gfp基因的克隆与表达.docx
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gfp基因的克隆与表达
基因工程实验设计
题目:
绿色荧光蛋白基因(gfp)的克隆及表达
专业:
生工1001姓名:
刘会淼
2013年3月13
实验目的:
研究绿色荧光蛋白(GreedFluorescentProtein,GFP)基因的基因克隆及在大肠杆菌中的表达。
实验方法;通过分别将DH-5α(pEGFP-N3)和DH-5α(pET-28a)提取质粒、酶切并连接形成重组质粒pET-28a-GFP,将重组质粒导入E.coliDH-5α感受态细胞中进行转化,通过限制性核酸内切酶NotI与BamH1和PCR对所建质粒进行分析鉴定后,通过转化的方法把含绿色荧光蛋白(GFP)外源基因转入大肠杆菌体BL-21内进行表达,再用IPTG诱导GFP基因表达,如果可以看到显现绿色,判断GFP基因在大肠杆菌中成功表达。
1.材料与方法:
1.1.1实验材料
克隆菌E.coliDH-5a、表达菌BL-21为本实验室收藏菌种,质粒pET-28a和pEGFP-N3,引物,限制性内切酶BamH1、NotⅠ
1.1.2仪器设备
Eppendof离心机、电泳仪、电子天平、台式离心机、控温磁力搅拌器、调温电热套pH计、冰箱、台式冷冻恒温振荡器、紫外灯、生物洁净工作台、电热恒温水温箱、琼脂糖凝胶电泳电泳装置、凝胶成像分析系统、酒精灯、培养皿、、移液枪、枪头、接种环、酒精棉球、灭菌枪头、平板封口膜、离心管
1.1.3试剂及溶液
分装后于121℃高压灭菌20min。
(LB固体培养基是在液体LB中加琼脂粉至1%);
溶液Ⅰ50mL
葡萄糖
50mmol/L
Tris-Cl(pH8.0)
25mmol/L
EDTA(pH8.0)
10mmol/L
121℃高压灭菌15min后置于0~4℃贮存;
溶液Ⅱ100mL
NaOH
0.2mol/L
SDS
1%(W/V)
用时由母液2mol/LNaOH、10%(W/V)SDS稀释现配;
溶液Ⅲ100mL
KOAc(5mol/L)
60mL
冰乙酸
11.5mL
H2O
28.5mL
121℃高压灭菌15min后置于0~4℃贮存;
氯仿;琼脂糖;灭菌的去离子水;10×酶切缓冲液;TaqDNA聚合酶;TaqDNA聚合酶缓冲。
灭菌的0.1mol/LCaCl2,标准相对分子质量的DNA;溴乙锭(EB)储存液0.5µg/mL;LB/Kan(50µg/mL)固体培养基;IPTG配成浓度为400mM水溶液,-20℃保存备用;卡那霉素(Kan)配成浓度为100ug/mL水溶液,-20℃保存备用;70%乙醇:
用新开装的乙醇和灭菌无离子水配成,放在0~4℃;无水乙醇:
放在0~4℃;RNase母液:
将RNase溶于10mmol/LTris·Cl(pH7.5)、15mmol/LNaCl配成的试剂中,配成10mg/mL的溶液,在100℃加热15min,使可能溶有的DNase失活,然后缓慢冷却至室温,分装成小份保存于-20℃;
1.2方法:
1.2.1大肠杆菌DH-5α(pEGFP-N3)染色体DNA的提取
1.2.2、实验目的:
掌握酚氯仿法提取DNA的原理和操作。
1.2.3,器材:
⑴,微量移液器、高速离心机、1.5mlEP管、吸头、烘箱、水浴锅、1.5ml管架、胶头滴管、冰箱
⑵,消化缓冲液:
CTAB/NaCl溶液:
4.1g NaCl溶解于80ml H2 O,缓慢加入10g CTAB,加水至100ml;其它试剂:
氯仿:
异戊醇(24:
1),酚:
氯仿:
异戊醇(25:
24:
1),异丙醇,70% 乙醇,TE,10% SDS,蛋白酶 K (20mg/ml或粉剂),5mol/L NaCl。
1.2.4实验原理
生物的大部分或几乎全部DNA都集中在细胞核或类核中。
DNA在体内通常都与蛋白质结合,蛋白质对DNA制品的污染常影响到以后的DNA操作过程,因此需把蛋白质除去,一般采用酚氯仿抽提法。
苯酚、氯仿对蛋白质有极强的变性作用,而对DNA无影响。
经苯酚、氯仿抽提后,蛋白质变性而被离心沉降到酚相与水相的界面,DNA则留在水相,少量的或与DNA紧密结合的蛋白质可用蛋白酶予以去除。
DNA制品中少量的RNA无影响,必要时可加入不含DNase的RNase去除RNA污染。
1.2.5、实验步骤1. 100ml 细菌过夜培养液, 5000rpm离心10分钟, 去上清液。
2. 加9.5ml TE悬浮沉淀, 并加0.5ml 10% SDS, 50μl 20mg/ml(或1mg干粉)蛋白酶 K, 混匀, 37℃保温1小时。
3. 加1.5ml 5mol/L NaCl, 混匀。
4. 加1.5ml CTAB/NaCl溶液, 混匀, 65℃保温20分钟。
5. 用等体积酚:
氯仿:
异戊醇(25:
24:
1)抽提, 5000rpm离心10分钟, 将上清液移至干净离心管。
6. 用等体积氯仿:
异戊醇(24:
1)抽提, 取上清液移至干净管中。
7、加 1/10 体积3mol/L NaAc,及2.5 倍体积预冷(-20℃)无水乙醇,混匀。
-20℃沉淀30min。
12000rpm15min,弃上清
8、加70%乙醇1ml,轻轻混匀,12000rpm15min,弃上清。
9、EP管放置于烘箱中烘干。
10、加30ulTE或ddH2O溶解DNA。
11、琼脂糖凝胶电泳检测
注意,实验室中一般用的1.5ml的EP管,可根据自己需要按比例调节加样量。
DH-5α(pET-28a)的载体质粒也可根据同样方法提取。
1.3.1PCR扩增
1.3.2实验目的
1、学习PCR扩增的基本原理。
2、掌握PCR技术的常规操作。
3、了解PCR扩增的参数设计。
1.3.3实验原理
1、聚合酶链反应(Polymerasechainreaction,PCR):
利用核酸变、复性的性质,以待扩增的DNA为模板,在体外由引物介导的酶促合成特异DNA片段的过程。
2、PCR反应体系
引物、dNTP、Mg2+、模板、TaqDNA聚合酶,Buffer。
3、PCR循环参数
①95℃5min
②95℃30s
③52℃30s
④72℃30s
⑤goto②29times
⑥72℃10min
1.3.4器材
1,微量移液取样器,移液器吸头,0.2mlPCR微量离心管,PCR仪,台式离心机,琼脂糖凝胶电泳系统,紫外凝胶成像系统
2,TaqDNA聚合酶,PCR缓冲液,MgCl2,dNTP,引物,模板,ddH2O,TBE电泳缓冲液,EB,加样缓冲液
3,引物:
1.3.5实验步骤
1、在0.2mlPCR微量离心管中配制30ul反应体系。
ddwater 10.5ul
10×PCRbuffer(不含MgCl2) 3ul
25mMMgCl2 2ul
10mmol/LdNTP 1ul
10μmol/L引物1 1ul
10μmol/L引物2 1ul
模板 1ul
Taq酶 0.5ul
总体积 20ul
2、在离心机中混匀。
3、EP管放入PCR仪中,按照原理中的条件设置程序,进行PCR反应。
4、PCR结束后,取3ulPCR产物进行琼脂糖凝胶电泳检测
1.4凝胶电泳法回收目的DNA及其体外连接
1.4.1、实验目的
1.学习和掌握从琼脂糖凝胶中回收DNA片段的方法。
2.掌握DNA体外连接的方法。
1.4.2,实验原理
1,DNA分子在琼脂糖凝胶中的电泳速率与以下因素有关:
DNA分子大小
DNA分子构象
琼脂糖凝胶浓度
电泳所用电压
电泳缓冲液
2.利用硅胶膜在高盐浓度时能特异性吸附DNA,而在低盐浓度时可使DNA被洗脱的原理纯化DNA。
3.Taq酶参与PCR反应中,产物双链核酸中的3’端各多连接一个脱氧腺苷酸A,与商业开发的pMD18-T载体可在DNA连接酶作用下,按照碱基配对形成环状的完整质粒。
1.4.3,仪器
1,凝胶电泳系统,刀片,紫外仪,酒精灯,1.5mlEP管,1.5mlEP管架,65℃水浴锅
2,PCR产物,1×TBE,加样缓冲液,TakaRa胶回收试剂盒,TA克隆试剂盒,DL2000marker
1.4.4,实验步骤
1,2%琼脂糖凝胶电泳
2,在紫外灯下用干净的手术刀割下含有目的DNA琼脂糖块装在1.5ml的EP管中称量减1克即为凝胶块重量
3,加入5个凝胶体积量的DR-ⅠBuffer
4,混匀65℃加热融化凝胶块
5,加入DR-ⅠBuffer量的1/2体积的DR-ⅡBuffer,当目的片段小于400bp再加入终浓度为20%的异丙醇
6,将上述溶液short后转移至spincoloumn中12000rpm,1min弃滤液
7,加入500ulRinseA12000rpm30s弃滤液
8,加入700ulRinseB12000rpm30s弃滤液
9,同8
10,将spincoloumn安置于新的1.5mlEP管中在spincoloumn膜中央加25ulElutionBuffer放入烘箱1min12000rpm1min保存1.5mlEP管1%胶检测
11,链接反应(冰上操作)
在一支0.2mlEP管中加入以下试剂:
纯化的目的DNA片段4.5ul
Vector0.5ul
连接液5ul
混匀16℃连接过夜
1.5DH-5α和BL-21感受态细胞的制备
1)将0~4℃保存的DH-5α和BL-21菌种分别接种在LB液体培养基中37℃下250r/min过夜培养16h。
2)将分别接种过夜菌:
LB按1:
50的比例接种于2mL的LB液体培养基中,37℃活化培养2~3h至OD=0.3~0.5。
3)取1.5mL菌液转入EP管中,置于冰上10min,然后于4℃下5000r/min离心5min。
弃上清液,沉淀加入0.1mL预冷的0.1mol/LCaCl2缓和悬菌。
冰上放置15-30min后,4℃下5000r/min离心10min。
4)弃上清液,沉淀用0.1mL预冷的0.1mol/LCaCl2(含15%甘油)缓和悬菌,放在-20℃冰箱内保存。
1.6感受态细胞的转化
1)取制备好的感受态细胞100μl,冰上解冻,均匀悬浮。
2)加入2μl酶连产物,轻轻混匀,冰上静置10-30min。
3)42℃水浴中热击70sec后,冰上放置2min。
4)加入200μlLB液体培养基,37℃,50-100rpm振荡培养1h。
5)取200μl悬浮细胞涂布在含合适抗生素的LB固体培养基上,用涂布器均匀涂布,平皿正放静置1-2h后,封口膜封好平皿,37℃培养倒置12-16h。
1.7碱法提质粒
1)用灭菌吸头挑取单菌落,浸没于2mL含有抗生素的LB液体培养基中,37℃,180r/min振荡培养过夜。
2)取1.5ml培养物倒入微量离心管中,用微量离心机于4℃、11000r/min离心1分钟,吸弃上清。
3)向离心管中加入150l用冰预冷的溶液Ⅰ,用微量移液器吹打重悬沉淀。
4)加入200l新配制的溶液Ⅱ,盖紧管口,快速颠倒离心管5次,冰上放置5分钟。
5)加入150l用冰预冷的溶液Ⅲ,轻轻混匀,冰上放置3~5分钟。
6)用微量离心机于4℃、11000r/min离心5分钟,吸取上清转移到另一离心管。
7)加等体积氯仿400l抽提,振荡混匀,用微量离心机于4℃、11000rpm离心2分钟,将上清转移到另一离心管中。
8)吸取上清液300l,向上清中加入2倍体积的无水乙醇,混匀后,于室温放置2分钟;用微量离心机于4℃、11000rpm离心5分钟,弃上清。
9)用70%乙醇洗涤2次,再次4℃、11000rpm离心5分钟,沉淀于空气中干燥。
向已干燥的离心管内加20l超纯水溶解质粒DNA,加入2l10mg/mlRNA酶,37℃处理1小时后于-20℃贮存。
1.8酶切鉴定
1)取提取的质粒8l于另一微量离心管中,加入2lBamHI和NotI的酶切混合液,轻弹管外混匀反应物。
2)离心,使溶液聚集在管底部。
3)37℃,酶切反应。
1.9琼脂糖凝胶电泳
1)称取0.8g琼脂糖,放入到锥形瓶中,加入100mL1×TAE缓冲液,置微波炉或水浴加热至完全融化,冷却至60℃左右。
2)轻缓倒入封好两端和加上梳子的电泳胶板中,静置冷却30分钟以上。
3)将胶板除去封胶带,加电泳缓冲液至电泳槽中,加液量要使液面没过胶面1-1.5毫米,轻轻拔除梳子。
4)吸取10l的质粒与2l的上样液混匀,吸取混合液将加入加样孔。
5)接通电泳槽与电泳仪的电源,设置电泳数据U=100V,I=30mA。
6)当溴酚蓝染料移动到距凝胶前沿1-2cm处,停止电泳。
7)在凝胶成像分析系统中观察结果。
2.0PCR-聚合酶链式反应
1)将PCR管放置在冰盒上,按如下表格加入PCR反应体系各成分
PCR反应体系
各成分的量
模板DNA
0.1l
P1(20mM)
0.2l
P2(20mM)
0.2l
dNTPs(10mM)
0.4l
Taq酶(5U/l)
0.2l
10×PCRbuffer
2l
ddH2O
16.9l
Total
20l
2)将PCR管放入PCR仪中,设定PCR仪的循环参数。
预变性95℃3min,变性95℃30s,退火60-55℃30s,延伸72℃1min10个循环,每个循环降0.5℃。
变性95℃30s,退火55℃30s,延伸72℃1min20个循环,72℃延伸2min。
3)PCR扩增完毕后,取出PCP管放在冰盒上。
4)取8l扩增后产物,进行琼脂糖电泳检测。
2.1pET-28a-GFP重组质粒转化到表达菌BL-21
1)取100μl感受态BL-21,冰上慢速解冻,均匀悬浮。
加入2μl经过酶切鉴定成功提取重组质粒pET-28a-GFP,轻轻混匀,冰上静置10-30min。
2)42℃水浴热激70s,冰上放置2min。
3)加入200μl含抗生素的LB液体培养基,37℃,60r/min震荡培养30min。
四支EP管中加入0.5μl的100mM的IPTG诱导,另外EP管中不加入IPTG诱导。
4)吸取200μl菌液涂布于含抗生素的LB平板上,用涂布器均匀涂布,平皿正放静置1-2h后,封口膜封好平皿,37℃培养倒置12-16h。
2.2重组绿色荧光蛋白(GFP)的诱导表达
1)取GFP重组菌接种于2mlLB培养液(含Kana100mg/l)中,37℃150-220r/min过夜培养。
2)将20μl菌液按1:
50—100接种于2mlLB培养液(含Kana100mg/l)中,37℃200r/min培养2h。
3)按IPTG:
LB培养基按1:
1000加入2μl的IPTG诱导表达,继续培养,对照组不加IPTG诱导。
4)用紫外线照射菌体沉淀,保存照片。
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