx》由会员分享,可在线阅读,更多相关《分子生物学研究法上DNARNA及蛋白质操作技术分子生物.docx(20页珍藏版)》请在冰豆网上搜索。
分子生物学研究法上DNARNA及蛋白质操作技术分子生物
第五章分子生物学研究法
(上)DNA、RNA及蛋白质操作技术
分子生物学研究之所以从20世纪中叶开始得到高速发展,其中最主要的原因之一是现代分子生物学研究方法、特别是基因操作和基因工程技术的进步。
基因操作主要包括DNA分子的切割与连接、核酸分子杂交、凝胶电泳、细胞转化、核酸序列分析以及基因的人工合成、定点突变和PCR扩增等,是分子生物学研究的核心技术。
基因工程是指在体外将核酸分子插入病毒、质粒或其它载体分子,构成遗传物质的新组合,使之进入新的宿主细胞内并获得持续稳定增殖能力和表达。
因此,基因工程技术其实是核酸操作技术的一部分,只不过我们在这里强调了外源核酸分子在另一种不同的寄主细胞中的繁衍与性状表达。
事实上,这种跨越天然物种屏障、把来自任何生物的基因置于毫无亲缘关系的新的寄主生物细胞之中的能力,是基因工程技术区别于其它技术的根本特征。
本章将在回顾重组DNA技术发展史的基础上,讨论DNA操作技术、基因克隆、表达分析技术及蛋白质组学、单核苷酸多态性分析等现代生物学领域里最广泛应用的实验技术和方法。
5.1重组DNA技术史话
近半个多世纪来,分子生物学研究取得了前所未有的进步,概括地说,主要有三大成就:
第一,在20世纪40年代确定了遗传信息的携带者、即基因的分子载体是DNA而不是蛋白质,解决了遗传的物质基础问题;第二,50年代提出了DNA分子的双螺旋结构模型和半保留复制机制,解决了基因的自我复制和世代交替问题;第三,50年代末至60年代,相继提出了“中心法则”和操纵子学说,成功地破译了遗传密码,阐明了遗传信息的流动与表达机制。
但是,由于缺乏有效的分离和富集单一DNA分子的技术,科学家无法对这类物质进行直接的生化分析。
事实上,DNA分子体外切割与连接技术及核苷酸序列分析技术的进步直接推动了重组DNA技术的产生与发展。
因为重组DNA的核心是用限制性核酸内切酶(Restrictionendonuclease,RE)和DNA连接酶对DNA分子进行体外切割与连接,所以,科学家认为,这些工具酶的发现和应用是现代生物工程技术史上最重要的事件(表5-1)。
限制性核酸内切酶能够识别DNA上的特定碱基序列并从这个位点切开DNA分子。
1972年,Boyer实验室发现有一种核酸内切酶EcoRI能特异性识别GAATTC序列,将双链DNA分子在这个位点切开并产生具有粘性末端的小片段。
他们还发现,能够把EcoRI酶切产生的任何不同来源的DNA片段通过粘性末端之间的碱基互补作用而彼此“粘合”起来。
此后,大量类似于EcoRI但具有独特识别序列的核酸内切酶被陆续发现(图5-1)。
到目前为止,科学家已经几乎能随心所欲地把任何DNA分子切割成一系列不连续的片段,再利用凝胶电泳技术将这些片段按照分子量大小逐一分开,供下一步研究。
表5-1重组DNA技术史上的主要事件
年份
事件
1869
F.Miescher首次从莱茵河鲑鱼精子中分离DNA。
1957
A.Kornberg从大肠杆菌中发现了DNA聚合酶I。
1959-1960
Uchoa发现RNA聚合酶和信使RNA,并证明mRNA决定了蛋白质分子中的氨基酸序列。
1961
Nirenberg破译了第一个遗传密码;Jacob和Monod提出了调节基因表达的操纵子模型。
1964
Yanofsky和Brenner等人证明,多肽链上的氨基酸序列与该基因中的核苷酸序列存在着共线性关系。
1965
Holley完成了酵母丙氨酸tRNA的全序列测定;科学家证明细菌的抗药性通常由“质粒”DNA所决定。
1966
Nirenberg,Uchoa,Khorana,Crick等人破译了全部遗传密码。
1967
第一次发现DNA连接酶
1970
Smith,Wilcox和Kelley分离了第一种限制性核酸内切酶,Temin和Baltimore从RNA肿瘤病毒中发现反转录酶。
1972-1973
Boyer,Berg等人发展了DNA重组技术,于72年获得第一个重组DNA分子,73年完成第一例细菌基因克隆。
1975-1977
Sanger与Maxam和Gilbert等人发明了DNA序列测定技术,1977年完成了全长5387bp的噬菌体φ174基因组测定。
1978
首次在大肠杆菌中生产由人工合成基因表达的人脑激素和人胰岛素。
1980
美国联邦最高法院裁定微生物基因工程可以被专利化。
1981
Palmiter和Brinster获得转基因小鼠,Spradling和Rubin得到转基因果蝇。
1982
美、英批准使用第一例基因工程药物——胰岛素,Sanger等人完成了入噬菌体48,502bp全序列测定。
1983
获得第一例转基因植物。
1984
斯坦福大学获得关于重组DNA的专利。
1986
GMO首次在环境中释放。
1988
Watson出任“人类基因组计划”首席科学家。
1989
DuPont公司获得转肿瘤基因小鼠—“Oncomouse”。
1992
欧共体35个实验室联合完成酵母第三染色体全序列测定(315kb)。
1994
第一批基因工程西红柿在美国上市。
1996
完成了酵母基因组(1.25×107bp)全序列测定。
1997
英国爱丁堡罗斯林研究所获得克隆羊。
2000
完成第一个高等植物拟南芥的全序列测定(1.2×108bp)。
2001
完成第一个人类基因组全序列测定(2.7×109bp)。
1967年,世界上有5个实验室几乎同时报道了通过合成相邻核苷酸之间的磷酸二酯键,从而修复缺口或催化粘合完全分离的两个DNA片段的DNA连接酶(图5-2)。
当然,仅仅能在体外利用限制性核酸内切酶和DNA连接酶进行DNA的切割和重组,还远远不能满足基因工程的要求,因为大多数DNA片段不具备自我复制的能力,只有将它们连接到具备自主复制能力的DNA分子上,才能在寄主细胞中进行繁殖。
这种具备自主复制能力的DNA分子就是所谓分子克隆的载体(vector),病毒、噬菌体和质粒等小分子量复制子都可以作为基因导入的载体。
分子克隆的第一代载体是pSC101质粒载体,全长9.09kb,带有四环素抗性基因(tetr)及EcoRI、HindIII、BamHI、SalI、XhoI、PvuII以及SmaI等7种限制性核酸内切酶的单酶切位点,在HindIII、BamHI和SalI等3个位点插入外源基因,会导致tetr失活(图5-3a)。
该载体是一种严紧型复制控制的低拷贝质粒,平均每个寄主细胞仅有1~2个拷贝,因此,从带有该质粒的寄主细胞中很难大量提取pSC101质粒DNA。
ColE1质粒载体则是松弛型复制控制的多拷贝质粒(图5-3b)。
一般情况下,当培养基中氨基酸被耗尽,或是在细胞培养物中加入氯霉素以抑制蛋白质的合成,寄主染色体DNA的复制便被抑制,细胞的生长也随之停止。
而松弛型质粒DNA却继续复制数小时,使每个寄主细胞中ColE1质粒的拷贝数达到1000~3000个,占细胞DNA总量的50%左右。
pBR322质粒载体由三个不同来源的部分组成(图5-3c),第一部分来源于pSF2124质粒易位子Tn3的氨苄青霉素抗性基因(Ampr),第二部分来源于pSC101质粒的四环素抗性基因(tetr),第三部分则来源于ColE1的派生质粒pMB1的DNA复制起点(ori)。
分子量较小(4363bp)且能携带6-8kb的外源DNA片段,操作较为便利。
有两种抗生素抗性基因作为转化子的选择标记,有较高的拷贝数,经过氯霉素扩增,每个细胞可累积1000~3000个拷贝,便于制备重组体DNA。
pUC质粒载体(图5-3d)由四部分组成,包括来自pBR322质粒的复制起点(ori),氨苄青霉素抗性基因(ampr),大肠杆菌β-半乳糖酶基因(lacZ)启动子及编码α-肽链的DNA序列,特称为lacZ’基因。
一旦有外源DNA插入位于lacZ’基因5’-端的多克隆位点(MCS),lacZ’基因功能就被破坏。
LacZ编码β-半乳糖苷酶氨基端146个氨基酸的α-肽,IPTG(异丙基-β-D-硫代半乳糖苷)诱导该基因表达,所合成的β-半乳糖苷酶α-肽与宿主细胞编码的缺陷型β-半乳糖苷酶互补,产生有活性的β-半乳糖苷酶,水解培养基中的X-gal(5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷),生成蓝色的溴氯吲哚。
因此,在含X-gal的培养基中,非转化菌落呈蓝色,含有重组DNA分子的菌落呈白色。
除了有蓝白斑筛选的优势之外,pUC质粒的分子量更小,如pUC8只有2750bp,pUC18只有2686bp,仅带有来自pBR322的氨苄青霉素抗性基因及复制起点,以及与lacZ’相关的序列。
由于缺失rop基因,带有pUC质粒的菌株,不经氯霉素扩增,平均每个细胞即可产500~700个pUC质粒拷贝。
pBluescript是一类从pUC载体派生而来的噬菌粒载体,又分为pBluescriptKS(+/-)或pBluescriptSK(+/-)(图5-4)。
KS或SK分别表示多克隆位点区的取向,表明lacZ基因按照KpnI→SacI或SacI→KpnI的方向转录。
(+/-)表示单链噬菌体f1复制起点的两种相反的取向。
f1(+)起点表示当pBluescript噬菌粒载体和辅助噬菌体共感染寄主细胞时,能够回收到lacZ基因的有意义链DNA。
f1(-)起点则表示当pBluesript噬菌粒载体与辅助噬菌体共感染寄主细胞时,可回收到lacZ基因的无意义链DNA。
在pBluescript的多克隆位点区两侧,有一对T3和T7噬菌体的启动子,用以定向指导插入在多克隆位点上的外源基因的转录。
同时具有单链噬菌体f1的复制起点和一个来自ColE1质粒的复制起点,保证该载体在有无辅助噬菌体共感染时,按照不同的复制形式分别合成出单链或双链DNA。
带有氨苄青霉素抗性基因,作为转化子克隆的选择标记;带有lacZ基因,可以按照X-gal-IPTG组织化学显色法筛选带有噬菌粒载体的重组子。
获得了用外源DNA片段和载体分子重组而成的杂种DNA分子后,还必须通过一个被称为细菌转化的过程将其重新导入到寄主细胞中,才能保证重组DNA分子的增殖(图5-5)。
1970年,科学家发现,大肠杆菌细胞经适量氯化钙处理后,能有效地吸收λ噬菌体DNA。
1972年,又有人报道,经氯化钙处理的大肠杆菌细胞能够有效地摄取质粒DNA。
从此,大肠杆菌就成了分子克隆中最常用的转化受体。
同年,美国斯坦福大学的Berg等人在体外用限制性核酸内切酶EcoRI分别消化猿猴病毒SV40和λ噬菌体DNA,再用T4DNA连接酶将两种不同的消化片段连接起来,首次获得了同时含有SV40和λ噬菌体DNA的重组DNA。
1973年,Cohen实验室成功地将分别经限制性核酸内切酶处理的编码卡那霉素抗性基因的大肠杆菌质粒R6-5DNA与编码四环素抗性基因的另一种大肠杆菌质粒pSC101DNA混合后加入T4DNA连接酶,得到的重组杂种DNA分子能同时降解卡那霉素和四环素,从而获得了具有双重抗性特征的质粒DNA。
由来自大肠杆菌的质粒DNA形成的重组DNA分子可以在原来的寄主细胞中增殖,这似乎还比较容易理解。
那么,不同物种的外源DNA片段是否也可以在大肠杆菌细胞中增殖呢?
为了回答这个问题,Cohen和Boyer等人合作,把非洲爪蟾核糖体蛋白基因片段与pSC101质粒DNA片段重组后导入大肠杆菌,证明动物基因也能进入大肠杆菌细胞并转录出相应的mRNA分子。
上述实验表明:
(1)像pSC101这样的质粒DNA分子可以作为基因克隆的载体,从而把外源DNA导入寄主细胞;
(2)像非洲爪蟾这样的高等生物的基因也可以被成功地转移到原核细胞中并实现其功能表达;
(3)质粒DNA-大肠杆菌细胞作为一种成功的基因克隆体系,有可能在重组DNA或基因工程研究中发挥重要作用。
5.2DNA操作技术
5.2.1核酸凝胶电泳
自从琼脂糖(agarose)和聚丙烯酰胺(polyacrylamide)凝胶被引入核酸研究以来,按分子量大小分离DNA的凝胶电泳技术,已经成为一种分析鉴定重组DNA分子及蛋白质与核酸相互作用的重要实验手段,也是大量现行分子生物学研究方法,如DNA分型、DNA核苷酸序列分析、限制性内切酶片段分析以及限制性酶切作图等的技术基础。
实验中,若将一种分子放置到电场中,它就会以一定的速度移向适当的电极,我们把这种电泳分子在电场作用下的迁移速度,叫做电泳的迁移率,它与电场强度和电泳分子本身所携带的净电荷数成正比。
就是说,电场强度越大,电泳分子所携带的净电荷数量越多,其迁移的速度越快,反之则变慢。
由于在电泳中往往使用无反应活性的稳定的支持介质,如琼脂糖凝胶和聚丙烯酰胺凝胶等,故电泳的迁移率与分子的摩擦系数成反比。
已知摩擦系数是分子大小、极性及介质粘度的函数,因此,根据分子大小的不同、构型或形状的差异以及所带的净电荷的多寡,便可以通过电泳将蛋白质或核酸分子混合物中的各种成分彼此分离开来。
在生理条件下,核酸分子之糖-磷酸骨架中的磷酸基团,是呈离子化状态的,所以,DNA和RNA多核苷酸链又被称为多聚阴离子(polyanions),把这些核酸分子放置在电场当中,它们就会向正电极的方向迁移。
由于糖-磷酸骨架在结构上的重复性质,相同数量的双链DNA几乎具有等量的净电荷,因此它们能以同样的速度向正电极方向迁移。
在一定的电场强度下,DNA分子的这种迁移速度,亦即电泳的迁移率,取决于核酸分子本身的大小和构型。
这就是应用凝胶电泳技术分离DNA片段的基本原理。
琼脂糖是一种线性多糖聚合物,从红色海藻产物琼脂中提取而来。
将琼脂糖粉末加热到熔点后冷却凝固便会形成良好的电泳介质,其密度由琼脂糖的浓度决定。
经过化学修饰的低熔点琼脂糖,在结构上比较脆弱,因此,在较低的温度下便会熔化,常用于DNA片段的制备电泳。
凝胶的分辨能力同凝胶的类型和浓度有关(表5-2)。
琼脂糖凝胶分辨DNA片段的范围为0.2~50kb之间;而要分辨较小分子量的DNA片段,则要用聚丙烯酰胺凝胶,其分辨范围为1个碱基对到1000个碱基对之间。
凝胶浓度的高低影响凝胶介质孔隙的大小,浓度越高,孔隙越小,其分辨能力就越强。
反之,浓度降低,孔隙就增大,其分辨能力也就随之减弱。
例如,20%的聚丙烯酰胺凝胶可分离1~6bp的DNA小片段,而若要分离1000bp的DNA片段,就要用3%的聚丙烯酰胺凝胶。
再如,2%的琼脂糖凝胶可分离300bp的双链DNA分子,而分离大片段DNA就要用低浓度(0.3%~1.0%)的琼脂糖凝胶。
表5-2琼脂糖及聚丙烯酰胺凝胶分辨DNA片段的能力
凝胶类型及浓度
分离DNA片段的大小范围(碱基对)
0.3%琼脂糖
50000~1000
0.7%琼脂糖
20000~1000
1.4%琼脂糖
6000~300
4.0%聚丙烯酰胺
1000~100
10.0%聚丙烯酰胺
500~25
20.0%聚丙烯酰胺
50~1
在凝胶电泳中,加入适量溴乙锭(ethidiumbromide,简称EB)染料对核酸分子进行染色,然后将凝胶放置在紫外光下观察,可十分灵敏而快捷地检测出凝胶介质中DNA的谱带部位,即使每条DNA带中仅含有0.05μg的微量DNA,也可以被清晰地检测出来。
溴化乙锭是一种具扁平分子的核酸染料,能插入到DNA或RNA分子的相邻碱基之间,并在300nm波长的紫外光照射下发出荧光。
把含有DNA分子的凝胶浸泡在溴化乙锭的溶液中,或是将溴化乙锭直接加到DNA的凝胶介质中,此种染料便会在一切可能的部位与DNA分子结合,然而却不能与琼脂糖凝胶或聚丙烯酰胺凝胶相结合,因此,只有DNA分子能吸收溴化乙锭并发出荧光。
在适当的染色条件下,荧光强度与DNA片段的大小(或数量)成正比。
实验表明,用普通琼脂糖凝胶电泳,很难分离大于50kb的DNA分子,为了进行超大片段DNA研究,科学家发明了脉冲电场凝胶电泳(pulsed-fieldgelelectrophoresis,简称PFGE)技术,用于分离超大分子量(有时甚至是整条染色体)DNA。
在脉冲电场中,DNA分子的迁移方向随着电场方向的周期性变化而不断改变。
在标准的PFGE中,第一个脉冲的电场方向与核酸移动方向成45°夹角,而第二个脉冲的电场方向与核酸移动方向在另一侧成45°夹角(图5-6)。
由于琼脂糖凝胶的电场方向、电流大小及作用时间都在交替变换,使得DNA分子能够随时调整其运动方向以适应凝胶孔隙的无规则变化。
与分子量较小的DNA相比,分子量较大的DNA需要更多的脉冲次数来更换其构型和方位,使其按新的方向游动。
应用脉冲电场凝胶电泳技术,可成功地分离到分子量高达107bp的DNA大分子。
5.2.2细菌转化
细菌转化(transformation),是指一种细菌菌株由于捕获了来自供体菌株的DNA而导致性状特征发生遗传改变的过程。
提供转化DNA的菌株叫作供体菌株,接受转化DNA的细菌菌株则被称为受体菌株。
在基因克隆的过程中,我们通常要通过细菌转化将体外构建好的杂种DNA分子导入宿主细胞中。
进入宿主细胞的外源DNA通过自身载体上的复制起始点进行复制增殖,使其能够在宿主细胞中保持下来,并且还能够很容易地以完整的形式从细胞中被分离纯化出来。
绝大多数细菌,包括大肠杆菌(E.coli),正常条件下仅能获取极少量的DNA。
为了高效转化这些细菌,必须对受体细菌进行一些物理或化学处理,以增加它们获取DNA的能力。
经历了这种处理的细胞被称作感受态细胞(competentcells)。
细菌转化常用的方法有CaCl2法和电击法。
CaCl2法是制备大肠杆菌感受态最常用的化学方法。
将快速生长的大肠杆菌置于经低温(0℃)预处理的低渗CaCl2溶液中,便会造成细胞膨胀,细胞膜通透性发生变化,极易与外源DNA相粘附并在细胞表面形成复合物。
此时,将该体系转移到42℃下做短暂的热刺激,外源DNA就可能被细胞吸收。
进入细胞的外源DNA分子通过复制、表达,实现遗传信息的转移,使受体细胞出现新的遗传性状。
将经过转化后的细胞在选择性培养基上培养,筛选出带有外源DNA分子的阳性克隆。
这一方法可以用于批量制备感受态细胞,其转化效率可达到5×106~2×107个转化子/µg超螺旋质粒DNA(图5-7)。
电击法是细菌转化的另一种高效方法。
锐利的电脉冲可以在细胞膜上造成小凹陷,并由此形成纳米级疏水孔洞。
随着跨膜电压增加,一些较大的疏水性孔洞会转变为亲水性孔洞。
在孔洞开放的时候,介质中的DNA很容易通过孔洞进入细胞质。
将生长至对数中期的E.coli菌液冷却至4℃后离心,用相同温度的纯水洗涤,用10%的甘油悬浮后将高密度菌液(~2×1010/ml)置于特制的电极杯中进行电击。
获得最大转化效率时场强一般为12.5~15kV/cm,时间跨度一般为4.5~5.5毫秒。
电击转化与温度有关,最好在0~4℃进行。
实验室常用带有不同抗生素(包括氨苄青霉素、卡那霉素和四环素等)的选择性培养基结合α-互补蓝白斑筛选法鉴定转化细胞。
感受态细胞转化频率的计算方法为:
转化体总数=菌落数×(转化反应原液总体积/涂板菌液体积)
插入频率=白色菌落数/白色菌落数+蓝色菌落数
转化频率(每µgDNA转化菌落数)=转化体总数/加入质粒DNA总量(µg)。
利用噬菌体颗粒能够有效地将DNA注入到寄主细胞中这一特点,科学家又发明了重组体DNA分子的体外包装法(图5-8)。
经包装的基因工程噬菌体颗粒能够借助细菌表面的噬菌体接受器位点将DNA注入受体细菌,并在这些细胞中得到繁殖和表达。
5.2.3聚合酶链式反应(PCR)技术
聚合酶链式反应技术可能是体外快速扩增特定基因或DNA序列最常用的方法。
二十世纪80年代,凯利•穆利斯(KaryMullis)发明了该技术。
当时,他供职于美国的西特斯公司——世界上第一间靠重组DNA技术起家的生物技术公司。
PCR反应的起始材料,模板DNA,可以是基因组DNA上的某个基因或基因片段(genomicPCR),也可以是mRNA反转录产生的cDNA链(RT-PCR)。
PCR技术的原理并不复杂。
首先将双链DNA分子在临近沸点的温度下加热分离成两条单链DNA分子,DNA聚合酶以单链DNA为模板并利用反应混合物中的四种脱氧核苷三磷酸合成新生的DNA互补链(图5-9)。
DNA聚合酶是一种天然产生的能催化DNA(包括RNA)的合成和修复的生物大分子。
所有生物体基因组的准确复制都依赖于这类酶的活性。
PCR反应中使用的DNA聚合酶不同于一般的聚合酶,它具有很好的耐高温性。
DNA聚合酶开始DNA合成时都需要有一小段双链DNA来启动(“引导”)新链的合成,所以,新合成的DNA链的起点,事实上是由加入到反应混合物中的一对寡核苷酸引物在模板DNA链两端的退火位点决定的。
PCR反应时,只要在试管内加入模板DNA、PCR引物、四种核苷酸及适当浓度的Mg2+离子,DNA聚合酶就能在数小时内将目标序列扩增100万倍以上。
双链模板DNA分子首先在高温下解开成长链单链,短链引物分子立即与该模板DNA的特定序列相结合,产生双链区,DNA聚合酶从引物处开始复制合成其互补链,迅速产生与目标序列完全相同的复制品。
在后续反应中,无论是起始模板DNA还是经复制的杂合DNA双链,都会在高温下解开成单链,体系中的引物分子再次与其互补序列相结合,聚合酶也再度复制模板DNA。
由于在PCR反应中所选用的一对引物,是按照与扩增区段两端序列彼此互补的原则设计的,因此,每一条新生链的合成都从引物的退火结合位点开始并朝相反方向延伸,每一条新合成的DNA链上都具有新的引物结合位点。
整个PCR反应的过程,即DNA解链(变性)、引物与模板DNA相结合(退火)、DNA合成(链的延伸)三步,可以被不断重复。
经多次循环之后,反应混合物中所含有的双链DNA分子数,即两条引物结合位点之间的DNA区段的拷贝数,理论上的最高值应是2n(图5-10),能满足进一步遗传分析的需要。
5.2.4实时定量PCR(realtimequantitativePCR)
由于PCR技术具有极高的敏感性,扩增产物总量的变异系数常常达到10-30%。
因此,人们普遍认为应用简单方法对PCR扩增的产物进行最终定量是不可靠的。
随着技术的进步,上个世纪九十年代末期出现了实时定量PCR技术,利用带荧光检测的PCR仪对整个PCR过程中扩增DNA的累积速率绘制动态变化图,从而消除了在测定终端产物丰度时有较大变异系数的问题。
实时定量PCR反应在带透明盖的塑料小管中进行,激发光可以直接透过管盖,激发荧光探针。
荧光探针事先混合在PCR反应液中,只有与DNA结合后,才能够被激发出荧光。
随着新合成目的DNA片段的增加,结合到DNA上的荧光探针增加,被激发产生的荧光也相应增加。
最简单的DNA结合的荧光探针是非序列特异性的,例如荧光染料SYBRGreenI,激发光波长520nm,这种荧光染料只能与双链DNA结合(图5-11)。
利用SYBRGreenI可以检测PCR反应中获得的全部双链DNA,但是不能区分不同的双链DNA。
为了进一步确保荧光检测的就是靶DNA序列,人们又设计了仅能与目的DNA序列特异结合的荧光探针,如TaqMan探针。
TaqMan探针是一小段被设计成可以与靶DNA序列中间部位结合的单链DNA(一般为50bp-150bp),并且该单链DNA的5’和3’端带有短波长和长波长两个不同荧光基团。
这两个荧光基团由于距离过近,在荧光共振能量转移(FRET)作用下发生了荧光淬灭,因而检测不到荧光。
PCR反应开始后,随着双链DNA变性产生单链DNA,TaqMan探针结合到与之配对的靶DNA序列上,并被具有外切酶活性的TaqDNA聚合酶逐个切除而降解,从而解除荧光淬灭的束缚,荧光基团在激发光下发
- 配套讲稿:
如PPT文件的首页显示word图标,表示该PPT已包含配套word讲稿。双击word图标可打开word文档。
- 特殊限制:
部分文档作品中含有的国旗、国徽等图片,仅作为作品整体效果示例展示,禁止商用。设计者仅对作品中独创性部分享有著作权。
- 关 键 词:
- 分子生物学 研究 DNARNA 蛋白质 操作 技术 分子 生物